小鼠大脑中动脉栓塞模型的改良及评价

小鼠大脑中动脉栓塞模型的改良及评价【摘要】目的：对小鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型进行改良并进行评价。

方法：C57BL/6J小鼠50只，随机分为假手术组10只，MCAO组40只；改良线栓法制作小鼠MCAO模型；术后24 h行神经功能评分，TTC染色测脑梗死体积；术后30 d，水迷宫测试小鼠远期学习和记忆能力；术后90 d，头部MRI观察梗死病灶及脑组织变化。

结果：造模成功率为67.5％；MCAO组小鼠神经功能评分为（2.36±0.21）分，相对梗死体积为（25.36±3.65）％；MCAO组小鼠逃避潜伏期明显长于假手术组，穿越原平台位置次数明显少于假手术组（P<0.05）；小鼠头部MRI T2加权像可见缺血侧皮质和/或皮质下梗死病灶。

结论：线栓法是简单、可靠的制作小鼠MCAO模型的方法。

【关键词】小鼠；大脑中动脉栓塞；动物模型Establish and Optimize Middle Cerebral Artery Occlusion Model in MiceTANG Ying-xin▲, LIU Min-zhen, DING Feng-fei, ZHANG Qiang, WANG Wei, P AN Deng-ji.▲Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China 【Abstract】Objective: To establish and optimize middle cerebral artery occlusion model in mice. Methods: Fifty C57BL/6J mice were randomly divided into sham group (n=10) and MCAO group (n=40). The mice in MCAO group were used to establish the MCAO model by intraluminal occlusion using monofilament.Twenty-four hours after operation, the nervous function was evaluated and the infarct volume was calculated by TTC staining. Thirty days after operation, Morris water maze test was carried out to investigate spatial learning and memory of mice. Ninety days after operation, head MRI scan was conducted. Results: In MCAO group, the successful rate of execution was 67.5%. The neurological deficit score was (2.36±0.21) and the relative infarct volume was (25.36±3.65)% in MCAO group.Mice in sham group performaced better in water maze task than those in MCAO group.T2-weighted MRI imagines showed infarction clearly. Conclusion: Intraluminal occlusion of MCA using monofilament is a kind of simple and reliable method to establish mouse MCAO model.【key words】mice; middle cerebral artery occlusion; animal model大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型是目前使用最为广泛的、研究局灶性脑缺血再灌注损伤的理想模型。

线栓法[1]是制作MCAO 模型常用方法，大鼠是最常用的模型动物。

随着基因技术的发展，越来越多的研究选择转基因或基因敲除小鼠为实验动物，但关于构建小鼠MCAO模型的研究不多[2,3]。

本研究对小鼠MCAO模型进行一定的改良并进行相关评价。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物雄性C57BL/6J小鼠50只，体质量20～25 g，随机分为假手术组10只，MCAO组40只，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂与材料2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride, TTC）（购于Sigma公司）；1-FR型动物手术显微镜（购于Zeiss公司）；三洋牌渔线（直径0.128 mm）（购于三洋渔具公司）；硅橡胶（PROVIL NOVO）（购于Heraeus Kulzer公司）；水合氯醛（购于北京化学试剂公司）；7.0T 磁共振仪（购于Bruker BioSpin公司）。

1.2 方法1.2.1 线栓制备将渔线切割为2.5 cm长度/段，将硅胶均匀裹于鱼线表面，直径≤0.2 mm，手术显微镜下仔细将线头修整圆润，避免毛刺，线栓即制作完毕。

1.2.2 小鼠MCAO模型建立MCAO模型制备参照Connolly等[4]和Hata等[5]的方法，根据小鼠体型及血管直径的不同而进行改良。

10％水合氯醛腹腔麻醉（0.35 mL/100g）小鼠，仰卧于可以加热的护垫上；在手术显微镜下，行颈部正中切口，分离皮下组织，暴露右侧颈动脉鞘，小心将颈动脉和迷走神经分离，其间注意避免牵拉损伤迷走神经；细心游离颈总动脉至分叉处，结扎颈外动脉和颈总动脉，用血管夹夹闭颈内动脉；用显微眼科剪自颈总动脉近心端剪开，将线栓沿颈总动脉插入颈内动脉约10 mm左右，稍遇阻力时停止，以阻塞同侧的大脑中动脉；于颈总动脉切口上方用丝线固定线栓。

