木质纤维素的酶水解

木质纤维素的酶水解

Biological conversion of cellulosic biomass to fuels and chemicals offers the high yields to products vital to economic success and the potential for very low costs. Enzymatic hydrolysis that converts lignocellulosic biomass to fermentable sugars may be the most complex step in this process due to substrate-related and enzyme-related effects and their interactions. Although enzymatic hydrolysis offers the potential for higher yields, higher selectivity, lower energy costs and milder operating conditions than chemical processes, the mechanism of enzymatic hydrolysis and the relationship between the substrate structure and function of various glycosyl hydrolase components is not well understood. Consequently, limited success has been realized in maximizing sugar yields at very low cost. This review highlights literature on the impact of key substrate and enzyme features that influence performance, to better understand fundamental strategies to advance enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass for biological conversion to fuels and chemicals. Topics are summarized from a practical point of view including characteristics of cellulose (e.g., crystallinity, degree of polymerization and accessible surface area) and soluble and insoluble biomass components (e.g., oligomeric xylan and lignin) released in pretreatment, and their effects on the effectiveness of enzymatic hydrolysis. We further discuss the diversity, stability and activity of individual enzymes and their synergistic effects in deconstructing complex lignocellulosic biomass. Advanced technologies to discover and characterize novel enzymes and to improve enzyme characteristics by mutagenesis, post-translational modification and over-expression of selected enzymes and modifications in lignocellulosic biomass are also discussed.

基于酶水解技术基础上的纤维素乙醇生产技术是20世纪80年代生物质技术的主要研究领域，自从20世纪70年代“能源危机”之后，美国能源部一直积极支持规模以上乙醇生产，并建立独立部门用于管理和支持这项工作。虽然通过纤维素酶水解纤维素生物质产生的生物燃料和化学产品提供了更高的收益率，较高的

选择性，降低能源成本以及相对化学过程更温和的操作条件等，但是这种技术在那个时代依然被判定为高风险行业[1]。然而新兴生物技术为纤维素乙醇生产成本降低并使其更具有竞争性提供了重要的保证。改进的稀酸预处理方法和二战时期发现的纤维素酶生产菌Trichoderma reesei是20世纪80年代纤维素乙醇历史性成本降低的主要原因[2-4]。Rutgers University通过经典突变技术和菌种选育获得了来源于野生型T. reesei QM9414的著名纤维素生产菌株Trichoderma reesei Rut30[5]。杰能科公司的纤维素酶150 L非常高效是因为β-葡萄糖苷酶的水平大幅提高[6，501]。最近宣布糖苷水解酶成本显着改善多达20至30[7,8]。

值得注意的是自然环境中大多数的细菌和真菌具有生产生物质水解酶的能力。纤维素相关微生物进化形成了具有完全降解能力的微生物个体以及作为某些微生物群落中生物质水解反应链中某一环节的微生物个体。通过这些微生物分泌的纤维素酶被分类为糖苷水解酶（GHs），其中也包括某些具有木素修饰能力的酶。酶和微生物的结合在不同的生物质水解生态系统中是动态变化的，这依赖于初始的生物质资源和环境影响因子。通过已有的生物技术，发现以及改良新的酶资源，并使这些酶具有新的特性就具有了更大的潜力，这些特性包括平衡协同基础上更高的特异活性，更好的热稳定性，更好的抗抑制能力以及改进的多种组合（如纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶以及蛋白酶）酶活性以获得低成本前提下的高产量的复合糖。

不幸的是，纤维素乙醇生产技术尚未被商业化的部分原因至少是因为从具有天然生物结构屏障的纤维素材料中释放糖具有极大的困难[9,10]。其结果是水解时需要大量的酶制剂，根据每g经过预处理的纤维素通常需要使用15 FPU剂量纤维素酶实现经济的糖产量换算，相当于制成1L的生物乙醇需要大约30g纤维素酶。图1说明了酶蛋白的生产成本（美元/千克酶）和包括所需要所有酶种类情况下必须用于乙醇的成本关系（美元/加仑的乙醇），这一数据包括不同的酶达到同样乙醇产量所需要的成本（数据来源于国家可再生能源实验室报告的数据）[11]。因此，为了实现预期的生物乙醇成本目标（$0.10/加仑或更低），美国能源部计划将酶的成本控制在低于$ 2/kg，并大幅削减产量高所需的酶负荷即提高酶的效率或者两种战略并行实施[12-14]。此外，酶水解机制以及限制水解效率的因素还不清楚，这也使许多的商业应用因此受到了一定的限制[15]。提高对生物

质及其水解酶的结构和功能的认识将对确定影响木质纤维素生物质转化和生物预处理，水解以及酶对生物质转化中的作用以及制定适当的策略以实现高糖得率和低酶用量起到重要的作用。

酶的水解效率是由纤维素的结构特点和酶作用机制决定的。虽然过去的几十年里通过大量的研究，在酶的结构，酶分子性质以及纤维素超微结构等方面掌握了一些细节的知识，但是由于纤维素底物结构的复杂性以及酶组分的多样性，纤维素底物的水解机制至今仍然未被完全了解。因此，本文着重对目前预处理生物质的特性以及影响糖释放的糖苷水解酶的主要特点进行综述，并建议进一步推进如基因组学，蛋白质组学和显微技术等新兴技术对生物质转化的研究。

