食品中病原微生物快速检测方法研究进展

《 食品研究与开发》!""# 年 $ 月第 !% 卷第 ! 期
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食品中病原微生物快速检测方法研究进展
宋宏新 马娜 陕西科技大学生命科学与工程学院 咸阳 )&!"-&
摘 要：食品中病原微生物是影响食品安全性的最主要生物因素。本文综述了食品中病原微生物的快速检测方法研 究 进 展 ，并 对 微 生 物 培 养 法 、免 疫 学 方 法 和 核 酸 分 子 杂 交 等 现 优 检 测 方 法 进 行 了 比 较 和 评 述 。 关 键 词 ：食 品 安 全 ；食 源 性 疾 病 ；病 原 微 生 物 ；检 测 方 法
微 生 物 快 速 检 测 方 法 的 研 究 始 于 H" 年 代 早 期 ，主 要 根 据 各 菌 体 的 理 化 特 性 进 行 分 析 。 而 后 不 断出现改进方法，通 过 加 入 抑 菌 剂 、指 标 剂 或 荧 光 物 质 等 或 借 助 快 速 的 预 处 理 方 法 缩 短 增 菌 时 间 ，合 并检验步骤，使培养 和 鉴 定 一 步 完 成 ，从 而 达 到 快 速检验的目的&H(。常用的方法有疏水网膜法（IJKD）， 它主要对常规平皿画线方法进行了较大改进。可用 于沙门氏菌，大肠杆菌、霉菌；葡 萄 糖 苷 酶 荧 光 法 ， 在培养基中加入指标 剂 、色 素 、荧 光 物 质 等 是 快 速 检验大 肠 菌 类 细 菌 常 用 的 方 法 ：;+*43 沙 门 氏 菌 快 速检测法（;:L)）法，它由含两个试管的 ;+*43 培养 器构成。每个试管的下层为脱水的选择性培养基， 上层为脱水的指示培养基。该比检验低污染的食品 时假阳性率较低，简单易行，便于观察。 !F! 免疫学方法
近年来，食品安全恶性事件不断发生，&’’% 年 日本发生了世界上规模最大的涉及上万人的大肠 杆 菌 (&#)：*) 食 物 中 毒 +&,；!""& 年 德 国 因 国 内 发 生 “疯 牛 病 ”导 致 卫 生 部 部 长 和 农 业 部 部 长 辞 职 ；欧 盟 与北美“疯牛病”的不断出现，使 美 国 、加 拿 大 的 经 济损失重大。在我国，&’-. 年上海爆发的十万多人的 甲 型 肝 炎 流 行 疾 病 ，首 先 是 由 食 源 性 甲 肝 病 毒 引 起 的+!,；今 年 遍 及 整 个 东 南 亚 的 禽 流 感 更 为 各 国 的 食 品安全部门敲响警钟。我国食物中毒报告逐年上 升，每年死亡人数都超过百人+.,。这种食源性危害主 要可分为生物性、物 理 性 和 化 学 性 三 大 类 ，其 中 化 学性危害（如农药、抗生素、杀 菌 剂 等 ）和 物 理 性 危 害 （包 括 玻 璃 、金 属 屑 、小 石 子 等 ），对 人 体 健 康 都 有 其长期的负面影响。但对消费者而言，生物（尤其微 生 物 ）性 危 害 是 最 大 最 直 接 的 危 害 。 它 极 有 可 能 会 导 致 疾 病 的 广 泛 传 播 ，因 此 建 立 和 完 善 适 应 国 际 贸 易的食品安全检测技术和检测体系迫在眉睫。近年 来 许 多 机 构 和 学 者 致 力 于 这 方 面 的 研 究 ，已 改 善 和 开发了一些快速有效的食源性微生物的检测方法。 ! 食源性疾病现状 &/& 食源性疾病
世界卫生组织（0*(）为食源性疾病的定义是： “通 过 摄 取 携 带 传 染 性 病 原 体 或 天 然 毒 素 的 食 物 而 引 起 的 疾 病 。 ”这 些 病 原 体 最 初 存 在 于 环 境 或 其 他 动 物 中 ，一 些 病 原 体 （如 志 贺 菌 类 和 诺 沃 克 病 毒 ）需
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其 中 酶 联 免 疫 吸 附 法 （PQ9:?）由 于 具 有 高 度 特 异性和灵敏性；检测范围在 21 至 ,1 水平，属于超微 量分析技术；结果准确，重现 性 好 ；廉 价 ，方 法 操 作 简单，样品处理量 大 的 优 点 ，故 目 前 广 泛 应 用 于 病 原体（抗原）的检测。三种常用的测定方法有：.F测定 抗 体 的 间 接 法 ；RF 测 定 抗 原 的 双 抗 体 夹 心 法 ；6F 测 定 抗原的竞争法。对病原微生物的检测通常采用的 “夹 心 式 ”设 计 ，通 过 酶 标 显 示 。 如 真 菌 毒 素 检 验 现 在 多 采 用 P-4/. 法 测 定 ， 其 中 )S! 毒 素 和 E;T 的 P-4/. 检测方法列入我国标准方法，标准分别为 JU V )G$MOOSM$WJU V G$M!MF#SM$&M(。 !FO 分子生物学方法
