标准蛋白质溶液(BSA,5mgml)
Western-blot实验操作步骤
Western-blot实验操作步骤Western blot实验步骤一、制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS 后将细胞培养瓶置于冰上。
2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。
3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。
融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。
二、蛋白浓度测定(BCA法)BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。
在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。
标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul 稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。
蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。
1.配置BCA工作液A液： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本) 样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本2.先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。
（96孔板）,总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。
bsa标准溶液
bsa标准溶液
BSA标准溶液是一种浓度已知的蛋白质溶液，常用于实验室中蛋白质浓度的标定、校准和比较分析。
BSA是指牛血清白蛋白，是一种常见的蛋白质，其分子量为约66,000道尔顿，具有良好的稳定性和可溶性。
制备BSA标准溶液的方法很简单，一般是将已知浓度的BSA 溶解在适当的缓冲液中，经过混合、搅拌、过滤等步骤制成。
使用BSA标准溶液时，可以通过光度计测量其吸光度值，进而计算出蛋白质的浓度。
需要注意的是，不同的标准溶液可能存在差异，因此在实验中应选择适合自己研究对象的BSA标准溶液。
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Westernblot基本操作步骤
W e s t e r n b l o t基本操作步骤一、细胞蛋白的提取弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mMPMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10min。
取上清，用BCA法测定蛋白浓度。
用于westernblot的蛋白样品取一定量加4×loadingbuffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。
离心，使蛋白沉底。
将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。
二、BCA法测蛋白浓度操作步骤将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。
完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为ml。
据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。
BCA工作液室温24小时内稳定。
将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。
加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。
各孔加入100μlBCA工作液，37℃放置30分钟。
测定580nm条件下吸光度。
根据标准曲线计算出蛋白浓度。
三、Westernblot基本操作步骤1、溶液配制：①RunnigBuffer(1×)：SDSRunnigBuffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L；②TransferBuffer(1×):TransferBuffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L；③TBST缓冲液1MTris·HCl（）：60.5gTris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至，加MiliQ水至500ml。
BCA蛋白浓度测定-酶标仪法
BCA法测定蛋白浓度-酶标仪一、药品1.BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012，500次酶标仪，碧云天），含以下成分：a)BCA试剂A（P0012-1，100ml，碧云天），室温保存b)BCA试剂B（P0012-2，3ml，碧云天），室温保存c)蛋白标准（5mg/ml BSA）（P0012-3，1ml，碧云天），-20度保存二、仪器和试剂1.酶标仪（测定波长为540-595nm之间，562nm最佳），水浴锅2.96孔单条可拆酶标板（平底）3.15 ml 离心管1个（准备BCA工作液用）4. 1.5 ml 离心管1个（准备蛋白标准品工作液用）5.单道移液器和枪头，8道移液器（排枪）和枪头6.PBS三、操作步骤1.水浴锅调至37℃。
2.蛋白标准品工作液（1 mg/ml）的配制：将蛋白标准品（5mg/ml）从-20℃冰箱中取出，完全溶解并混匀。
取60μl 蛋白标准品（5mg/ml），加入240μl PBS，即稀释5倍，即配成蛋白标准品工作液（1 mg/ml）。
3.计算BCA工作液总量= 0.2 ml×（样本数+8）×2×1.1（标准品和样本均需测复孔）。
BCA工作量按50体积的BCA试剂A加上1体积的BCA试剂B配制（即50:1），需充分混匀。
BCA 工作液室温24小时内稳定。
4.按下表配制8个蛋白标准液（S0~S7），充分摇匀。
5.将96孔酶标板的A1孔放在左上角，按下表加入蛋白样本和标准品。
（1）先在第3~4条酶标板的蛋白样本孔（N 1~N8）中加入待测蛋白样本各2μl，再用排枪在蛋白样本孔中追加PBS液各18μl，使总量达到20μl。
（此时蛋白样本的稀释比为10，适用于预计蛋白浓度为2~8mg/ml时。
如预计蛋白浓度太高或太低，可适当调整稀释比例）（2）再在第1~2条酶标板的蛋白标准品孔（S0~S7）中加入上面配制的8个蛋白标准液各20μl。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A S0 S0 N1 N1B S1 S1 N2 N2C S2 S2 N3 N3D S3 S3 N4 N4E S4 S4 N5 N5F S5 S5 N6 N6G S6 S6 N7 N7H S7 S7 N8 N86.用排枪在各孔中加入200μl BCA工作液，轻轻摇匀，37℃放置30分钟或室温放置2小时。
BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明书
BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明书产品简介蛋白质定量是蛋白质研究的基础工作之一。
博奥森开发的BCA蛋白质检测试剂(bicinchoninic acid)是理想的蛋白质定量方法;是当前比Lowry法更优越的专用于检测总蛋白质含量的产品。
