_型鸭肝炎病毒VP1基因的克隆和表达

Ｒａｐｉｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｉｎｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｌｏｏｐ－
Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ
ＷＥＮ Ｈａｉ １，ＱＩＮ Ｈａｉ－ｂｉｎ１，ＺＨＵ Ｑｉａｎ１，ＨＥ Ｘｉｎｇ－ｌｉａｎｇ１，ＬＵ Ｃｈｅｎｇ－ｐｉｎｇ２，ＺＨＡＮＧ Ｈｕｉ－ｄｏｎｇ１
櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙ｍｉｎｅ Ｋ，Ｔｏｍｉｔａ Ｎ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００１，２８９（１）：１５０－１５４． ［１５］ Ｍｏｔｏｋｉ Ｇ，Ｅｉｉｃｈｉ Ｈ，Ａｔｓｕｏ Ｏ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
１．１．２ 引物设计与合成 根据 ＧｅｎＢａｎｋ中发表的 Ⅰ型鸭肝炎病毒核甘酸序列，设计了针对 ＶＰ１基因 片段的引物，在上游引物引入 ＥｃｏＲ Ⅰ 酶切位点，下 游引物中引入 Ｈｉｎｄ Ⅲ 酶 切 位 点，引 物 由 上 海 生 工 生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：
上 游 引 物：５′－ＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＧＡＴ－ ＴＣＣＡＡＴＣＡＧＴＴＡＧＧ－３′；下 游 引 物：５′－ＧＧＴＧＧ－ ＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＣＡＡＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＧＡＧ－３′。 １．２ 方 法 １．２．１ 病毒 ＲＮＡ 的提取 取 经 ＤＨＶ－１ＧＤ 株 强 毒感染的病 死 雏 鸭 的 肝 脏，采 用 ＲＮＡ 提 取 试 剂 盒 进行 ＤＨＶ－１ＧＤ 株总 ＲＮＡ 抽提，操作参照说明书。 １．２．２ ＤＨＶ－１ ＶＰ１ 基 因 的 扩 增 和 测 序 根 据 Ｐｒｏｍｅｇａ 公 司 的 ＲＴ－ＰＣＲ 试 剂 盒 操 作 说 明 设 置 ＲＴ－ＰＣＲ 反应体系，并 按 以 下 程 序 进 行 ＲＴ－ＰＣＲ 反 应：反转录合成（４８ ℃４５ ｍｉｎ）→ 第二链合成 （９４ ℃ ２ｍｉｎ）→３０ 个 循 环 （９４℃ 变 性 ３０ｓ，５４．８℃ 退 火 １ｍｉｎ，６８℃延伸 ２ｍｉｎ）→６８℃ 延 伸 ７ ｍｉｎ→４ ℃ 终
ｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｇｎｉｓｉｎｇ ｖｐ２ｇｅｎｅ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ．Ｗｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｅｓｔｅｍｂｌｉｓｈｅｄ ＬＡＭＰ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＣＰＶ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｆｅｃｅｓ．Ｔｈｅｎ ｗｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｉｔ′ｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｔｈｅ ｖｉｓｕａｌ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｆｉｅｌｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃａｎ ｂｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ａｔ ａ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ６５ ℃ ｗｉｔｈｉｎ １ｈｏｕｒ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｗａｓ １０－２ ＴＣＩＤ５０／ｍＬ ＣＰＶ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＬＡＭＰ
仅严重影响养鸭业 的 发 展，而 且 造 成 的 经 济 损 失 也
相当严重。
ＤＨＶ 编 码 含 ２ ２４９ 个 氨 基 酸 的 一 个 多 聚 蛋 白［６］，经过一 系 列 蛋 白 裂 解，产 生 ３ 种 结 构 蛋 白 （ ＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１）和 ８ 个 非 结 构 蛋 白 （２Ａ１、２Ａ ２、 ２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ）［７－９］。 其 中，ＶＰ１ 含 有 多 个 抗 原 表 位 ，不 仅 能 诱 导 机 体 产 生 免 疫 反 应 ，还 能 诱 导
１ 材 料 与 方 法
１．１ 材 料 １．１．１ 主要试验材料 Ⅰ型鸭肝炎病毒（ＤＨＶ－Ｉ） ＧＤ 株为广 东 省 农 科 院 兽 医 研 究 所 分 离、保 存；Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ、ＢＬ２１（ＤＥ３）购自 Ｎｏｖａｇｅｎ公司；ｐＧＥＭ－ Ｔ ｅａｓｙ、ＲＮＡ 提 取 试 剂 盒、ＲＴ－ＰＣＲ 试 剂 盒 购 自 Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＤＮＡ 胶回收试剂盒购自 Ｏｍｅｇａ公 司；限 制 性 内 切 酶 ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２ ０００购 自 宝 生 物 工 程 （大 连 ）有 限 公 司 ；ｐＭＡＬ－ Ｃ２Ｘ 为美国德克萨斯州 Ａ 和 Ｍ 大学兽医 学 院 朱 冠 博士惠赠。