免疫学法在食品检测中应用最广，此技术是以
抗原与抗体的特异性反应为基础，通过病原物刺激 机体产生免疫球蛋白（抗体）建立的。根据检测技术 的不同可分为免疫扩散法、凝集反应、酶联免疫吸附 法和探针检测法。牛津沙门氏菌乳胶凝集检验 （;:L)）法使用了为沙门氏菌菌体抗原和鞭毛抗原 均具特异性的抗体；特异 K465*/65882 法同样使用了 对菌体鞭毛抗原具特异性的抗体，特异性能达到 M%N。还有利用免疫反应的免疫磁球技术，此技术灵 敏度和特异性较强，省去了增菌培养步骤，样品直接 与被覆盖有抗靶微生物抗体的磁珠混合。在检测样 品中单增李斯特菌方面，有人将免疫磁球体技术与 标准培养法进了比较，免疫磁球技术检测到 G""N的 样品中含有李斯特菌，而在同一污染程度上，标准培 养方法仅检测出 O%N的样品含李斯特菌。
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有 关 或 是 其 直 接 致 病 病 原 &’(。 除 以 上 的 病 原 微 生 物 以外，弓形虫（)*+*,-./0. 1*2344）、旋毛虫（)5467428--.）、 囊虫、天然毒素（主要指真菌毒 素 、植 物 毒 素 、动 物 毒素）等也会导致相应疾病的发生，甚至死亡。
要 在 人 体 宿 主 内 完 成 繁 殖 代 谢 ，其 代 谢 过 程 和 代 谢 产 物 （如 毒 素 ）会 引 起 一 系 列 疾 病 。 症 状 为 发 热 ，头 痛，恶心，呕吐，腹痛和腹泻。所以，食源性疾病的;/! 致病病原体
绝大多数食源性疾病是由为数不多的病原生 物所引发的，’"1以上的食源性疾病是由 !"2." 种 微 生 物 所 致 ，包 括 其 代 谢 过 程 、代 谢 产 物 +#,。 病 原 生 物包括细菌、病毒、真菌、立 克 次 氏 体 、寄 生 虫 和 昆 虫 。 目 前 已 发 现 且 已 确 定 的 致 病 病 原 体 中 ，第 一 大 类 细 菌 类 沙 门 氏 菌 （3456789554）、螺 旋 杆 菌 、霍 乱 弧 菌 等 感 染 是 工 业 化 国 家 的 一 个 主 要 问 题 ，其 中 由 沙 门氏菌（非伤寒）等 所 导 致 人 兽 共 患 病 的 发 生 是 发 达和发展中国家都尚未解决且及其关心的公共卫 生问题。最近数十年发生的细菌新疾病不断增加， 造 成 这 些 食 源 性 疾 病 的 新 病 原 体 包 括 弯 曲 菌 ，大 肠 杆菌 (&#):*)（;/ <75=(&#):*)>，单核细胞增殖李斯特菌 （?=@A9B=4 6787CDA7E989@）， 多 抗 药 性 鼠 伤 寒 沙 门 菌 FG&"$，肠炎沙门菌+%,。另一大类病毒的危害也非常大， 例如甲型肝炎病毒（*HI>、轮状病毒 （J7A4K=BL@>、肠 道 病 毒 （;8A9 B7K=BL@>、艾 柯 病 毒 （;CM7 K=BL@）、戊 型 肝炎病毒（*;I）、人柯萨 奇 病 毒 （<7N4@COO=9 K=BL@） 等 。 它 也 是 以 食 品 为 传 播 载 体 并 经 粪 ，口 途 径 传 播 感 染 的 。 其 中 一 些 病 毒 已 在 食 物 或 水 中 检 出 ，且 已 证明某些食源性病毒与急性爆发性或散发性疾病
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标准平皿计数比虽仍是测定食品中活菌的标 准方法，但其培养、筛选、鉴 定 方 法 操 作 繁 琐 ，耗 时 长，且仅能测定活 菌 的 总 数 ，对 一 些 特 定 的 病 原 菌 和污染菌无法有针对性地测定其是否存在及其数 量 ，对 已 杀 菌 或 灭 活 的 食 物 更 是 无 能 为 力 。 分 子 生 物学方法则可针对病原微生物的核酸分子特征进 行鉴定。 !FOFG 核酸分子杂交 是有特异探针（特定标记的 已 知 核 酸 片 段 ）识 别 特 异 碱 基 序 列 （基 因 ）实 现 杂 交 。 它 从 分 子 水 平 上 检 测 病 原 微 生 物 ，不 受 标 本 纯 度 的 影 响 ，可 直 接 检 测 。 不 需 人 工 检 索 而 直 接 鉴 定 出 特 定 的 微 生 物 或 病 原 菌 ，在 一 张 滤 膜 上 进 行 多 个 样 品 的 检 测 ，缩 短 了 大 量 样 品 检 测 的 时 间 。 根 据 探 针的来源不同 6ET? 探针、LT? 探针和寡核苷酸探针，现已应用于各种 病 原 微 生 物 检 测 和 来 源 、 途 径 的 调 查 。 如 Y4.2674