彻底止血，逐层缝合肌肉和皮肤；将动物置于饲养笼中，注意保温，待其苏醒。

缺血1 h后将线栓取出。

假手术组采用同样的手术操作但不插入线栓。

手术操作过程中维持肛温在（37.0±0.5）℃。

1.2.3 神经功能评分术后24 h采用Bederson评分[6]进行神经功能评定：未见行为缺陷为0分；前肢屈曲（即提尾悬空实验阳性）为1分；侧推抵抗力下降（即侧向推力实验阳性），伴前肢屈曲，无转圈行为为2分；同2分行为，伴自发性旋转为3分；没有自发的活动为4分。

评分≥2分，表明大脑中动脉阻塞成功。

1.2.4 脑梗死体积采用TTC染色观察脑梗死体积。

术后24 h，随机选择假手术组小鼠2只及MCAO组小鼠6只进行TTC染色。

小鼠麻醉后断头取脑，用冰生理盐水冲洗，置-20 ℃冰箱20 min；取出后，切成6片，1 mm/片；置于37 ℃预热的0.5％TTC溶液中孵育20 min，期间每5 min翻动1次脑片；孵育结束后，脑片置于福尔马林固定，数码相机拍照；正常组织染成红色，坏死组织不着色呈白色；IPP软件进行图像分析。

公式V=t(A1+…A n)-(A1+A n)t/2算出梗死体积，其中t为切片厚度，A为梗死面积。

1.2.5 远期学习记忆功能评价术后30 d，采用Morris水迷宫测试小鼠远期学习和记忆功能。

随机选择假手术组小鼠8只及MCAO组小鼠10只进行水迷宫测试。

水迷宫实验过程分为隐藏平台获得实验（hidden platform acquisition training）和空间搜索实验（probe trial testing）2部分。

水迷宫为圆形不锈钢水池，直径100 cm，高50 cm，等分为4个象限；隐藏的平台位于第3象限中央；平台直径7 cm，高30 cm，整个实验期间保持其位置不变；平台低于水面1 cm，水中加250 g脱脂无糖奶粉，以隐藏平台，水温保持在（23.0±2.0）℃。

隐藏平台获得实验：用于测量动物在水迷宫中的学习和记忆能力。

实验历时5 d。

每天训练3次，每次60 s，随机从1、2、4象限中选择1个作为入水点，将动物面向池壁放入水中，记录动物寻找并爬上平台所需时间，即逃避潜伏期（escape latency）。

若动物在60 s内未找到平台，则将其引至平台停留30 s，逃避潜伏期记为60 s。

每只动物共计训练15次，计算每天各组3次逃避潜伏期的平均值。

空间搜索实验：用于测量动物对平台空间位置的准确记忆，即记忆保持能力。

第5天撤掉平台，任选1个入水点将动物放入水中，动物在水中游泳60 s，测量60 s内动物穿越原平台位置的次数。

1.2.6 头部磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）检查术后90 d行头部MRI检查，观察梗死灶及脑组织情况。

1％氟烷-氮气/氧气（70％:30％）混合气体，吸入麻醉小鼠，将小鼠固定于扫描床并保持体温，头部固定，使用发射/接受一体化线圈，T2加权像扫描，回波时间70 ms，重复时间3 s，采样矩阵128×256，视野30 mm×30 mm，扫描层厚0.75 mm，层间距0.8 mm，共10层。

1.3 统计学处理采用SPSS 13.0软件处理数据，计量资料以（X—±S）表示，组间比较采用独立样本均数t检验，隐藏平台获得实验中的逃避潜伏期采用重复测量单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 神经功能评分手术前所有小鼠神经行为表现均正常。

术后24 h，假手术组小鼠无神经缺失症状，神经行为学评分为0分；MCAO组小鼠中出现神经功能缺损症状的为27只，表现为左前肢屈曲、站立不稳和前进时向左侧倾斜，神经功能学评分为（2.36±0.21）分。

2.2 脑梗死体积术后24 h，假手术组经TTC染色呈均一红色，未见白色梗死灶；MCAO组见缺血侧皮质及/或皮质下白色梗死区，其相对梗死体积为（25.36±3.65）％，见图1。

A B图1 假手术组（A）及MCAO组（B）小鼠脑TTC染色结果2.3 水迷宫测试结果①隐藏平台获得实验：经过5 d寻找隐藏平台训练，各组小鼠的逃避潜伏期均显著下降。

所得测量数据在各时间点的数据进行球形检验，P＞0.05，资料满足Huynh-Feldt条件，采用重复测量设计资料的单变量方差分析处理资料。