底物相关因素

这一节的目标是对新近获得的对生物质结构性质和相关酶的特征的研究进展进行综述，同时提供通过改善底物结构影响酶水解的研究视角。生物质具有许多妨碍自身被酶解的结构特点。大多数的生物聚合物，包括纤维素，半纤维素和木质素在细胞壁中不是孤立存在的，它们之间形成紧密的相互联系[16]。木质素和碳水化合物（如纤维素和半纤维素）形成木质素-碳水化合物复合体[17]。最近

的研究显示在草本植物中，聚糖-木质素交联通过阿魏酸连接到阿拉伯木聚糖上。阿魏酸修饰的半纤维素为木质素的增加提供了使木质素锚定在植物细胞壁多糖上的结合位点，这样的结构可能使植物细胞壁具有屏障作用[18–20]。木质素这种结合在纤维素纤维上形成的复杂结构降低了酶接触纤维素的可能性[21]，但是这种结构至今还没有被清楚地认识。为了完全的降解这种植物细胞壁中的异质性结构需要多种酶的协同作用，包括纤维素酶，半纤维素酶，辅助酶以及木质素修饰酶。我们目前的知识结构不足以使我们理解整个纤维素生物质酶水解的过程，目前获得的大多数实验结果都是来自于：纯酶组分作用于纯底物或者复合酶组分作用于热化学预处理的生物质。

纤维素的特点

酶水解纤维素的主要商业用途是水解纤维素和其他聚糖类物质并产生可发酵糖，这些可发酵糖包括葡萄糖和/或寡糖，这些水解产物可以通过进一步的生物或化学方法转换成有价值的产品。虽然由于其他物质以及经预处理后的纤维素衍生物的出现（例如半纤维素和木质素）使纤维素酶水解过程变得更加复杂，但是了解纤维素本身的主要结构特点对酶水解速度和效益的影响仍然是必须的。

由于极小的尺寸，以及与其他基质聚合物（主要是半纤维素和木质素）形成的紧密交联，要准确的描绘植物细胞壁中纤维素的结构是十分困难的。纤维素可以被视为建立在纳米层次上的微纤维复合材料。利用先进的成像技术如原子力显微镜（AFM）可以完成天然状态下对纤维素精确的测量和详细的表面结构研究。基于原子力显微镜技术对植物细胞壁[22-24]的研究显示，微纤丝的直径约为3-5nm，根据推测的含有36个纤维素合成酶的纤维素酶复合体（玫瑰花样），微纤丝含有36根链（CEF）。从AFM成像中发现一个有趣的现象是大原纤维仅存在于初生细胞壁的最外层。大原纤维由一束微纤丝组成，在这束微纤丝末端出现分裂并形成更小的微纤丝束直到最终的单根微纤丝。每根在成熟初生细胞壁中观测到的微纤丝包含一根链，在这根链外层还交联结合了一些半纤维素[25,26]。玉米细胞壁的新鲜细胞的原子力显微镜图像进一步证实了这一观察[27]。图2显示了植物细胞壁的合成原理模型。

在这个模型中，至少需要3种纤维素合成酶（CESA亚基，A1，A2和B）通过自发的形成6×6CESA酶才能完成[28]。每个酶复合体合成36根CEF。基于纤维素Iβ结构估测的CEF束的尺度为3 × 5.5 nm，并且这一数值与AFM实测值相同。一定数目的CEFs形成束并称为微纤丝。其他胞壁聚合物的沉积，主要是半纤维素，在细胞生长过程中完成，这种沉积作用导致大原纤维分裂形成含有表面半纤维素的微纤丝[25,26]。

纤维素酶测定使用的底物要是纯纤维素（如Avicel或者Sigmacell），当然这种纯纤维素不可避免的含有少量其他的聚糖，主要包括半纤维素。无论纤维素制备过程中其自身来源和纯化方法如何要求，纯纤维素的结构特点都随着结晶度，聚合度以及表面结构发生变化这可能会显著影响酶水解。

结晶度

纯净的纤维素是由纳米级别的微纤丝组成的毫米级别大小的颗粒（图2）。

一般认为纤维素颗粒由结晶区，半结晶区（无序）和无定形区组成。历史上，一些报道证实无定形纤维素能够迅速被纤维素酶降解形成cellobiose，而结晶区纤维素水解过程要慢得多。因此一些学者提出纤维素水解速率取决于纤维素的结晶程度[29-32]。虽然某些研究证明随着结晶度的增加水解速率下降[33-35]，而同时其他人却发现了相反的效果[36-38]。根据预测，结晶纤维素水解导致更多半结晶区和无定形纤维素去除[38-40]的结果，从而使结晶度增加。但是在某些研究中纤维素水解过程中结晶度没有显着的变化[41,42]。一些报道认为纤维素的结晶度不影响水解的效率[37,43-49]。

另据报道纤维素的结晶度也影响到酶的吸附作用，这一结果将影响水解速率和可发酵糖产率。增加的水解速率和产率（>100倍）被证明是与较高的无定形区比例相关的[35,39,50-55]。许多实验结果显示酶的吸附作用，包括整个糖苷水解酶系统，纤维素结合结构域（CBM）以及单一的酶组分都随着纤维素结晶度的提高而下降。最近，Joeh和同事发现结晶度极大地影响了Cel7A（CBHI）吸附，导致水解程度的下降[55]。Hall和同事发现初始酶水解率随结晶度下降而上升，而吸附酶浓度保持恒定[42]。此外，不同纤维素酶组分已被证明有不同的吸附电能力和纤维素酶活性[50,51]。纤维素内切酶（EGI）是一种用于进攻并优先吸附在无定形区纤维素的酶，似乎具有相同的吸附能力，并且在两类纤维素的研究中活性大大高于CBHI。类似的模式在丁，徐[56]的研究中也存在。此外，Banka 和Mishra发现在瑞氏木霉中结晶度上升将导致一种非水解蛋白质的结合能力提高，这种蛋白质命名为纤维形成蛋白[57]。这样的结果表明纤维素的结晶度对非水解酶组分具有重要影响，它可以有效的影响纤维素酶水解。

