MLPA技术原理2
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MLPA技术原理2解读
MLPA 技术原理
MLPA 技术原理
MLPA 技术原理
MLPA 技术原理
MLPA 技术原理
MLPA 技术原理
多重连接探针扩增技术融合了 DNA 探针杂交和 PCR 技术的特点，且 发扬了其连接依赖的特色，优点如下：
自动化程度高
耗时短，24 h 内即可出结果
Add
所需样本量小，最 少仅需 20 ng DNA Your Text 即可完成检测
针对每一个待测靶基因序 列，均有一对 MLPA 探针，由一 个短的化学合成寡核苷酸片段 和一个长的通过磁珠法制备的 寡核苷酸片段组成。检测时先使 待测双链 DNA 变性解链，加入 连接酶，调节连接温度。若待测 核酸中含有靶序列，则两个探针 与待测核酸互补良好，连接反应 可进行，反之，若其中一条探针 的序列与待测靶基因序列不完 全互补，甚至只有一个碱基不互 补，也会使杂交不完全而使连接 反应无法进行。
MLPA 技术原理
针对每一个待测靶基因序列 ，均有一对 MLPA 探针，由 一个短的化学合成寡核苷酸 片段和一个长的通过磁珠法 制备的寡核苷酸片段组成。 检测时先使待测双链 DNA 变 性解链，加入连接酶，调节 连接温度。若待测核酸中含 有靶序列，则两个探针与待 测核酸互补良好，连接反应 可进行，反之，若其中一条 探针的序列与待测靶基因序 列不完全互补，甚至只有一 个碱基不互补，也会使杂交 不完全而使连接反应无法进 行。
MLPA 技术原理
该技术主要包括：探针与靶序列的 杂交、探针的特异化连接、连接探针 的扩增和结果的检测分析。针对每一 个待测靶基因序列，均有一对 MLPA 探针，其由一个短的寡核苷酸片段（ 短探针）和一个长的寡核苷酸片段（ 长探针）组成。该技术的特色之一是 仅扩增连接完好的探针，而不是扩增 样本靶序列。MLPA 技术原理MLP Nhomakorabea技术原理
MLPA多重连接探针扩增试剂盒
®
®
3. MLPA 主要用于识别基因组的缺失或者插入，不大适合检测未知突变。尽管如此，MLPA 还是能够
检测已知（点）突变，如可以把突变位点设计在探针的连接位点，一旦发生突变，就是导致峰面积的下降。
®
4. MLPA 对于样品中的污染物（如少量残留的苯酚等PCR抑制剂）较普通PCR敏感。但是，此类污染很
MLPA简介
MLPA®的工作原理
MLPA®采用多重PCR的方式进行检测核酸样品，可用一对引物同时扩增多达45个特异的核酸列。扩
®
增产物可用测序仪检测。按照MLPA 的设计，每个扩增产物都有独一无二的长度，并按照6到9个核苷的梯
度逐步增加，总长度在120~500碱基之间。这一范围特别适合测序仪的有效分离和低背景检测。
AGXT-GRHPR, LARGE, UBE3A, TPO-PAX8-FOXE1-TSHR, FCGR基因簇分析, BRCA2 确认试剂。
● 肿瘤：P335 IKZF1-ALL, P202 IKZF1, P370 BRAF失活-IDH 突变。
®
MLPA 的特点
● 检测一个样品中50个基因序列的拷贝 数变化，基于PCR反应。
厦 门 致 善 生 物 科 技 有 限 公 司 成 立 于2 0 1 0年2月 ， 位 于 厦 门 火 炬 （ 翔 安 ） 产 业 区 内 。 公 司 具 有 雄 厚 的 技 术 力量和丰富管理经营经验的专业人员，一流的科研开发团队为公司技术的持续创新提供了源源不断的动力。 目 前 公 司 建 有1 0 0 0多 平 方 米 的 标 准 洁 净 厂 房 ， 拥 有 完 善 的 生 产 技 术 和 仪 器 设 备 ， 并 建 立 了 高 标 准 规 范 化 的 体 外诊断试剂质量管理体系，为产品的质量提供坚实的保证。
多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
45000
0 100 150 200 250 S iz e ( n t ) 300 350 400 450
40000
35000
TE + 50 mM KCl ; 94 oC. The presence of 50 mM salt
results in a much higher melting temperature. Some sequences in strong CpG islands are not denatured at 94 oC.
