大脑中动脉闭塞小鼠模型
脑卒中动物模型实验原理
脑卒中动物模型实验原理
1.1 缺血性脑卒中
2.1.2 线栓法
实验动物：MCAO大鼠、MCAO小鼠
模型特点：利用线栓闭塞大脑动脉血管，无需开颅，缺血时间和部位易控制，并发症少，是目前使用最广泛的脑卒中模型。
获取方法：可直接购买商品化模型
2.1.2 光化学法
实验动物：大鼠、小鼠
模型特点：无需开颅，重复性较高，病灶部位可控，但缺乏缺血半暗带，无法模拟部分病例的生理变化，适用于慢性脑缺血研究。
获取方法：系统给与光敏剂后，利用高强度光源照射，以激活脑区的光敏剂，产生脑水肿和血小板微血栓，造成局部梗死。
2.1.3 开颅电凝法
实验动物：大鼠、小鼠
模型特点：缺血效果稳定，出血量少，是目前公认的标准大脑中动脉闭塞模型，但开颅存在一定风险。
获取方法：右侧颞下入路进行开颅，采用双极电凝将大脑中动脉闭塞后切断。
1.2 出血性脑卒中
2.2.1 自体注入法
实验动物：ICH大鼠
模型特点：采集自体股动脉血注射至大鼠右侧基底节制作ICH模型，操作简便，出血部位稳定，与人类脑出血病理过程相似。
2.2.2 自发脑出血
实验动物：大鼠
模型特点：将高血压与出血性脑卒中有机结合，适用于高血压引起的脑出血病理生理机制研究。
获取方法：对SHR（自发性高血压）大鼠进行大脑中动脉结扎处
理
2.2.3 胶原酶注入法
实验动物：大鼠、小鼠
模型特点：操作简便，重复性高，与临床脑出血病理生理相似性高，但实验影响因素较多，稳定性较差。
获取方法：将胶原酶通过微量注射器注射入动物尾壳核内。
小鼠局灶性脑缺血再灌注模型的建立与评价
小鼠局灶性脑缺血再灌注模型的建立与评价目的建立小鼠局灶性脑缺血再灌注（I/R）模型并予以评价。
方法将昆明小鼠60只随机分为假手术组30只，I/R模型组30只。
改良线栓法制备小鼠大脑中动脉阻塞/再灌注（MCAO/R）模型。
通过神经行为学评分、氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法测定脑梗死比（%）、干湿重法测定脑含水量（%）及HE染色观察脑组织病理改变评价模型可靠性。
结果模型存活率为83.33%，造模总成功率为76.67％。
假手术组的小鼠神经行为学评分为0分，脑梗死比为0，脑含水量（77.29±0.45）%。
I/R模型组的小鼠神经行为学评分为（2.42±0.63）分，脑梗死比为（23.03±3.42）％，脑含水量（83.18±1.65）%，均较假手术组明显增高（P＜0.01）；病理检查出现典型脑梗死病理改变。
结论改良线栓法成功建立简便、可靠的小鼠局灶性I/R模型。
[Abstract] Objective To establish and evaluate the focal cerebral ischemia-reperfusion (I/R) model in mice. Methods Sixty Kunming mice were randomly divided into the sham group (n=30) and the I/R model group (n=30).The middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model was established by the improved intraluminal filament technique in mice.The reliability of the model was evaluated by the neurologic behavior score,cerebral infarction rate determined by triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining method,brain water content determined by dry-wet method,and brain histopathological change observed. Results The survival rate and total success rate of the model was 83.33% and 76.67％respectively.In the sham group,the neurologic behavior score was 0 point,the cerebral infarction rate was 0,and the brain water content was(77.29±0.45)%.In the I/R group,the neurologic behavior score was(2.42±0.53)points,the cerebral infarction rate was (23.03±3.42)％,and the brain water content was(83.18±2.35)%,and compared with the sham group,the above-mentioned indicators in the I/R model group were all markedly increased (P＜0.01).At the same time,the typical pathological change of cerebral infarctionwas also observed in the I/R group. Conclusion The simple and reliable focal cerebral I/R model has been successfully established by improved intraluminal filament technique in mice.[Key words] Mice;Cerebral ischemia-reperfusion;Middle cerebral artery occlusion;Animal model缺血性脑血管病约占全部脑血管病的80%，具有高发病率、高患病率、高死亡率、高致残率、高复发率的特点，已成为严重危害人类健康的三大疾病之一[1]。
电针通过调节Notch3信号通路改善大脑中动脉闭塞小鼠海马神经元凋亡的作用机制