纤维素结晶度不仅仅影响纤维素酶的吸附，同时还影响了纤维素酶组分的吸附效率。文献报道纤维素的结晶度影响了纤维素酶的协同[42,51,58–66]。Hoshino 等发现瑞氏木霉中EGII和CBH1之间协同作用将随着结晶度的上升而增加，最高的协同作用出现在结晶度达到约1.0时。在另外一项研究中，Igarashi和同事发现天然结晶纤维素聚合区影响CBHI的水解能力[67-69]。另外Mizutani[70]和Gama以及Mota [71]展示表面活性剂对纯纤维素糖化过程的增加是通过影响结晶度实现的。

一些研究针对纤维素酶水解过程和结晶度之间的关系开展。瑞氏木霉酶系中

的主要酶CBHI的酶解过程受到结晶度的影响。通过对纤维二糖和葡萄糖比例关系间接反应的酶解过程的粗略估计发现，细菌纤维素和无定性纤维素分别有23和14个纤维二糖单元形成[72]。在另一项研究中，CBHI from T. reesei酶解过程分别是88 ± 10, 42 ± 10 and 34 ± 2.0二糖单元分别对应于细菌纤维素（CrI ~88），BMCC(CrI ~92)以及内切酶处理过的纤维素(unknown CrI)[73]。目前还需要更多的证据证明结晶度对酶水解过程和酶效率的影响。

聚合度

一些研究和文献讨论在不溶性和可溶性纤维素中改变DP后，底物被一套完整的纤维素酶或纯化的酶组分水解的影响[43,44,51,52,74-80]。然而，对纤维素链长度对水解过程的影响了解仍然有限。Sinistyn等研究表明通过G -辐照降低棉绒聚合度的同时保持结晶度不变时对水解速率的影响可以忽略不计[35]。Zhang and Lynd [81]的动力学研究发现降低聚合度导致的水解速率的提高要大大小于增加β糖苷键可及度所产生的水解速率提高的效果。在不溶性纤维素中Nidetzky 等[82]发现随着聚合度的提高纤维寡糖被CBH1水解的初始速率逐渐提高，到纤维六糖之后基本保持不变[82]。类似的报道在CBHII和EGI作用于纤维糊精时也被发现[51]。此外据报道β-葡萄糖苷酶的活性会随着DP降低而减少[83,84]。然而并没有可靠的结果证明不溶性底物聚合度在纤维素酶催化效率方面的影响，除了较高的DP可能会导致更高CBHI和EGI [65,81,85,86]之间的协同作用之外。此外，纤维素的聚合度可能影响了酶水解进程的反应数，在短链上的全过程的CBHI水解可能是不准确的[61]。目前仅仅获得极少的数据证明聚合度影响了纤维素酶的吸附。Kaplan等证明随着某些开环棉花纤维素DP降低而导致的减少水解会使纤维素酶的吸附显著下降，然而这一过程中结晶度没有受到影响[87]。考虑到CBHI在全酶系中占有的巨大比例（>65%）以及它的偏好性[82,88-91]可以快速得出结论DP的降低快速提高水解速率的原因是产生大量可供CBHI结合的末端，因此提供了一种通过降低DP的方法提高酶水解效率和产率的方法。

纤维素酶可接触的表面

纤维素酶接触纤维素的能力受限于纳米层次的纤维素微纤丝结构（图2）。

纤维素链之间的交联以及微纤丝被大量的基质多糖和木质素包被的结构赋予天然细胞壁额外的结构抗性，然而同时也使纤维素酶的降解变得更加复杂[92]。虽然在纤维素纯化和制备中结构经过大量修饰，但是细胞壁微纤丝的直径仍然保持在3-5纳米的水平上，与初始状态相同，但是这些微纤丝的长度被降低到几百纳米（图2）。纤维素酶的可及度受到两个因素控制和影响，首先是纤维素酶可以接触到的微晶纤维素的表面，也就是CBHI的碳水化合物结合模块只能够接触到具有亲水特性的纤维素面[93-95]。。第二个限制因素是植物细胞壁的解剖结构，这种结构也可以影响纤维素酶的可及度，尤其是植物细胞壁中出现的允许纤维素酶进入植物细胞组织并接触到微纤丝的那些孔洞。预处理的重要影响之一就是可以扩大这些孔的尺度并促进纤维素酶进入生物质。

基于纤维素酶水解反应是一种表面反应的前提，纤维素酶可攻击的纤维素表面应该是对纤维素酶解最有影响的生物质结构特性，这一特性会影响纤维素酶对纤维素表面的吸附以及随后的纤维素酶的水解过程[16，96-101]。许多论文讨论了在这种背景下可用的孔体积和比表面积[51,44]。可及度也可以与其他底物结构因素相联系，如纤维素的结晶度和聚合度等。然而一些研究证明孔洞体积[44,101-105]和纤维素颗粒大小[37,103,106-108]也会影响纤维素水解。尽管如此，由于一些细菌纤维素酶如多酶复合体纤维小体具有100倍于真菌纤维素酶的尺寸，但却表现出高于真菌纤维素酶的水解效率，这样看来微孔的作用就不那么重要了[50，109]。此外根据观察，纤维素酶组分并没有渗透到微孔中[110]，微孔体积与降解能力并没有任何关系[111]。颗粒大小对纤维素酶吸附[112-114]和水解[47，115]的影响极小，但是随着纤维素片段化的加速伴随的小颗粒纤维素的形成的影响则不能排除。相反，它表明较大的颗粒可以抑制有效的水解[116]。另一方面，各种DP和结晶度对酶解效率影响的研究表明预处理底物的酶解效率不能轻易地根据DP或结晶度差异来预测[37，117]，这可能是由于真实纤维素的底物的结构复杂性导致的。然而，纤维素酶可及度可以提供一个有用的视角，并帮助人们确定预处理的方法，并通过研究确定并改善预处理方法。