（１．Ｎａｎｊｉｎｇ Ｐｏｌｉｃｅｄｏｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＭＰＳ，Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ，２１００１２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ＆Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ，２１００９５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｎｅｗｌｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ＧｅｎＢａｎｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｆｏｕｒ ｓｔｒｉｐｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｐｅ－
收 稿 日 期 ：２０１１－１０－２４ 基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 （３０４７１３００）；ＮＳＦＣ－广 东 省 联 合 基 金 项 目 （Ｕ０８３１００４）；广 东 省 国 际 科 技 合 作 专 项 （２０
０８Ａ０５０２０００１５）；广 东 省 自 然 科 学 基 金 项 目 （１０４５１０６００１００６１２６）；广 东 省 农 业 科 学 院 院 长 基 金 项 目 （２０１０１４） 作 者 简 介 ：吕 敏 娜 （１９６７－ ），女 ，广 东 人 ，副 研 究 员 ，硕 士 ，主 要 从 事 预 防 兽 医 学 和 禽 病 学 研 究 。 ＊ 通 讯 作 者
止反应。将 ＰＣＲ 产 物 经 １０ｇ／Ｌ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳， 用 ＤＮＡ 胶回收 试 剂 盒 回 收 纯 化 目 的 片 段，并 将 其 与 克 隆 载 体 ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ 连 接 后，转 化 Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α 感 受 态 细 菌，转 化 产 物 铺 于 ＳＯＢ 平 板 （含 １００μｇ／ｍＬ氨苄青霉素）于 ３７℃ 过 夜 培 养。 用 蓝 白 斑筛选方法挑取白色菌落用 ＬＢ 培养基（含 １００μｇ／ ｍＬ 氨苄青霉素，以下同）培养后，用菌液 ＰＣＲ 法 和 限制性酶切法对转 化 克 隆 进 行 鉴 定，阳 性 克 隆 命 名
摘 要：通过 ＲＴ－ＰＣＲ 方法克隆出 ＧＤ 株Ⅰ型鸭肝炎病毒（ＤＨＶ－１）的结构蛋白 ＶＰ１ 基因片段，ＶＰ１ 基 因 片段和原核表达载体ｐＭＡＬ－Ｃ２Ｘ 均以ＥｃｏＲⅠ 、ＨｉｎｄⅢ双酶切后构建获得重组质粒ｐＭＡＬ－Ｃ２Ｘ－ＶＰ１，经 限制性酶切和序列测序证明，目的基因正确插入表达载体，转入 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３），构建重组表达菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１／ｐＭＡＬ－Ｃ２Ｘ－ＶＰ１，经ＩＰＴＧ 诱 导，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 检 测 结 果 表 明，ＤＨＶ－１ 的 结 构 蛋 白 ＶＰ１ 能 在 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达，获得可溶性重组蛋白，表达产物的分子质量约为６９ｋｕ 。 关 键 词 ：Ⅰ 型 鸭 肝 炎 病 毒 ；ＶＰ１ 基 因 ；重 组 表 达
ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｅｘａｃｔｌｙ ｂｙ ｎａｋｅ ｅｙｅｓ ａｆｔｅｒ ｓｔａｉｎｅｄ ｂｙ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ．Ｉｎ ３６ｆｅｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｏｇｓ ｓｕｓｐｅｃｔｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｎｉｎｅ ｐａｒｏｖｉｒｕｓ，２９ｓａｍｐｌｅｓ（８０．５％）ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ． Ｔｈｉｓ ｔｅｓｔ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙ ｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ ｏｆ ＬＡＭＰ ｍｅｔｈｏｄ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ，ＬＡＭＰ ｈａｄ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｄｎ’ｔ ｎｅｅｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｎｅｗｌｙ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ
中 图 分 类 号 ：Ｓ８５２．６５９．６；Ｓ８５８．３２
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１００７－５０３８（２０１２）０２－００１３－０４
鸭 病 毒 性 肝 炎 （Ｄｕｃｋ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＤＶＨ）是 由鸭 肝 炎 病 毒 （Ｄｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＤＨＶ）引 起 雏 鸭的一种高度致死性、传播 迅 速 的 病 毒 性 传 染 病 。 ［１］
ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｃａｎｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ；ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ
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动 物 医 学 进 展 ２０１２ 年 第 ３３ 卷 第 ２ 期 （总 第 ２２４ 期 ）
感染动物产生中和 抗 体，ＶＰ１ 包 含 了 大 多 数 与 细 胞 受 体 相 互 作 用 和 中 和 表 位 。 ［１０－１３］ 因 此，ＶＰ１ 与 ＤＨＶ 的致病性关 系 密 切，作 为 研 制 新 型 疫 苗 的 候 选分子而成为近年来的研究热点。