# 4 _ P 0 0 2 _ f _ 2 0 m i n .D 0 1 _ 0 9 0 8 0 9 1 2 O 5
100000
96,27
可检测降解DNA
90000
96,23
# 7 _ P 0 0 2 _ m _ 8 0 m in .
90000
98 oC 加热 20 分钟 98 oC # 加热 分钟 1 _ P5 0 0 2 _ m _ 5 m in .A 0 1 _ 0 9 0 8 0 9 30 2 81 00 03
3 4 5 ,1 2
97,24
20000
4 1 4 ,9 3
4 5 5 ,1 3
97,25
10000
10000
0
200
0
35 20 0
Dye Signal
Dye Signal
100
150
50
250 1 0 0 S iz e ( n t)
300 1
50
050
4 20 50 0
S iz e ( n t)
多重连接依赖式探针扩增技术在遗传病分子诊断中的应用
多重连接依赖式探针扩增技术在遗传病分子诊断中的应用黄际卫;商璇【摘要】多重连接依赖式探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)是近年发展起来的基因检测新技术,可通过简单的杂交( hybridization)、连接(ligation)及PCR( polymerasechain reaction)扩增反应于同一管内同时检测出多达40种基因组DNA或RNA拷贝数变化.凭借其操作简单、高通量、稳定可靠等特点,该技术在遗传病的分子诊断等领域的应用已得到迅速的推广,本文就MLPA技术的原理、特点以及在遗传病分子诊断中的实际应用等作一综述.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2012(004)004【总页数】5页(P274-278)【关键词】多重连接依赖式探针扩增;遗传病;分子诊断【作者】黄际卫;商璇【作者单位】南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室,广东,广州510515;南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室,广东,广州510515【正文语种】中文多重连接依赖式探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）是荷兰学者Schoute等[1]于2002年研发的一种高灵敏度的基因序列相对定量技术，该技术一次反应最少可对20 ng DNA或10 ng RNA进行检测，为Southern杂交及微阵列（micro-arrays）反应所需模板量的1/100～1/1000；此技术操作简单，24小时内可出结果，自动化程度高，有相应的数据分析程序；其检测结果稳定可靠；此方法也适用于石蜡包埋或福尔马林浸泡过的标本。
近来由MLPA延伸出另外两种技术，一种是逆转录酶多重连接探针扩增法（reverse transcript MLPA），用于mRNA的表达检测[2]；另一种是甲基化特异性多重连接探针扩增法（methylation-specific MLPA），同时适用于拷贝数定量和甲基化特异性扫描[3]。
二代测序原理及报告解读
解决方案：
1.设计引物时，设计范围向外扩展一部分，能够覆盖住剪切位点，部分 内含子，以及调控区域。
2.对于panel里面覆盖的基因，对于报道的常见的非编码区的热点突变， 额外加用捕获引物或用其他方法补齐。
阴性结果原因分析3
❖ 另外一条染色体各种修饰作用异常（DNA甲 基化，核小体修饰等）
DNA双链 甲基化 组蛋白修饰
2.1 基因变异所致疾病及遗传方式
使用孟德尔遗传数据库查找基因所致疾病及遗传方式
显性与隐性遗传共存在
多种遗传方式
不完全显性
2.结果具体分析
1）该基因突变致病疾病类型及遗传方式 2）该样本的此处突变是否为致病性突变 明确致病和可疑致病 3）该样本的突变型最终是否患病
2.2 查找突变位点的致病性
➢ 可能与当前症状有关的但又无报道致病性不明的突变位点。除非未发现其他典 型致病点，可考虑出报告结果。
注明：仅有在报告结果中的位点是经过一代验证的，其他选点表中的突变点都是未验证的。
选点数据举例