纤维素反应以及酶功能的转换

全酶法水解实验中酶的水解效率大大降低，同时单位数量的酶在水解过程中

可水解生成的可发酵多糖的产量也大幅降低，而且长时间的低效水解不能简单地通过产物抑制作用来解释。这一过程的机制还不清楚[118119]。除了酶相关的因素，如纤维素酶的热稳定性[120-123]，产物抑制[120,124-128]，酶失活[125,129-135]，酶降速/停止[136]外，底物相关因子包括底物转变成不易被水解的形式[137]以及底物结构的异质性[137，138]也与这种现象有关。之前对于反应速率降低的解释是底物中更易于被水解的部分具有被优先利用的可能[137]，但是另一方面，一些报道得出的结论是底物的反应性并不主要由长时间驻留需要纤维素良好的转化导致[136]。

目前通过利用“中断”和“重新启动”实验以确定控制纤维素水解的影响因素[136-141]。重启实验利用蛋白酶移除纤维素酶，之后添加蛋白酶抑制因子用于在纤维素在初始条件下重新开始水解之前解除蛋白酶活性，通过这种技术可用于了解纤维素水解动力学过程中反应能力丧失的原因[142]。吸附于Avicel之上的酶的水解速率在进行这种重启实验后保持不变，但是连续的水解速率下降。因此纤维素连续水解过程中水解速率的降低不能归结于底物反应特性的变化，同时其他酶相关影响，如酶降速是被阻拦或者人为干扰可用于解释这一现象[142，143]。

利用这种酶重启方法，CrI纤维素的纤维素转换在5小时内缓慢增加到80%[144]。中断实验的AFM成像显示随着酶解的进行，Avicel的表面变得光滑和平坦（图3）。新的“重启”方法使获得酶水解过程中酶和纤维素之间的动态相互作用信息变得更容易。

不溶物分布

纤维素，半纤维素和木质素是植物细胞壁的主要聚合物，任何影响这些组分结构的修饰或去除过程都可能会影响酶的水解效率。然而，实验结果产生了巨大的差异。 Grohmann等人和其他研究者的研究结果显示去除半纤维素与纤维素的葡萄糖产量之间存在直接关系[111,145-150]，但其他研究并不支持去除半纤维素能够改变纤维素水解速率的结论[151-154]。同样，关于木质素去除能否提高纤维素水解速率的讨论也产生了截然不同的结果相[102,155-157]。所有植物细胞壁结构及成分在预处理过程中都会被不同程度的改变，根据所使用的技术和条件，通过微纤丝改变，移除半纤维素，修饰或者移除木质素，或者其他影响底物结构的因素来推断这些因素能够影响酶解效率都是不准确的。

半纤维素

半纤维素的去除能够显著的提高纤维素的水解速率，这一结果暗示半纤维素是阻碍纤维素酶水解的关键屏障[157]。同时预处理过程中的木质素改变会严重影响半纤维素的作用[102，155，158，159]。从更实用的角度出发，虽然液氨气爆过程中可能会使半纤维素发生一定的程度的修饰，但是像液氨气爆（AFEX）等预处理过程仍然可以在不去除具有影响作用含量的半纤维素的前提下产生大量易降解的纤维素[160-162]。之前的研究极少考虑底物乙酰化程度。在多种类型的生物质中半纤维素都被大范围的进行乙酰化修饰，根据报道去乙酰化将能够使纤维素的水解效率提高3倍以上，不同的报道中对去乙酰化程度影响酶水解速率的提高存在一定的差异[163，164]。一项研究表明当去乙酰化程度达到75％时，这种影响似乎就变得不那么重要了，而另一项研究显示完全移除切除半纤维素将能够持续提高纤维素的水解效率[156，165]。 Grohmann和同事发现移除白杨木和麦秸中的乙酰酯使其的降解效率提高了5至7倍。Kong等观察了在保留木质

素和聚糖的前提下，白杨木中乙酰去除程度对纤维素消化能力的影响[165]。Zhang和Holtzapple应用上述类似的方法进行研究但结果表明，去除乙酰键对提高降解效率的影响要小于结晶度和/或木质素去除[166]。此外，Weimer等人的研究认为木聚糖和纤维素的紧密联系并不抑制聚糖的生物降解性[167]。移除半纤维素的同时也移除乙酰基将会改变脱离的木质素的形式，这将使确定何种因素影响了水解能力的提高变得困难。不幸的是，半纤维素的去除或者多糖网络的破坏目前仍被看做是可以增强降解效率的生物质预处理手段，并进一步的进行着讨论。