电针通过调节Notch3信号通路改善大脑中动脉闭塞小鼠海马神经元凋亡的作用机制杨语晗,许明军,穆敬平摘要 目的:探讨电针通过调节Notch3信号通路改善大脑中动脉闭塞小鼠海马神经元凋亡的作用机制㊂方法:将45只健康无特定病原体(SPF )级雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组㊁大脑中动脉闭塞模型(MCAO )组和电针治疗组,各15只㊂通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC )染色和小鼠神经行为评分比较小鼠脑梗死神经损伤情况㊂采用免疫组织化学分析小鼠海马神经元Bax 和Caspase -3蛋白表达㊂通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记(TUNEL )荧光染色分析小鼠神经元细胞凋亡率;通过实时荧光定量聚合酶链式反应(RT -PCR )分析小鼠海马组织肿瘤坏死因子-α(TNF -α)㊁白细胞介素(IL )-1β㊁IL -6㊁诱导型一氧化氮合酶(iNOS )mRNA 表达;通过免疫组织化学分析小鼠海马神经元细胞凋亡;通过蛋白印迹分析小鼠海马组织Bax ㊁Bcl -2㊁Caspase -3及H19/EZH2/Notch3蛋白表达㊂通过免疫荧光染色分析小鼠脊髓组织Nestin 和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP )表达㊂结果:连续干预14d 后,MCAO 组小鼠神经损伤和脑梗死体积较对照组增加(P <0.05),电针治疗组小鼠神经损伤和脑梗死体积较MCAO 组减小(P <0.05)㊂MCAO 组神经细胞凋亡率较对照组升高(P <0.05),电针治疗组神经元细胞凋亡率较MCAO 组减少(P <0.05);MCAO 组TNF -α㊁IL -1β㊁IL -6㊁iNOS mRNA 表达较对照组升高(P <0.05),电针治疗组TNF -α㊁IL -1β㊁IL -6㊁iNOS mRNA 表达较MCAO 组降低(P <0.05)㊂MCAO 组Bax 和Caspase -3蛋白表达较对照组升高(P <0.05),电针治疗组Bax 和Caspase -3蛋白表达较MCAO 组降低(P <0.05),MCAO 组Bcl -2蛋白表达较对照组降低(P <0.05),电针治疗组Bcl -2蛋白表达较MCAO 组升高(P <0.05)㊂MCAO 组H19㊁EZH2和Notch3蛋白表达较对照组升高(P <0.05),电针治疗组H19㊁EZH2和Notch3蛋白表达较MCAO 组降低(P <0.05)㊂MCAO 组Nestin 蛋白表达较对照组降低(P <0.05),GFAP 蛋白表达较对照组升高(P <0.05);电针治疗组Nestin 蛋白表达较MCAO 组升高(P <0.05),GFAP 蛋白表达较MCAO 组降低(P <0.05)㊂结论:MCAO 可诱导海马神经元凋亡,电针通过调控Notch3激活,调节Bax/Bcl -2及Nestin 和GFAP 蛋白,从而阻断Caspase -3激活,抑制神经元凋亡㊂关键词 大脑中动脉闭塞;Notch3信号通路;电针;海马神经元;实验研究d o i :10.12102/j.i s s n .1672-1349.2023.24.010 脑卒中是全球第二大死亡原因和第三大残疾原因[1-2]㊂据估计,到2030年,中风每年将导致1200万例病人死亡,缺血性脑卒中主要由大脑中动脉脑血流阻塞引起,约占所有脑卒中的87.9%,导致严重的中枢神经系统损伤甚至死亡[3-4]㊂缺血性脑卒中是世界范围内死亡和残疾的主要原因[5-6]㊂缺血性脑卒中后血脑屏障受损导致损伤进一步发展和扩大㊂由于缺血通过剥夺氧气和代谢底物扰乱脑组织,因此在缺血条件下细胞分泌有害信号[7-9]㊂这些有害分子促进小胶质细胞活化,通过释放促炎调节剂[包括肿瘤坏死因子-α(TNF -α)㊁白细胞介素(IL )-1β㊁IL -6]引起促炎反应,从而导致炎症诱导的坏死性神经元细胞死亡㊂神经元坏百会穴死和神经元与小胶质细胞的破坏进一步增强炎症反应㊂坏死性凋亡是一种受调节的细胞死亡形式,对缺血性脑卒中损伤的进展有影响㊂抑制坏死性凋亡可显著减小梗死面积,抑制炎症,减轻运动能力,并最终改善脑缺血性损伤后认知功能㊂Notch 信号通路是一种进化上相对保守的信号通路,参与海马神经元细基金项目 湖北省卫生健康委中医药科研项目(No.ZY2021M006)作者单位 十堰市太和医院,湖北医药学院附属医院(湖北十堰442000)通讯作者 穆敬平,E -mail :****************引用信息 杨语晗,许明军,穆敬平.电针通过调节Notch3信号通路改善大脑中动脉闭塞小鼠海马神经元凋亡的作用机制[J ].中西医结合心脑血管病杂志,2023,21(24):4530-4535.胞迁移㊁分化和凋亡㊂Notch 信号通路在一些人类疾病中被激活,包括动脉粥样硬化㊁结肠直肠癌和缺血性脑卒中㊂有研究显示,抑制Notch 信号通路可能通过诱导神经元干分化并减少神经炎症和神经元凋亡[10]㊂针灸长期用于疾病预防,一项研究支持其在动物模型中诱导脑缺血耐受作用的证据[11],结果显示,在脑缺血前于百会穴(GV20)进行电针可减轻动物模型中缺血后神经功能缺损程度㊂目前,已从抑制炎症㊁抑制氧化应激㊁抑制内质网应激㊁调节大麻素系统㊁自噬㊁保护血脑屏障㊁抗凋亡等多方面探讨了电针预处理诱导脑缺血耐受的机制㊂多项研究表明,电针可抑制神经元凋亡,改善神经元微环境,加速水肿减轻和神经功能修复;抑制促炎细胞因子和Notch 信号通路相关因子的表达,表明抑制电针诱导的Notch 信号通路有助于缓解缺血性脑卒中[12-13]㊂本研究旨在探讨电针通过调节Notch3信号通路改善大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion ,MCAO )小鼠海马神经元凋亡的机制,为脑梗死等脑血管疾病类型提供新的治疗方向㊂1 材料与方法1.1 实验动物45只健康无特定病原体(SPF )级雄性C57BL/6小鼠,体质量20~25g ,购自北京维通利华实验动物科技有限公司㊂小鼠生存温度(23.0ʃ2.0)ħ,环境湿度45%~50%,光照时间每日12h ;适应期间可随意获取水和适应性饲料㊂1.1.1小鼠MCAO模型的建立MCAO模型采用改良的Zea Longa方法建立㊂腹腔注射10%水合氯醛300mg/kg后,将小鼠仰卧固定于37ħ恒温电加热板上经颈正中切口分离右侧颈总动脉㊁颈外动脉和颈内动脉,结扎颈总动脉近端㊂使用无创血管夹住颈总动脉远端和颈外动脉㊂在颈总动脉分叉处做一切口,放置头部钝化的尼龙线㊂将尼龙线缓慢向前推8~10mm㊂当感觉到阻力时,停止并固定在颈总动脉上㊂栓塞1h后,拔出线塞恢复血流㊂再灌注2h后,使用神经功能评分验证模型是否成功㊂1.1.2动物分组将45只小鼠随机分为3组,每组15只,对照组除不将细丝推进至大脑中动脉起点处外,其他处理与MCAO组相同;MCAO组建立小鼠MCAO模型;电针治疗组:MCAO小鼠模型建立后,百会穴位于矢状中线与两耳连线的交点处,使用XYD-IV仪器(翔宇医疗,型号20152260115),以1mA的强度和2~15Hz的频率刺激,每日20min,连续14d㊂1.2实验方法1.2.1小鼠神经损伤评估神经行为评分包括6方面:自发活动(笼中5min, 0~3分)㊁运动对称性(四肢,0~3分)㊁前肢对称性(尾握时伸展,0~3分)㊁铁丝笼爬墙(1~3分)㊁躯干两侧的触摸反应(1~3分)和触须触摸的反应(1~3分)㊂总分18分,得分越低提示神经功能受损程度越小,计算脑梗死体积㊂1.2.22,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色计算脑梗死体积将小鼠麻醉并处死后提取脑组织,使用冰盐水冲洗后,在-20ħ冰箱中快速冷冻脑组织20min,使脑组织变硬进行切割㊂沿冠状面切片,厚度为2mm,每个脑切5片或6片㊂将脑切片放入用锡纸包裹并置于含有2%TTC(北京索莱宝公司)的培养皿中,在37ħ培养箱中染色30min㊂在此期间,轻轻转动大脑切片,使其充分暴露于反应液中㊂取出培养皿,用1mL针管吸出TTC溶液,将切片置于4%多聚甲醛溶液中固定5min,取出切片按顺序摆放㊂采用Image-Pro