该方法以快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍受专业人士的青睐。
BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。
在组织细胞裂解实验中，常用浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。
实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。
该产品不受此影响，因此与之配合使用，可免除您实验中的许多烦恼。
基本原理碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
主要特点1.准确灵敏, 线性范围广: BCA试剂的蛋白质测定范围是10－2000ug/ml；2.快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便。
3.经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量。
4.不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。
5.检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马氏亮蓝。
包装及保存BCA试剂A70ml室温保存BCA试剂室温保存蛋白标准-20℃保存(5mg/1ml BSA)本试剂盒自订购之日起一年内有效。
注意事项1.在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37℃温育使溶解, 如发现细菌污染则应丢弃2.样品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵、脂类会影响检测结果，请试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒；高浓度的去垢剂也影响实验结果，可用TCA沉淀去除干扰物质。
3.要得到更为精确的蛋白浓度结果，每个蛋白梯度和样品均需做复孔, 每次均应做标准曲线。
Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用说明
Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用说明货号：PC0010规格：2500T保存：开封使用后请密封保存，本试剂盒自订购之日起九个月内有效。
产品内容：组成包装（2500微孔)保存5×G250染色液100ml2-8℃PBS稀释液30ml2-8℃蛋白标准(5mg/ml BSA)1ml-20℃产品简介：考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（Imax），由465nm变为595nm，在一定的浓度范围内，测定的吸光度值A595与蛋白质浓度成正比。
Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，样品中巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5mM，但受略高浓度的去垢剂影响，需确保SDS的浓度低于0.1%，Triton X-100低于0.1%，Tween20,60,80低于0.06%。
操作说明：一．微孔酶标仪法1.完全溶解蛋白标准品，取10ul，稀释至250ul，使终浓度为0.2mg/ml。
待测蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。
2.5×G250染色液使用前请颠倒3-5次混匀，取1ml5×G250染色液，加入4ml双蒸水，混匀成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。
3.将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20微升分别加到96孔板中，加PBS稀释液补足到20微升。
4.将样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释），加20微升到96孔板的样品孔中。
由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。
5.各孔加入200微升稀释后的1×G250染色液，室温放置3-5分钟。
6.用酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。
蛋白质含量测定方法的研究_2
实验一蛋白质含量测定方法的研究一、研究背景蛋白质是生物的重要组成部分，在人类发现蛋白质后一直没有停下过研究得脚步。
在实验室提取蛋白质的过程中，目标蛋白质的来源是广泛的，而不同的样品中目标蛋白质的含量是不同的，为了得到更多的目标蛋白，就需要了解样品中蛋白质的含量。
在实际的生活中也需要运用蛋白质含量的测定，例如牛奶、奶粉中蛋白质含量。
记得前几年轰动一时三聚氰胺事件，国家的标准蛋白质检测方法被不法分子所利用，通过蛋白质检测方法的缺陷来谋取暴利。
目前常用的蛋白质检测方法有五种：凯式定氮法、Folin-酚法、考马斯亮蓝法、紫外法、双缩脲法。
不同的方法有不同的优缺点。
二、研究目标通过四种不同的蛋白质测定方法了解各种方法的优缺点。
在不同的条件下，能选择正确的测定方法，从而获得正确的数据。
三、研究策略根据资料可以知道四种方法的局限性，针对这一个单一的变量设计五组实验。
一个是标准对照组，其他四组分别在标准组的基础上引入一种变量。
用四种方法分别测定五种溶液。
在对同一种溶液的测定结果中，必有一种方法的结果和其他的结果有显著差异，同时与标准液的结果也有显著的差异。
我们就认为这组溶液中的变量对于该蛋白质测定的方法影响较大。
四、研究方案及可行性分析研究方案：1、配置一组浓度梯度的标准液，分别用四种方法测定，并建立标准曲线。
2、配置五种等浓度的样品蛋白质溶液并编号ABCDE。
在配置过程中，A组加10毫升蒸馏水；B组加10毫升嘌呤溶液；C组加入10毫升EDTA溶液；D组加入10毫升双氧水溶液；E组加入10毫升盐酸溶液。
3、分别用四种方法测定五种蛋白质溶液。
4、分析结果可行性分析：更具已有资料设计了四个单一的变量，分别针对四种实验的缺点，同时保证没有其他的变量。
预期结果：在每组实验的结果中分别有一个数据是在横向和纵向上都有显著差异的。
我们可以确定这个变量对该实验有很大的影响。
五、具体实验设计1.建立标准曲线紫外法a.仪器：紫外分光光度仪、移液管、试管和试管架试剂：标准牛血清蛋白溶液b.280nm下测其光密度值。
bsa标准蛋白溶液的配制
bsa标准蛋白溶液的配制
要配制BSA标准蛋白溶液，您需要以下材料和步骤：
材料：
1. BSA标准蛋白粉末
2. 沉淀纯水（或PBS缓冲液）
步骤：
1. 根据所需浓度，称取适量的BSA标准蛋白粉末。
通常情况下，每毫升溶液中的BSA浓度为1-10mg/mL。
2. 将BSA粉末加入少量沉淀纯水或PBS缓冲液中，并充分悬浮均匀。
3. 慢慢加入剩余的沉淀纯水或PBS缓冲液，搅拌溶解BSA粉末。
可以使用磁力搅拌器或轻轻摇晃容器来帮助溶解。
4. 检查溶液是否充分溶解并无明显的固体颗粒残留。
如果溶解不完全，可以轻轻加热溶液，但注意不要超过热敏蛋白的临界温度。
5. 调整溶液的最终体积，并使用滤膜过滤溶液，以去除任何可能的固体残渣。
6. 将配制好的BSA标准蛋白溶液分装至适当的容器中，并存储在适当的温度和条件下，避免冻结和暴露于有害的光线。
请注意，在配制过程中应严格按照实验需求及相关实验方案中的要求进行操作，并确保实验环境的洁净卫生，以保证最终蛋白溶液的质量和准确性。