一肝病panel 阴性结果报告，选点数据
阴性结果原因分析1
❖ 该基因上存在杂合性缺失。
外显子 内含子
仅从检测得到的碱基序列上看， 完全正常，并为纯和序列。
2.3 总结突变与患病的关系
• 从遗传方式看有没有患病的可能性 • 从突变类型看有没有患病的可能性
ACMG突变解析指南
未报道致病位点，致病可能性的评估指南，节选其中可能致病性很强列表如下：
3.基因与疾病背景介绍
• 基因介绍来自于Gene数据库 • 疾病介绍来自于OMIM、罕见病数据库或其他外文权威
数据库
4.附表
1. 检测基因包基因列表 2. 可疑阳性报告，附不明突变致病性预测指南附表 3. 检测到的其他突变位点（已去掉正常多态位点）
1.设计引物时，设计范围向外扩展一部分，能够覆盖住剪切位点，部分 内含子，以及调控区域。
2.对于panel里面覆盖的基因，对于报道的常见的非编码区的热点突变， 额外加用捕获引物或用其他方法补齐。
阴性结果原因分析3
❖ 另外一条染色体各种修饰作用异常（DNA甲 基化，核小体修饰等）
DNA双链 甲基化 组蛋白修饰
2.1 基因变异所致疾病及遗传方式
使用孟德尔遗传数据库查找基因所致疾病及遗传方式
显性与隐性遗传共存在
多种遗传方式
不完全显性
2.结果具体分析
1）该基因突变致病疾病类型及遗传方式 2）该样本的此处突变是否为致病性突变 明确致病和可疑致病 3）该样本的突变型最终是否患病
2.2 查找突变位点的致病性
➢ 可能与当前症状有关的但又无报道致病性不明的突变位点。除非未发现其他典 型致病点，可考虑出报告结果。
注明：仅有在报告结果中的位点是经过一代验证的，其他选点表中的突变点都是未验证的。
选点数据举例
一肝病panel 阴性结果报告，选点数据
阴性结果原因分析1
❖ 该基因上存在杂合性缺失。
外显子 内含子
仅从检测得到的碱基序列上看， 完全正常，并为纯和序列。
2.3 总结突变与患病的关系
• 从遗传方式看有没有患病的可能性 • 从突变类型看有没有患病的可能性
ACMG突变解析指南
未报道致病位点，致病可能性的评估指南，节选其中可能致病性很强列表如下：
3.基因与疾病背景介绍
• 基因介绍来自于Gene数据库 • 疾病介绍来自于OMIM、罕见病数据库或其他外文权威
数据库
4.附表
1. 检测基因包基因列表 2. 可疑阳性报告，附不明突变致病性预测指南附表 3. 检测到的其他突变位点（已去掉正常多态位点）
多重连接探针扩增技术及片段分析技术
MLPA探针设计及结构
短探针：
长探针：
2.2 MLPA反应步骤
包括
DNA变性 杂交 连接 扩增 电泳检测
MLPA 反应所需要的仪器
• PCR仪
• 测序仪
2.3 MLPA的5个实验步骤
2.4 MLPA技术结果分析
毛细管电泳完成后，电泳峰图使用软件进行 结果分析。
一、MLPA技术概述 二、MLPA技术原理/实验操作/结果分析 三、MLPA技术临床应用 四、MLPA技术特点 五、MLPA技术新发展
三、MLPA技术的临床应用
已广泛应用于：
染色体数目异常 基因已知点突变 基因的外显子缺失/重复突变 基因甲基化研究 癌症研究 mRNA 表达研究。。。等领域
杂合缺失 突变
杂合缺失突变， 其比值约为0.5(范围0.25-0.75)
纯合缺失 突变
纯合缺失突变， 其比值约为0
杂合重复 突变
杂合重复突变， 其比值约为1.5 (范围1.25-1.75)
纯合重复 突变
纯合重复突变， 其比值约为2.0 (范围1.75以上)
第六章 第一节 目录
《临床基因组学检验》
Schouten JP，McElgunn CJ，Waaijer R，et al．Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification[J]．Nucleic Acids Res，
MLPA主页 /WebForms/WebFormMain.aspx
一、MLPA技术概述--3
是一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的技术。
MLPA及其在DMD中的应用
MLPA检测DMD基因79个外显子重复和缺失突变
基因型与表型关系：表型的严重程度取决于缺失或重复是否
影响了开放阅读框，而不取决于缺失/重复片段的大小。