Plus图像软件计算每个脑切片的脑梗死体积比㊂为减少脑缺血性半球水肿引起的误差,梗死体积为对侧正常脑组织体积-同侧正常组织体积,结果以梗死体积百分比表示:梗死面积体积百分比=(对侧正常脑组织体积-同侧正常脑组织体积)/对侧正常组织体积ˑ100%㊂1.2.3末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)荧光染色检测细胞凋亡率小鼠脑组织经二甲苯脱蜡㊁乙醇脱水后,石蜡切片加入20μg/mL蛋白酶K工作液(北京索莱宝公司),室温放置15min㊂向每个样品中加入51μL的TUNEL 溶液(45μL平衡缓冲液ʒ5μL核苷酸混合物ʒ1μL rTdT酶),避光孵育1h㊂加入2ˑSSC缓冲液在室温下孵育15min以终止反应㊂加入含有抗荧光淬灭的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),黑暗中孵育5min,盖上盖玻片㊂通过荧光显微镜(倒置荧光显微镜,德国)获得海马CA1区图像(200倍)㊂计算不同视野内凋亡阳性细胞百分比,取平均值进行统计分析㊂凋亡率=阳性细胞/细胞总量ˑ100%㊂1.2.4免疫组织化学分析小鼠海马神经元细胞Bcl-2㊁Bax和Caspase-3蛋白表达组织包埋,切片,烘烤,脱蜡,补液和抗原修复后,在37ħ条件下,将细胞在2%的低聚甲醛中固定4h,在封闭缓冲液[含10%山羊血清和0.01%Tween-20的磷酸缓冲盐溶液(PBS)]中孵育1h㊂37ħ条件下,在封闭缓冲液中将组织与第一抗体[兔鼠抗小鼠Bcl-2多克隆抗体(1ʒ200)㊁兔鼠抗小鼠Bax多克隆抗体(1ʒ200)㊁兔抗小鼠Caspase-3多克隆抗体(1ʒ200)] 4ħ过夜㊂将组织用含0.05%Tween-20的PBS洗涤3次,在室温下添加1ʒ200的山羊抗小鼠二抗(Aspen 公司),在37ħ条件下,细胞孵育4h㊂使用PBS洗涤切片3次,加入显色剂(DAB)㊂最后,将切片冲洗, DAPI复染密封㊂在Zeiss LSM710共聚焦显微镜下观察,使用Zen2.31SP(黑色版)软件(Zeiss)处理图像㊂1.2.5实时荧光定量聚合酶链式反应检测TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6㊁诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达收集小鼠的海马组织,在1mL TRIzol Reagent (15596026,赛默飞世尔科技公司,美国)中研磨成组织匀浆,转移到1.5mL离心管中,加入200μL氯仿,混合并在4ħ㊁10000r/min下离心5min以获得总mRNA(在上层水相中)㊂加入500μL异丙醇,混匀,在相同条件下再次离心,纯化mRNA㊂弃上清,采用75%乙醇洗涤异丙醇,得到离心管底部富集的mRNA 沉淀㊂加入50μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解mRNA,用Nano Drop微管分光光度计(Invitrogen公司,美国)测量mRNA浓度㊂根据试剂盒说明,使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (***********,罗氏公司,德国)将mRNA逆转录为cDNA㊂通过实时PCR系统(LightCycler 480,罗氏公司,德国)检测每个样品TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6㊁iNOS mRNA表达水平㊂1.2.6蛋白免疫印迹法检测海马H19㊁EZH2和Notch3蛋白表达水平1)提取蛋白:人卵巢癌细胞,加入10mL/mg蛋白免疫印迹法及IP细胞裂解液,使用匀浆器匀浆,利用超声组织破碎仪破碎细胞(破碎条件为每管4次/300W),细胞破碎后冰上放置30min,将破碎后的细胞进行离心, 4ħ㊁12000ˑg(重力加速度)离心30min,收集上清液,即为蛋白抽提液㊂2)蛋白定量:使用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度,将蛋白浓度调节一致㊂3)凝胶电泳:取待测标本15μL进行上样,该过程中选取甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)单抗(1ʒ500)作为蛋白质上样量的标定物,每泳道上样30μg蛋白量㊂使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroresis,SDS-PAGE)进行电泳分析,至目的分子量出现㊂4)湿法转膜:采用湿法将蛋白条带电转至Immun-blot聚偏乙烯膜(PVDF)上,加入浓度为50g/L的脱脂奶粉在20ħ条件下封闭震荡处理3h,加入以下抗体[兔鼠抗小鼠H19多克隆抗体(1ʒ400)㊁兔抗小鼠EZH2(1ʒ400)多克隆抗体㊁兔抗小鼠Notch3多克隆抗体(1ʒ400)],4ħ孵育过夜,用TBS缓冲液(Tris50mmol/L,NaCl100 mmol/L,pH7.5)冲洗3次,每次10min㊂使用经过辣根酶标记的IgG(1ʒ1000),在37ħ条件下孵育2h,漂洗3次,每次10min㊂5)发光显影:使用电化学发光(ECL)试剂盒进行显影操作㊂首先等体积混合ECL 试剂盒中的A液和B液,20ħ保存备用,将二抗加入于反应液中进行孵育,使用PBS进行多次洗涤,取出膜后使用洁净的吸水纸轻轻吸去多余的液体,将膜放置在洁净的保鲜膜上,整个操作过程需要谨慎小心,避免触碰蛋白电泳一侧㊂按照0.125mL/cm2滴加发光液,使发光液均匀覆盖在膜上静置5min,取出膜,去除上面的发光液㊂将膜固定在两片保鲜膜中间,于暗室内压片5min后完成显影定影操作㊂选择GAPDH单抗(1ʒ1000)作为内参㊂6)图像分析:胶片干燥后,使用Mieroteck扫描仪扫描图像,利用Quantity-One软件进行积分光密度分析㊂1.2.7免疫荧光染色法检测MCAO和电针治疗小鼠脊髓组织中Nestin和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达取10μm厚的脊髓组织切片在4ħ下在4%多聚甲醛中固定㊂将脊髓组织与封闭溶液(0.2%T riton X-100)和5%牛血清白蛋白(V/V)在室温下孵育1h,在4ħ下与相应的溶液孵育过夜㊂针对胶质纤维酸性蛋白(GFAP1ʒ1000,Abcam公司,美国)和巢蛋白(1ʒ200,Abcam公司,美国)的特异性抗体,冲洗后,将切片与Alexa Fluor555(1ʒ500;Abcam公司,美国)抗兔IgG 作用1h㊂用4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)复染细胞核㊂采用Nikon