这些研究使我们相信，即使将纤维素变得完全可及，这些纤维素酶也无法有效的水解纤维素，除非包括半纤维素和乙酰化作用的复杂的生物质组分组成的网络被破坏[168-170]。Jeoh和他的同事通过对荧光标记的CBHI分子对纤维素接触能力的观测发现在去除木聚糖后，这种水解能力有了一定提高[55，171]。Pan等认为纸浆中的乙酰基团可能会通过阻碍键的形成影响纤维素酶接触纤维素，这可能是由于纤维素直径的增加以及变化的疏水性所致[168]。然而目前并没有足够的证据证明通过去除半纤维素和去乙酰化能够影响纤维素酶的吸附。另外最近的研究结果表明木寡糖是纤维素酶的强抑制剂，在水解过程中的大量释放将降低水解效率，在预处理中移除它们是十分必要的[172，173]。脱乙酰化可能会间接地影响纤维素酶水解生物质的效率，因为移除乙酰基以及其他取代基团之后可能会提高木聚糖被木聚糖酶水解的效率[156,174-178]，并导致纤维素的降解效率的提高[179-182]。因此虽然木聚糖移除的作用在增加纤维素降解的过程中是模糊的，但是在经济效益和技术原因指导下预处理中木聚糖的移除仍具有积极的意义，如回收率提高的木糖生产，降低木寡糖的抑制作用以及在生物质生产中减少半纤维素降解和相关酶应用的过程[183，185]。。

木质素

木质素与纤维素结合在一起，是具有优良性能的复合结构，但同时也降低了纤维素酶结合纤维素的能力[21]。虽然在木质素去除程度上存在差异，但多种报道都证实木质素的移除会显著提高纤维素的水解[44，102，157，186]。木质素种紫丁香基以及愈创木基的比例也明显影响了水解效率[187]但是木质素影响纤

维素水解的重要性仍难以确定。最显著的闲置之一是木质素阻碍纤维素的膨胀以及阻碍纤维素的可及[116，188，189]。人们一直认为在预处理中半纤维素的去除过程伴随着木质素的解聚以及重聚过程，毫无疑问在不同的形态下可能改变木质素对纤维素消化的影响[117，190-192]。去除木质素不经增加了纤维素的可及度，而且增加了更多的纤维素酶作用[157]。木质素以及它们的衍生物通过价键沉积并连接到蛋白质上[16]，也有报道指出木质素可以吸附液体中的蛋白质[193]。由此看来木质素可能通过物理和化学手段抵抗纤维素酶对纤维素的攻击。木质素不仅影响着纤维素酶的吸附，同时也作为一个纤维素酶的障碍，限制水解的作用[194]。因此，木质素去除可能同时打开更多的空间用于酶和减少酶非特异性吸附在木质素上[157]。低水平的木质素已被证明能够提高纤维素水解，这是由于物理分离导致微纤丝接触酶的能力的增强以及提高的酶活性[16,55,157]。基因改造的生物生物质中的木质素修饰将导致糖基化水平的下降，以及可发酵糖产量的降低[18]。

我们最近的研究显示纤维素的酶水解与半纤维素和木质素的移除相关。比如，经过多次CAFI不同处理的玉米秸秆显示出相同的酶解能力，虽然不同预处理技术会使半纤维素和木质素的去除程度发生变化[21,195]。木质素在固体底物表面的重新定位和修饰将导致最终木质素的去除程度降低[16]。虽然某些研究显示木质素的去除和纤维素水解之间存在明显的线性关系，另外的一些研究却证明移除木质素对纤维素的降解并没有影响[196]。比如AFEX预处理固体底物时，底物中半纤维素和木质素的去除非常有限，要取得与稀酸预处理的相同结果所需要的酶的数量很少，稀酸处理的底物中几乎没有半纤维素残留，同时木质素几乎没有去除[160]。总之木质素的去除要比半纤维素的溶解更加重要，而后者可能更多地为表征去除的木质素的含量设定了一个参照，并用于提高纤维素的降解[194].

这些实验结果是我们相信木质素的修饰可以明显的提高纤维素的降解，并且木质素的移除提供了更多的益处[157]。移除木质素会增加纤维素的可及度，并降低无关酶的结合，因此能够提高酶水解的结果[16]。有趣的是，最近的木质素模块技术为打破纤维素-木质素-半纤维素的结构提供了新的视角，并且可以完全释放易降解的纤维素和半纤维素用于酶水解，而不是通过去除木质素及其衍生物

实现相同的目标[16，197]。

虽然这些研究认为木质素在纤维素水解过程中的影响是巨大的，但是至今人们对木质素在异质化生物质的酶水解过程中的作用仍然不清楚。然而，纤维素糖化过程开始水解之前移除木质素在技术和经济角度可能是有益的，因为木质素将导致许多的酶的无效结合，并抑制发酵过程[50]，还可能在更大规模的固体装料时产生更多的问题[198,199]。目前并不了解木质素的移除或者打乱它与糖的紧密结合是必须的。Grabber和他的同事证明抑制真菌水解的过程并不是木质素导致的[200]。然而，木质素浓度和它与木聚糖通过阿魏酸的链接将显著的影响细胞壁的水解[201,202]。木质素浓度在烟草茎细胞壁降解过程中的负影响在另一篇报道中由Sewalt等完成[203]。