Eclipse80i显微镜(Nikon公司,日本)捕获荧光图像㊂1.3统计学处理采用SPSS20.0统计软件(美国IBM公司)对数据进行分析,符合正态分布的定量资料以均数ʃ标准差(xʃs)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用最小显著差异法(LSD-t)㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1各组小鼠脑神经损伤得分和脑梗死体积比较MCAO组小鼠神经损伤和脑梗死体积较对照组增加(P<0.05),电针治疗组小鼠神经损伤和脑梗死体积较MCAO组减少(P<0.05)㊂详见表1㊂表1各组小鼠神经损伤得分和脑梗死体积比较(xʃs)组别只数神经损伤得分(分)脑梗死体积(%)对照组15 2.64ʃ0.52 1.21ʃ0.36 MCAO组1515.39ʃ2.17①37.52ʃ4.24①电针治疗组15 6.26ʃ1.33②13.53ʃ2.17②F值12.77316.572P<0.001<0.001注:MCAO组与对照组比较,①P<0.05;电针治疗组与MCAO组比较,②P<0.05㊂2.2各组小鼠神经细胞凋亡率比较MCAO组神经细胞凋亡率较对照组升高(P<0.05),电针治疗组神经细胞凋亡率较MCAO组降低(P< 0.05)㊂详见表2㊂表2各组小鼠神经细胞凋亡率比较(xʃs)组别只数神经细胞凋亡率(%)对照组157.25ʃ3.42 MCAO组1545.52ʃ8.69①电针治疗组1518.34ʃ3.66②F值13.527P<0.001注:MCAO组与对照组比较,①P<0.05;电针治疗组与MCAO组比较,②P<0.05㊂2.3各组炎性因子mRNA表达比较MCAO组TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6㊁iNOS mRNA表达较对照组升高(P<0.05),电针治疗组TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6㊁iNOS mRNA表达较MCAO组降低(P<0.05)㊂详见表3㊂表3各组炎性因子mRNA表达比较(xʃs)组别只数TNF-αmRNA IL-1βmRNA IL-6mRNA iNOS mRNA 对照组15 1.02ʃ0.02 1.04ʃ0.01 1.00ʃ0.01 1.01ʃ0.01 MCAO组15 1.86ʃ0.15① 1.74ʃ0.11① 1.85ʃ0.16① 1.92ʃ0.16①电针治疗组15 1.24ʃ0.08② 1.13ʃ0.04② 1.07ʃ0.05② 1.16ʃ0.09②F值15.77312.62511.42412.702 P<0.001<0.001<0.001<0.001注:MCAO组与对照组比较,①P<0.05;电针治疗组与MCAO组比较,②P<0.05㊂2.4电针治疗抑制MCAO小鼠海马神经元细胞Bax㊁Bcl-2和Caspase-3蛋白表达通过免疫组织化学分析小鼠海马神经元细胞凋亡,MCAO组Bax和Caspase-3蛋白表达较对照组升高(P<0.05),电针治疗组Bax和Caspase-3蛋白表达较MCAO组降低(P<0.05);MCAO组Bcl-2蛋白表达较对照组降低(P<0.05),电针治疗组Bcl-2蛋白表达较MCAO组升高(P<0.05)㊂详见图1㊁表4㊂图1各组Bax㊁Bcl-2和Caspase-3蛋白表达免疫组织化学分析表4各组Bax㊁Bcl-2和Caspase-3蛋白表达比较(xʃs)组别只数Bax蛋白Bcl-2蛋白Caspase-3蛋白对照组15 1.12ʃ0.03 1.95ʃ0.18 1.07ʃ0.04 MCAO组15 1.86ʃ0.16① 1.13ʃ0.10① 1.85ʃ0.13①电针治疗组15 1.08ʃ0.02② 1.82ʃ0.16② 1.14ʃ0.06①②F值10.63511.2539.557P0.0030.0120.026注:MCAO组与对照组比较,①P<0.05;电针治疗组与MCAO组比较,②P<0.05㊂2.5电针治疗对H19/EZH2/Notch3信号通路的影响MCAO组H19㊁EZH2和Notch3蛋白表达较对照组升高(P<0.05),电针治疗组H19㊁EZH2和Notch3蛋白表达较MCAO组降低(P<0.05)㊂详见表5㊁图2㊂表5各组H19/EZH2/Notch3信号通路相关蛋白表达比较(xʃs)组别只数H19蛋白EZH2蛋白Notch3蛋白对照组15 1.02ʃ0.01 1.05ʃ0.04 1.03ʃ0.02 MCAO组15 1.87ʃ0.15① 1.92ʃ0.17① 1.95ʃ0.14①电针治疗组15 1.06ʃ0.03② 1.12ʃ0.08② 1.09ʃ0.07②F值10.72112.3358.897P0.0120.0040.011注:MCAO组与对照组比较,①P<0.05;电针治疗组与MCAO组比较,②P<0.05㊂图2各组相关蛋白表达条带图2.6电针治疗对脊髓组织中神经干细胞Nestin和GFAP蛋白表达的影响MCAO组Nestin蛋白表达较对照组降低(P<0.05), GFAP蛋白表达较对照组升高(P<0.05);电针治疗组Nestin蛋白表达较MCAO组升高(P<0.05),GFAP 蛋白表达较MCAO组降低(P<0.05)㊂免疫荧光染色检测MCAO和电针治疗小鼠脊髓组织中Nestin和GFAP蛋白表达,红色代表GFAP阳性,绿色代表Nestin阳性,免疫荧光染色结果显示,与MCAO组比较,电针治疗组Nestin蛋白水平增加,GFAP蛋白水平降低㊂表明电针治疗显著增加神经元干细胞增殖并抑制向星形胶质细胞分化㊂详见图3㊁表6㊂图3各组神经干细胞免疫荧光染色图表6各组神经干细胞Nestin和GFAP蛋白表达比较(xʃs)组别只数Nestin蛋白GFAP蛋白对照组15 1.95ʃ0.17 1.11ʃ0.06 MCAO组15 1.14ʃ0.07① 1.93ʃ0.18①电针治疗组15 1.85ʃ0.16② 1.03ʃ0.02②F值11.33915.586P<0.001<0.001注:MCAO组与对照组比较,①P<0.05;电针治疗组与MCAO组比较,②P<0.05㊂3讨论脑血管病是一种临床的常见疾病,具有高发病率㊁高死亡率㊁高致残率和高复发率的特点[14-15]㊂脑梗死约占脑血管疾病的70%以上,是一类影响大㊁预后差㊁治疗选择有限的脑血管疾病[16-17]㊂针灸治疗阿尔茨海默病㊁中风㊁缺血性脑卒中痉挛性偏瘫可发挥良好的治疗作用,但作用机制尚未明确[18-19]㊂因此,电针治疗脑梗死的作用机制是目前的研究热点㊂本研究证实电针刺激对脑梗死小鼠具有保护作用,可改善MCAO小鼠神经功能损伤,减小脑梗死体积,降低小鼠炎性细胞因子水平等㊂细胞凋亡是神经系统缺氧缺血性神经元丢失的重要原因㊂本研究通过TUNEL荧光染色分析发现,电针降低了MCAO小鼠海马神经元凋亡率;蛋白印迹分析发现电针治疗降低MCAO小鼠凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达,促进Bcl-2升高,并抑制MCAO引起的炎性因子水平升高㊂有研究表明,电针可保护或预防MCAO早期和中期功能性神经元死亡,抑制Notch信号通路[20]㊂MCAO后是急性但持久的炎症反应,特点是活性氧产生增加㊂载脂蛋白E(ApoE)在MCAO中具有抗炎㊁抗氧化和抗凋亡特性,电针通过增加ApoE表达,减轻MCAO炎症和氧化应激反应㊂电针刺激在MCAO后发挥神经保护作用,与脑源性神经营养因子和神经营养因子上调相关㊂电针可抑制疼痛信号的诱导和传递,通过重新平衡神经-免疫-内分泌相互作用,介导抗伤害和抗炎作用㊂脑梗死可触发多种细胞信号通路,导致细胞存活或细胞损伤㊂电针通过调节脑梗死大鼠模型中的p38㊁细胞外信号调节激酶(ERK1/2)和c-Jun N末端激酶(JNK)抑制脑梗死区域的细胞凋亡㊂本研究结果显示,MCAO组小鼠Notch3信号通路相关基因表达显著增加;电针通过Notch3信号通路抑制脑梗死海马神经元凋亡,Notch3通路在电针治疗脑梗死中起关键作用㊂EZH2增强子是一种组蛋白甲基转移酶,在细胞分化㊁炎症㊁肌成纤维细胞转化和组织纤维化中发挥着重要作用㊂EZH2在人类胆管癌和系统性硬化症中充当了Notch信号通路的调节剂㊂分子量为2.3kDa的长链非编码RNA(lncRNA)H19在MCAO㊁糖尿病和类风湿性关节炎中高表达,通过调节let-7b㊁Wnt和Notch信号通路促进神经元细胞凋亡㊂H19可调节异常细胞和组织中的EZH2表达,表明其与EZH2参与MCAO的进展㊂EZH2在细胞增殖和凋亡中发挥着关键作用㊂在毛囊干细胞中,EZH2通过抑制miR-22,促进细胞增殖和分化,激活信号转导和转录激活因子3(STAT3),增加细胞凋亡和促炎细胞因子的释放㊂H19与miR-138的相互作用可调节EZH2表达㊂本研究结果表明,H19通过激活Notch3信号通路在提高因子基因表达方面发挥作用,EZH2和H19表达与Notch3信号通路的激活有关㊂相关研究显示,2㊁50 Hz的电针刺激在运动性能方面表现出持续且显著的增强[21]㊂本研究结果显示,2Hz的电针刺激可促进神经干细胞增殖,抑制Notch3信号通路,促进神经干细胞增殖,即抑制Notch3信号通路可作为保护MCAO 的神经元凋亡的靶点㊂综上所述,MCAO可诱导海马神经元凋亡,电针通过调控Notch3激活,调节Bax/Bcl-2及Nestin和GFAP蛋白,从而阻断Caspase-3激活抑制神经元凋亡,该结果可为脑梗死的治疗提供实验依据㊂参考文献:[1]WANG D,LI L J,ZHANG Q,et bination ofelectroacupuncture and constraint-induced movement therapyenhances functional recovery after ischemic stroke in rats[J].Journal of Molecular Neuroscience,2021,71(10):2116-2125. [2]LIU L,ZHANG Q,XIE H Y,et al.Differences in post-ischemicmotor recovery and angiogenesis of MCAO rats followingelectroacupuncture at different acupoints[J].Current NeurovascularResearch,2020,17(1):71-78.[3]LIU L,ZHANG Q,LI M Y,et al.Early post-strokeelectroacupuncture promotes motor function recovery in post-ischemic rats by increasing the blood and brain irisin[J].Neuropsychiatric Disease and Treatment,2021,17:695-702. [4]DUAN X D,ZHANG L,YU J H,et al.The effect of differentfrequencies of electroacupuncture on BDNF and NGFexpression in the hippocampal CA3area of the ischemichemisphere in cerebral ischemic rats[J].NeuropsychiatricDisease and Treatment,2018,14:2689-2696.[5]KANG Z,YE H M,CHEN T,et al.Effect of electroacupuncture atsiguan acupoints on expression of BDNF and TrkB proteins inthe hippocampus of post-stroke depression rats[J].Journal ofMolecular Neuroscience,2021,71(10):2165-2171.[6]XU X Y,FANG Q,HUANG W,et al.Effect of electroacupunctureon neurological deficit and activity of clock and Bmal1in cerebralischemic rats[J].Current Medical Science,2020,40(6):1128-1136.[7]YU Q,LI X H,LI Y M,et al.Effects of combinedelectroacupuncture and exercise training on motor function andmicrotubule-associated protein2expression in the middle andlate stages of cerebral infarction in rats[J].Acupuncture inMedicine,2020,38:175-180.[8]SHA R,HAN X H,ZHENG C X,et al.The effects ofelectroacupuncture in a rat model of cerebral ischemia-reperfusion injury following middle cerebral artery occlusioninvolves microRNA-223and the PTEN signaling pathway[J].Medical Science Monitor,2019,25:10077-10088.[9]XING Y,YANG S D,WANG M M,et al.Electroacupuncturealleviated neuronal apoptosis following ischemic stroke in ratsvia midkine and ERK/JNK/p38signaling pathway[J].Journal ofMolecular Neuroscience,2018,66(1):26-36.[10]CAO S Q,YANG Y F,YU Q,et al.Electroacupuncture alleviatesischaemic brain injury by regulating the miRNA-34/Wnt/autophagy axis[J].Brain Research Bulletin,2021,170:155-161.[11]SHA R,ZHANG B,HAN X H,et al.Electroacupuncture alleviatesischemic brain injury by inhibiting the miR-223/NLRP3pathway[J].Medical Science Monitor,2019,25:4723-4733.