Ooshima和他的同事观察发现高温下稀酸处理将导致木质素的收缩和聚集，并使纤维素酶能够吸附在纤维素上[134]。其他的研究也证明了这种木质素的溶解和重新定位[204,205]。最近的研究中，Selig等解释了木质素液滴在高温稀酸或者水处理时可能仅仅移动到表面并阻碍纤维素酶的吸附[206]。Yuldashev等发现棉花茎(cellulose: 44% and lignin: 26.4%)表面的纤维素酶数量要少于粉碎的棉花茎(cellulose: 92% and lignin: 0.6%)，出现了一个明显的下降；然而，木质素并不能够使游离的或者结合的酶失活[207]。在另一项研究中，Ishiharaand和同事发现在蒸汽处理的shirakamba wood中木质素降低了酶的吸附但是并没有影响糖的转化[208]。通过氢氧化钠有限的去除麦秆的木质素会增加纤维素酶的吸附[209]。相反的，Mooney研究了在四种不同类型的纸浆中木质素含量对纤维素吸附能力的影响，结果证明木质素的比例并不影响纤维素酶的吸附[210]。然而，Selig和同事发现木质素液滴沉积在纤维素上之后会与水相互作用并形成一层界面，阻碍纤维素酶的运动[205]。同时，木质素与纤维素的连接会阻碍纤维素酶的运动。虽然木质素可能降低纤维素水解中具有活性酶的数量，但是木质素对酶吸附的有效性的影响还需要进一步说明。

衍生的可溶性物质分布的影响

人们的关注焦点是从固体生物质中移除半纤维素和木质素，这些成分形成了明显的物理屏障阻碍纤维素与酶的结合，但是目前仅有极少的工作在理解可溶性

底物(如糖，寡糖，糖降解产物以及木质素衍生物)在预处理过程中如何释放以及它们的酶水解对纤维素的酶水解有何影响。此外，在大多数研究中，预处理的固体纤维素生物质被分离并被水洗来获得预处理对纤维素降解率的影响评价。另一方面，酶水解预处理的全部底物，包括预处理剩余的固体和液体（至少是部分固体）将会极大的降低成本。即使增加水洗的步骤，可溶性物质从预处理固体中释放的浓度在水解时随着固体底物浓度的增加而增加。然而，根据报道，通过酶水解形成的纤维素转化量会在不进行水洗时有所下降[211]，预处理水解物被添加回预处理固体[212]或者全部预处理物(i.e., 预处理固体和水解物)有利于酶水解[213–217]。这些结果显示预处理水解产物对纤维素酶水解有抑制作用。

研究表明预处理水解产物中的部分成分，通常含有木质素，来自半纤维素的低聚糖，糖，以及木质素降解产物对纤维素酶以及微生物活动具有抑制作用[175,218–221]。Kim等发现氨水循环处理的玉米秸秆包含有木寡糖，可溶性木质素，糖和木质素降解物，并且严重阻碍了纤维素酶和微生物的活性[222]。然而，至今为止仍然不知道其中的什么成分影响了酶的水解，或者它们是如何作用的。最近Kumar和Wyman的工作揭示木寡糖严重的抑制了纤维素酶的作用[176]，紧接着的另一项研究显示木寡糖的抑制作用大大高于葡萄糖和纤维二糖，同时木寡糖的链长越长其抑制作用越明显[175]。这项研究也说明可溶性的木寡糖对纤维素酶具有强烈的抑制作用并且这种作用那个随着浓度的提高而增加[175]。同时研究认为来自于木聚糖的可溶性产物，包括木寡糖和木糖强烈抑制了葡聚糖的水解，并且这种抑制作用高于木聚糖和果胶质[223]。木寡糖强烈的抑制纤维素酶在Avicel中的吸附(Shi et al., Unpublished Data)。其他来自于半纤维素的糖，比如甘露糖和半乳糖可以抑制纤维素酶和β-葡萄糖苷酶[224]。另外的研究认为预处理水解产物中的糖是酶水解的主要抑制剂，而其他可溶成分，包括乙酸，酚类化合物以及呋喃对纤维素酶水解有轻微的抑制作用[225]。

可溶性木质素衍生物不仅能够影响微生物，而且对包括纤维素酶和β-葡萄糖苷酶等酶组分也有强烈的影响[226–238]。Mendels and Reese发现通过取代酚具有一定的抑制纤维素酶的作用[233]。Panagiotou和Olsson试验了多种化合物（包括呋喃，酚和低分子量的酸），认为蚁酸可以使纤维素酶完全失活[239]，是最强烈的抑制剂。由于试验中采用的木质素处理物是部分可溶的，因此观察到的对纤维

素酶的抑制作用可能是由于纤维素酶吸附在部分的木质素组分以及溶解的少量木质素上导致[226]。可溶性的酚类物质，包括香兰素，紫丁香醛，反式苯乙烯酸以及羟基苯甲酸，都是纤维素水解的抑制剂[223]。在这项研究中，香草醛对Spezyme CP和Novozyme 188混合物具有强烈的抑制作用，而羟基苯甲酸对单酶具有强烈的抑制作用。另一方面，可溶性木质素产物（香草醛，紫丁香醛以及4-羟基苯甲醛）以及羧酸具有较少的纤维素酶抑制作用[221]。

酶相关的因子

酶水解纤维素的典型特征是不溶性底物被可溶性催化剂水解，这一过程不仅仅受不溶性底物结构特征的影响，而且酶的相关因素，包括酶资源，产物抑制，热稳定性，协同过程中的活性平衡，比活力，非特异性结合，酶的可持续性以及酶通用性等等。虽然在酶的结构，酶的分子性质，纤维以及纤维素超分子结构等等方面取得了一定的结果，但是由于纤维素底物结构和酶系统的复杂性，纤维素水解的机制至今仍没有彻底阐明。至今为止关于酶的相关因素已经有很多文献报道并综述[240–243]，因此我们将关注于酶资源，酶与底物的特异性结合以及酶的有效协同等提高酶效率的领域。