[12]WEN T,ZHANG X F,LIANG S X,et al.Electroacupunctureameliorates cognitive impairment and spontaneous low-frequency brain activity in rats with ischemic stroke[J].Journal ofStroke and Cerebrovascular Diseases,2018,27(10):2596-2605.[13]ZHANG Y,MAO X,LIN R H,et al.Electroacupuncture amelioratescognitive impairment through inhibition of Ca2+-mediatedneurotoxicity in a rat model of cerebral ischaemia-reperfusioninjury[J].Acupuncture in Medicine:Journal of the British MedicalAcupuncture Society,2018,36(6):401-407.[14]DONG H,QIN Y Q,SUN Y C,et al.Electroacupunctureameliorates depressive-like behaviors in poststroke rats viaactivating the tPA/BDNF/TrkB pathway[J].NeuropsychiatricDisease and Treatment,2021,17:1057-1067.[15]WANG Z F,LIN B B,LIU W L,et al.Electroacupuncture ameliorateslearning and memory deficits via hippocampal5-HT1A receptors andthe PKA signaling pathway in rats with ischemic stroke[J].Metabolic Brain Disease,2020,35(3):549-558.[16]WANG H Y,CHEN S H,ZHANG Y M,et al.Electroacupunctureameliorates neuronal injury by Pink1/Parkin-mediated mitophagyclearance in cerebral ischemia-reperfusion[J].Nitric Oxide:Biology and Chemistry,2019,91:23-34.[17]CHEN B,LIN W Q,LI Z F,et al.Electroacupuncture attenuatesischemic brain injury and cellular apoptosis via mitochondrialtranslocation of cofilin[J].Chinese Journal of IntegrativeMedicine,2021,27(9):705-712.[18]WANG H L,LIU F L,LI R Q,et al.Electroacupuncture improveslearning and memory functions in a rat cerebral ischemia/reperfusion injury model through PI3K/AKT signaling pathwayactivation[J].Neural Regeneration Research,2021,16(6):1011-1016.[19]ZHANG G F,YANG P,YIN Z,et al.Electroacupuncturepreconditioning protects against focal cerebral ischemia/reperfusion injury via suppression of dynamin-related protein1[J].Neural Regeneration Research,2018,13(1):86-93. [20]CHEN X B,SUN X Y,LIU N H,et al.Analysis of human acupointbiological information and neural electric activity based onultrasonographic image[J].World Neurosurgery,2021,149:481-491.[21]JIA B R,CHENG C Y,LIN Y W,et al.The2Hz and15Hzelectroacupuncture induced reverse effect on autonomic functionin healthy adult using a heart rate variability analysis[J].Journalof Traditional and Complementary Medicine,2011,1(1):51-56.(收稿日期:2022-06-21)(本文编辑薛妮)。
潘氏试验步骤范文
潘氏试验步骤范文潘氏试验也叫做MCAO试验，是一种常用的大脑中动脉阻塞模型，用于研究脑卒中及相关疾病的机制和治疗。
下面是潘氏试验的步骤：1.动物准备：首先，选择适当品种和年龄的小鼠或大鼠作为试验动物，常用的有Wistar大鼠和C57BL/6小鼠。
接着，根据试验目的和组织供血区域的需求，决定是选择一侧还是双侧中动脉进行阻塞。
最后，将动物进行麻醉，通常使用2-3%氟烷，基于体重注射适量的麻醉剂。
2.手术准备：在麻醉的动物上，消毒皮肤，并使用手术仪器和材料准备手术场地。
使用显微镜悬挂器，保持口腔张开，并用医用腔管将气管插入鼻孔或嘴巴，以确保正常呼吸。
继续用消毒剂清洁信号穴位以减少细菌感染。
3.大脑中动脉阻塞手术：在对中动脉进行阻塞的一侧或双侧颈部，做一个中线切口，用力提升颈部的皮肤，并对甲状软骨下沟以及胸骨下静脉穿刺位应力，以确保动脉的可见性。
用显微操术下手术刀尖在颈部的浅颈动脉和深颈动脉中脉中间的浅抹痕中，制作0.3mm的裂口，使应力更容易穿过血管。
切断颈动脉内和外肌肉层，直到难以穿过最外层。
4.确定血管闭塞：用注射泵将硬化硅胶塞注入颈动脉，直到栓子移动至脑大脑底动脉。
通过行为检查，观察动物的运动缺陷，如无力、步履不稳等，以确定血管是否被成功阻塞。
使用脑电图来检测脑电流的变化，以确保脑血流供应中断。
5.建立区域再灌注：在一定的时间后（通常是30分钟至2小时），将血管栓子缓慢地从颈动脉中拔出，以实现中动脉再灌注。
根据实验设计，在再灌注之前，可以通过实施一定的药物处理来评估脑损伤和治疗效果。
6.病理分析：在实验结束后，用生理盐水灌洗颈部静脉，然后将动物处死，分离出大脑。
使用石蜡包埋法制备脑组织切片，并使用不同的染色方法，如石蜡切片的苜蓿蓝染色法，来评估脑缺血损伤和再灌注的效果。
使用显微镜观察脑组织的细胞形态学和结构损伤，以及神经元损伤等指标。
通过以上步骤的实施，潘氏试验可以成功地通过中动脉阻塞模型来模拟脑卒中，并研究脑血管阻塞导致的损伤机制和潜在的治疗效果。
SCID小鼠永久性左侧大脑中动脉阻塞模型的制备及评价
SCID小鼠永久性左侧大脑中动脉阻塞模型的制备及评价汤倩倩;卢山;蒋敏海【摘要】Objective To establish a permanent left middle cerebral artery occlusion (L-MCAO) model in severe combined immunodeficiency (SCID) mice.Methods Thirty SCID mice were randomly divided into sham operation group and L-MCAO group with 15 in each group.The left middle cerebral artery occlusion was induced by electrocoagulation in SCID mice of L-MCAO group.The cerebral blood flow was monitored by laser Doppler,and the ratio of cerebral blood flow was calculated.The neurological deficit score was assessed 24h after operation.The animals were sacrificed two weeks after the operation;the brain tissues were stained with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC) and diaminobenzidine(DAB),and the percentage of cerebral infarction area was calculated.Results The ratio of cerebral blood flow in L-MCAO group was 0.47±0.55,the neurological deficit score was 1.95 ± 0.76,and the percentage of cerebral infarction area was (18.47 ± 1.92)％.While there was no cerebral infarction lesion in the sham group and model failedmice.Conclusion The permanent L-MCAO model of SCID mice has been established with high success rate,which simulates human cerebral infarction to a certain extent,and may be used for research on cerebral infarction and drug development.%目的研究严重免疫缺陷(SCID)小鼠永久性左侧大脑中动脉闭塞(L-MCAO)模型的制备及评价.方法将SCID小鼠随机分为假手术组和L-MCAO组各15只.于SCID小鼠嗅束外缘电凝并切断左侧大脑中动脉(L-MCA),制作L-MCAO模型.使用激光散斑血流仪实时监测小鼠脑血流量,并计算脑血流量比值;术后在小鼠麻醉清醒后24h进行神经功能学评分;术后2周后取小鼠大脑行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色和二氨基联苯胺(DAB)染色,并计算脑梗死面积百分比.结果术后60minL-MCAO组小鼠脑血流量比值基本稳定在0.47±0.55,神经功能学评分为(1.95±0.76)分,脑梗死面积百分比为(18.47±1.92)％;假手术组及建模失败的小鼠未见梗死区域.结论 SCID小鼠永久性L-MCAO模型在一定程度上可以模拟人类脑梗死,制作成功率高,在临床脑梗死观察和药物研究方面具有较高的应用价值.【期刊名称】《浙江医学》【年(卷),期】2017(039)006【总页数】4页(P432-434,后插3)【关键词】严重免疫缺陷;小鼠;左侧大脑中动脉闭塞术;脑血流量【作者】汤倩倩;卢山;蒋敏海【作者单位】310006 南京医科大学附属杭州医院(杭州市第一人民医院)神经内科;310006 南京医科大学附属杭州医院(杭州市第一人民医院)神经内科;310006 南京医科大学附属杭州医院(杭州市第一人民医院)神经内科【正文语种】中文脑梗死是一种高发病率、高死亡率、高致残率和高复发率的疾病。
大鼠MCAO模型的制作
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注意保温 动作轻柔熟练 麻醉药用量宁少勿多 控制进线深度 线拴法有一定的死亡率，淘汰率也比较高，
做好预试 模型不成功的大鼠要记录和总结
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谢谢！
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感谢您的观看。
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首先分离颈总 动脉并穿单线 备用
沿颈总动脉向 远心端依次分 离出颈外动脉、 甲状腺上动脉、 第7页/共17页 枕下动脉以及
实验方法（4）
双线结扎颈外动脉和枕下 动脉后剪断血管，在颈外 动脉残端上用单线打一个 松结
动脉夹夹闭颈总动脉近心 端以及颈内动脉，颈外动 脉残端上45度剪一小口， 向颈内方向插入栓线，扎 紧固定线，松开动脉夹
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实验前准备工作（2）
栓线选择：准备直径0.205mm、 0.235mm、0.26mm三种粗细的鱼 线，实验中根据大鼠体重以及大 鼠个体差异调整
栓线处理：取一段5cm长的鱼线， 在一端以及2cm、2.2cm处分别用 记号笔作一个标记，垂直在熔化 的石蜡中迅速浸入并提起，立即 凝固的一薄层石蜡可牢固地粘附 在鱼线一端的表面
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实验方法（1）
动物麻醉后 仰卧位固定 在鼠板上， 剪毛后用 75%乙醇简 单消毒，颈 正中线开口第5页/共17页
实验方法（2）
沿正中钝性分离两侧鼓泡腺体，暴露颈前肌群 沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，暴露颈总动
脉及分支 这两步均用弯头止血钳进行钝性分离
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实验方法（3）
切片置1%TTC染液中，60℃烘箱中染色10min 用image pro-plus 6.0 软件计算梗塞面积