来自不同微生物的糖苷水解酶特征

为了有效的提高纤维素生物质的酶水解效率和降低成本，利用多种技术开展了寻找强效酶以及更好理解酶与底物之间相互作用的研究。在完全水解生物质的过程中需要不同的酶类，比如纤维素酶，半纤维素酶，脱枝酶，酚醛酸酯酶以及木质素酶[244]。然而目前位置还不清楚糖苷水解酶以及他们相关连的酶、蛋白质功能在降解木质生物质时的作用。多种微生物包括细菌，真菌能够生产多种多样的糖苷水解酶用于生物质转化和降解。在自然界中，生物质通过不同微生物的多种酶组分共同作用完成降解，这些微生物来自于特殊群落，如白蚁消化道，牛瘤胃以及极端环境中。这些厌氧或者好氧菌群落可能只有细菌，真菌或者二者都存在[245]。可用于生产糖苷酶的微生物及其特性列于表1。

这些微生物由不同的环境位分离得到，根据他们的生长环境加以分类。糖苷水解酶有多种不同的性质，比如通常环境下的热，酸，碱的耐受度等。根据他们

的蛋白质结构，糖苷水解酶可以进一部分为4类：多酶复合体系统（纤维小体），非复合纤维素酶系统，以及半纤维素酶和木质素酶系统。20世纪80年代Bayer, Lamed 和他们的同事[246,247]在湿热厌氧菌热纤梭菌分离得到纤维小体，之后的工作认识到纤维小体的蛋白质结构，特性，基因，多样性以及与植物细胞壁的相互作用。直到今天，纤维小体仅仅在厌氧微生物中存在。有很多综述详细介绍了纤维小体[248，253]。纤维小体具有多个特征：高效的纳米机器用于降解细胞多糖，多酶复合体中高效的纤维素和半纤维素的整合，并通过脚手架蛋白和铆钉蛋白结合在细胞壁上[252]。

相比之下，非复合糖苷酶系统在所有的微生物中都能发现，即使那些含有纤维小体的系统中。在这篇综述中，非复合酶系统的性质及它们与纤维素的相互作用将进行详细的讨论。非复合糖苷酶系统在多种丝状真菌中进行了详细的研究。其中，Trichoderma和Aspergillus是被广泛研究并用于工业生产的微生物。瑞氏木霉能够分泌只少2种外切酶(CBHI and CBHII)，5-6种内切酶(EGI, EGII, EGIII, EGIV, EGV, and EGVI)以及β-葡萄糖苷酶(BGL I and II)，2种木聚糖酶以及多种半纤维素酶[254]。纤维素酶在不溶性底物，尤其是结晶纤维素上的作用效果取决于不同组分的比例，某些协同作用只有在一定的比例下才是有效的[60,66]。虽然瑞氏木霉CBHI:EGI的比例在工业纤维素酶生产中为4-5:1，但是最近的研究说明最优的酶比例受到预处理条件，底物来源等等因素的影响[255,256]。虽然很多的研究成果证明CBHI和EGI共享纤维束上的相同结合位点，但是CBHI具有更高的结合和亲和能力，CBHII具有不同于CBH1的结合位点[56,257]。然而，这些组分的摩尔比例在协同作用时的结合比例还没有引起足够的关注。Nidetzky等证明在

酶的作用过程中，与位点的结合采用的是竞争的方式[258]。另一方面，Jeoh和同事认为Thermomonospora fusca的Cel5A增加了其他酶的结合能力[259,260]。

对于酶结合能力的强弱关系仍然没有清晰的认识。典型的纤维素含有糖结合结构域(CBMs) [261]，用于酶分子有效的结合在底物上，同时个别情况下还可能影响并打乱底物结构。来自于不同酶和不同起源的CBMs根据它们的氨基酸序列和三维结构进行了系统分类。T. reesei的CBH1, CBHII和EGI具有的CBMs含有芳香类氨基酸，可以结合在结晶纤维素上。结构研究显示3个芳香族氨基酸的排布与纤维二糖相吻合。因此认为通过形成范德华力，CBMs上的芳香族氨基酸与暴露在外的葡萄糖吡喃环相互作用并导致酶的与底物的结合[262]。研究报道CBHI-CBM可以与大约10个纤维二糖单位相互作用，它的催化核心大概能够持续36-54个纤维二糖单位[263]。纤维素酶的持续性涉及到纤维素酶的CBM和催化结构域[264,265]。理解单一的纤维素酶组分以及它们的协同机制对于研究纤维素的水解过程是非常重要的。

酶协同在水解过程中的作用

酶的协同现象在纤维素酶的水解过程中广泛存在，并具有不同的形式，包括内切酶与外切酶的协同，外切酶协同，内切酶协同[266]，内外切酶与β-葡萄糖苷酶的协同[267,268]，催化结构域与CBM协同[269]或者2个催化结构域协同[270]，纤维素-酶-微生物的协同[271]以及空间纤维素酶复合体的协同(如热纤梭菌的纤维小体) [241]。这些协同作用的出现决定于纤维素酶的来源或者底物的特征。比如，Cellulomonas fimi的CenA的催化结构域与CBM协同在棉纤维上被发现，但是在细菌微晶纤维素（BMCC）中没有发现[269]。内切酶协同只在真菌纤维素酶Gloeophyllum sepiarium和Gloeophyllum trabeum中有报道[266]。细胞-纤维素酶-纤维素的协同在与细胞紧密相关的水解过程中有报道，如C. thermocellum。