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讨论
mcao造模流程
mcao造模流程脑卒中造模技术（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）是一种常用的脑卒中模型制备方法，通过阻塞大脑中动脉的某一分支（通常选用大脑中动脉主干的一支——Middle cerebral artery），模拟缺血性脑卒中的发病机制，进而研究脑卒中的病理生理机制、药物治疗效果等。
下面将详细介绍MCAO造模流程。
一、选择动物模型1.1 实验动物选择常见的实验动物包括小鼠、大鼠和猪等，其中小鼠是最常用的实验动物，其体型小、价格低廉、易于饲养管理，同时其脑血管结构较为接近人类，是进行脑卒中研究的理想动物模型。
1.2 动物品系选择在进行动物实验前，需要选择适合的动物品系。
一般选择体重在20-30g之间的健康雄性小鼠，如C57BL/6、BALB/c等品系。
在选择动物时，需注意保证动物的健康状况，确保实验结果的可靠性。
二、MCAO造模手术准备2.1 手术器械准备准备各种手术器械，如手术刀、镊子、显微镊子、细胞吸管等。
保证手术操作的顺利进行。
2.2 麻醉和固定动物将实验动物置于麻醉机中，给予全身麻醉，使其处于深度麻醉状态。
然后将动物固定在手术台上，以确保手术操作的稳定性。
2.3 消毒处理在手术前，需对手术器械、手术区域进行消毒处理，以减少术后感染的风险。
一般使用碘酒或酒精等对皮肤和手术器械进行消毒。
2.4 体温调节在手术过程中，需要注意保持动物的体温稳定，可在手术台下方放置保温器，以保持动物的体温在恒定水平。
三、MCAO造模手术操作3.1 手术部位定位根据动物的头骨特征，在颅骨的边缘位置找到上颞嵴和眼轴之间的凹陷处，这个位置即为手术部位。
3.2 手术切口和暴露动脉在手术部位进行皮肤切口，暴露颅骨表面后，使用高速齿钻穿透颅骨，直至到达脑膜下，用细钳和显微镊子逐层剥离组织，直至暴露中动脉。
3.3 中动脉闭塞使用单根尼龙线或血栓栓钳，在中动脉主干或其分支处进行闭塞，通过牵拉线或闭钳将中动脉关闭，模拟缺血性脑卒中的病变过程。
小鼠脑缺血模型
小鼠脑缺血模型大脑中动脉阻塞 (middle cerebral artery occlusion，MCAO) 是目前最常用的局灶性脑缺血模型,MCAO 模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。
从ECA插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA）发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。
此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。
线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，用于研究神经元对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。
控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。
1.实验动物SPF级BablC小鼠，健康，雄性，体重为25g-30g2.实验分组实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。
3.主要试剂2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride（sigma）4.建模方法1. 3%戊巴比妥钠麻醉小鼠，颈部备皮，消毒，插入肛温探头，保持体温在37±0.5℃。
2. 颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，颈内动脉和颈外动脉。
使用7-0丝线在距离颈总动脉分叉2mm 处结扎颈外动脉远心端，在颈外动脉穿入另一根7-0丝线，在靠近颈总动脉分叉处打一个活结。
3. 使用动脉夹夹闭颈总动脉。
在距离颈总动脉分叉处1.5mm处的颈外动脉上剪一个小口，将一根头端处理过的0.18mm直径的尼龙线从小口中插入，进入颈内动脉，并向内插入大脑中动脉，尼龙线的插入深度距离颈总动脉分叉处约9±1mm。
4. 缺血后60min拔掉线栓，用7-0丝线结扎外动脉近心端，用5-0丝线缝合颈部伤口，活力碘消毒伤口，将小鼠放在加热垫上，待清醒后放入恒温抚养箱饲养。
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大脑中动脉闭塞小鼠模型
卒中是一种常见的神经系统致命疾病。
88%的缺血性卒中系因血管闭塞。
因为大多数缺血组中发生在大脑中动脉支配区，所以大脑中动脉为卒中小鼠模型重点。
堵塞大脑中动脉的管腔内单线模型用来模仿持久或短暂的闭塞。
这个技术不需要颅骨切除术，切除部分颅骨的外科手术会影响颅内压及体温。
这一技术已广泛应用于模拟持久和短暂局部缺血症状的小鼠。
方案：大脑中动脉闭塞模型
1、将5.0单缝线剪成20mm一段，将一端加热烧圆，用显微尺测量
直径。
我们最终选直径0.21—0.22mm的缝线，用于25-30g体重
小鼠。
2、高压蒸汽灭菌法消毒所有手术用品。
70%乙醇消毒手术台和器械。
3、用5%异氟醚麻醉8-12周小鼠。
诱导麻醉后，将异氟醚调至1.5%
小剂量维持。
4、将小鼠仰卧位至于加热板上。
插入一直肠探针，监测并维持小鼠
体温在36.5-37.5℃之间。
5、颈部术区备皮。
用70%酒精清洁术区。
6、在立体显微镜下颈部正中1cm切口，拉钩暴露手术部位并找到右
侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，并将其与周围神经及筋膜分
离。
7、进一步分离ECA远端，用双极电凝器凝固ECA和STA，于凝固
点切断ECA和STA
8、在ECA根部松放两根8.0丝线，在颈总动脉分叉处放置一个血管
夹。
9、在ECA残端做一小切口，测量并记录圆头5.0单缝线的长度，插
入小口内并向前送入夹子处。
缩紧两丝线，确保单缝线刚好能顺
利进入。
10、移除血管分叉处的血管夹，轻轻向前送入单缝线，从ECA到ICA，
大概超过CCA分叉处9-10mm，堵住MCA。
整个手术大概花用
30-45分钟。
11、缝合颈部切口，将小鼠放置35℃保温箱中苏醒，然后放回笼中。
小鼠苏醒大概需要5-10分钟。
若需短暂性大脑中动脉闭塞模型，
可在0.5-2小时后将小鼠再麻醉然后将缝线退到ECA根部。
12、诱导MCAO24小时后，5%异氟醚麻醉小鼠，颈髓离断法取出大
脑。
冠切成四个2mm片，室温下将每片放置2% 2，3，5-氯三苯
四唑（TTC）磷酸缓冲液中，以测定缺血面积大小。
将脑切片放
在10%中性福尔马林缓冲液中，保持4℃，直至显像。
讨论：1、术中及苏醒前保持小鼠体温恒定很重要。
体温影响缺血面积，体温降低缺血面积小，体温过高缺血面积增大。
2、在暴露和分离CCA和ECA时，避免损伤周围迷走神经和气管，
那样将导致缺血面积增大，死亡率增高。
3、不要将单缝线插入超过分叉处10cm以上。
插入过远会穿破大脑前
动脉导致脑出血。
当插入9-10mm时会感到一个阻力，这时需要停下来确定进线长度。