对非复合纤维素酶系的研究显示它们发挥功能时以协同或者合作的方式进行。不同的纤维素酶的协同依赖于不同的因素，包括底物的性质，酶的组成以及浓度，纤维素酶与底物的亲和力，组分的空间结构以及酶与底物的比例关系。瑞氏木霉中不同的纤维素酶在降解微晶纤维素时具有协同作用，但是随着底物浓度的提高而降低[272]。内切酶协同以及内切酶外切酶协同受到底物结构如聚合度

的影响[272]。对BMCC和酸溶胀纤维素的研究发现内切酶和外切酶的协同(e.g., purified CenA, CenC and CbhA, and CbhB from C. fimi)随着底物的结构发生变化[273]。

复合纤维素酶系包含多种纤维素酶和半纤维素酶，在降解纤维素时这些酶具有明显的协同作用。如在热纤梭菌中，纤维小体的亚基包含12种内切酶，2种外切酶，2种外切葡聚糖酶，6种木聚糖酶，1种几丁质酶，1种苔聚糖酶以及1种甘露糖酶[265]。除了纤维小体，非纤维小体纤维素酶在厌氧微生物中也是存在的。然而，对这些非小体酶的关注由于纤维小体微生物产生的小体的影响被忽视了。这些游离的酶能够与纤维素小体协同进行纤维素的降解[240]。

纤维素研究中的一个挑战是阐明单一组分之间协同的机制及相互作用关系[274]。为了确定纤维素酶组分协同的程度，有必要对不同的酶进行纯化分离，但是有外切酶和内切酶组成的酶极为复杂，是很难被分离成单一组分的。这种复杂程度在T. reesei [275]中的纤维素酶的研究中被提到。另一方面，某些纤维素酶组分，比如内切酶是比较难春纯化的。纤维素降解模型的更多细节将依赖于确定底物特异性与单一酶组分的动力学过程的研究。这一领域在引入了低分子量发色基团4-甲基伞形酮-β-葡糖苷以及异源表达技术，如酿酒酵母之后取得了极大的进展，这些技术解决了酶纯化过程中的交叉污染问题[276–278]。我们需要考虑的是异源表达系统中产生的蛋白质糖基化问题。更进一步，由于纤维素酶之间的协同作用受到底物天然结构的影响，如化合物组成，聚合度，结晶度以及可溶性等等，因此对不同研究结果的比较就显得极为困难。因此，建立了一系列的纤维素底物模型，并广泛的将这种底物模型用于研究中，这样将有效的提高实验结果比对的便利性并帮助人们理解纤维素水解的机制和动力学过程。另外，这样的实验结果需要提供实验证据来辅助计算机模拟酶与蛋白质以及与底物之间的协同过程，已经有很多的动力学模拟的研究成果很好的解决了一些问题[279–284]。

除了纤维素酶组分之间的协同作用外，降解木质纤维素时不同糖苷酶之间的协同(如纤维素酶和半纤维素酶等)也需要被评估[192,250,268,285–288]。生物质水解的天然协同作用非常普遍，比如昆虫的肠道纤维素酶系统[289–291]，瘤胃微生物酶系统[292]以及多种堆肥系统。这些协同系统可以仅有细菌或者真菌组成，或者二者均含有，另外还包括哪些寄生型的系统。宏基因组学以及对白蚁肠道菌

群分析后发现了大量不同种类的涉及纤维素和木聚糖水解的酶[293]。Brulc等通过以基因为中心的宏组学对牛瘤胃生物群和白蚁肠道菌群对比分析[294]。这项研究发现不同的糖苷水解酶的组成都是由饮食结构所决定。这些研究说明热纤梭菌的纤维小体极少出现在协同群落中。相对应的，梭菌属是纤维素富集环境中微生物群落的主要成员，如堆肥[295]。真菌也同样存在这样的现象。有趣的是编码48家族非小体糖苷酶的celY在小体产生菌中被发现，首先是在Clostridium stercorarium，Clostridium straminisolvens和Clostridium clariflavum [296,297]中发现，以及热纤梭菌[298]。Clostridium stercoraium产生的纤维小体含有大量的半纤维素酶，但是只有2种非小体酶，即GH9 内切酶CelZ和GH48外切葡聚糖酶celY，这些酶的协同使其能够降解生物质中的微晶纤维素。这也说明单纯依靠纤维小体不能够有效的降解生物质，其他的糖苷水解酶需要参与生物质的完全降解过程。这种假说被不同的堆肥纤维群落宏基因组学研究加以证实[295,299,300]，其中一系列非小体纤维素酶产生菌和小体产生菌同时出现。因此，这项对微生物群落协同的研究会对生物质转化研究的突破性进展的获得起到重要的作用。除了糖苷水解酶，蛋白质与酶的协同以及反应物的协同也起到了重要的作用。因此对酶协同的研究将有助于提高酶的反应特性。

实验技术的应用

略

展望

作为生物质的研究对象，纤维素酶的吸附以及效能不能通过简单的几个底物特征来决定。于是，半纤维素和木质素的移除，去乙酰基化，去晶作用，表面可及度以及不同纤维素酶组分的天然性质都会影响酶与底物的相互作用以及在它们结合之后的效率。然而，这些影响因素可能比其他因素的影响更加明显，我们需要了解底物物理及化学结构特点并分析它们对糖苷酶接触底物以及降低生物质降解效率并形成可发酵糖的综合影响。理解控制和影响底物与糖苷酶的因素，并认真分析阻碍酶解过程的物质来自于水解过程中释放出的成分还是降解形成糖时产生的物质，又或者是上游过程产生的物质，这对于确定确定预处理方法，