四、DMD诊断检查
血清学检测
1. 血清肌酸激酶（CK）显著增 高，可达正常值的20-100倍 2. LDH和CK -MB水平轻度增高
影像学检查
肌电图检查
肌源性损害
病理学检查
基因检查
五、诊断流程
DMD疑似患者就诊 抽提外周血DNA
MLPA实验流程
1.变性
98℃，5min
2.杂交
往变性后的样品中加入SALSA probe mix 和MLPA buffer。 混合体系在95℃5min 60℃18h 54℃∞
3.连接
在杂交产物中加入Ligase 混合液在54℃15min 98℃5min
4.PCR
加入引物，dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。
假肥大型肌营养不良
假肥大型肌营养不良
一、概述
假肥大型肌营养不良是最常见的X连锁隐性遗 传性肌肉系统疾病，包括杜氏进行性肌营养不良 （DMD）和贝氏进行性肌营养不良（BMD）。
二、临床表现
转氨酶 、 Nhomakorabea生化
肌
酶学
酶
升
高
神经肌肉 系统
DMD
心血管 系统
隐匿起病，表现为走路慢，脚尖着 地，呈鸭步，易摔跤，不能跳跃，上 楼及蹲位站立困难，上肢举臂无力 肌肉假性肥大，触之坚韧，一以腓 肠肌最明显 晚期肌肉明显萎缩，多数在20-30岁 因呼吸道感染、心力衰竭而死亡
MLPA实验流程
1.变性
98℃，5min
2.杂交
往变性后的样品中加入SALSA probe mix 和MLPA buffer。 混合体系在95℃5min 60℃18h 54℃∞
产前诊断新技术-MLPA
DMD2011-19AF E3-8缺失
2、缺失携带者诊断
——对于没有家族史的女性携带者判断，是目前
最有效的方式之一
DMD29CVS E46-50杂合缺失 DMD3 E8/E9杂合缺失
3、重复突变诊断
正常对照
重复突变患者
4、重复突变携带者诊断
重复突变患者
重复携带者
我们的体会
1. 特别适用于散发病例女性携带者的判断
该比值即反应样本DNA拷贝数的变化
正常对照的Rito分析图：
Chr.18 Chr.13
Chr.21
Chr.X
Chr.Y
1
21三体综合征
18三体综合征
18三体
13三体综合征
二、MLPA技术在缺失/重复突变 产前诊断中的应用
2.1 假肥大性进行性肌营养不良（DMD/BMD）
DMD是最常见的X连锁隐性遗传致死性肌病，发病 率约为1/3500活产男婴 其分子基础是抗肌萎缩蛋白（ dystrophin ）基因的 部分缺失、重复或点突变。约65-75%的DMD/BMD患 者是由于Dystrophin基因缺失或重复所致
吴玉等，MLPA和PCR-RFLP技术用于脊髓性肌萎缩症的基因诊断.中国 计划生育学杂志，2008.9（155）:535-539.
22q11微缺失
22q11微缺失综合征（22q11D）是先天性心 脏病(CHD)的遗传病因之一，由其引起的CHD预 后不良 染色体22q11区域高密度多重连接探针检测技 术能快速、灵敏、精确定位诊断染色体 22q11 区 域基因拷贝数异常，适合于CHD的遗传学诊断
22q11 微缺失或微重复引起的 CHD 类型多种 多样，建议所有CHD患者应常规进行遗传学检 测 胎儿超声心动图检查有异常、无论是否合并 有心外畸形，均应当进行22q11微缺失检测或 染色体核型分析，以帮助准确产前咨询
单基因遗传病分子诊断的新策略和新方法
《中国产前诊断杂志（电子版）》 ２０１６年第８卷第３期·专家笔谈· 单基因遗传病分子诊断的新策略和新方法王蕾 贺静 朱宝生（云南省第一人民医院遗传诊断中心、云南省出生缺陷与遗传病重点实验室，云南昆明 ６５００３２）【摘要】 单基因遗传病具有复杂的表型异质性及遗传异质性，基因突变可涉及点突变、片段缺失／重复、整个基因的缺失／重复、以及动态突变等众多类别。
分子诊断技术使得单基因遗传病可在分子水平乃至单个碱基发生变异的情况下做出准确诊断，然而其可靠性问题成为备受瞩目的技术难点。
针对不同遗传病使用不同的解决方案，是目前单基因遗传病分子诊断的主流思想。
基因诊断相关人员不仅要了解遗传疾病致病基因及其突变特点，还要熟知各种检测技术的特点，合理选择。
【关键词】 单基因遗传病；分子诊断；杂交；扩增；测序【中图分类号】 Ｒ７１４．５５ 【文献标识码】 Ａ犱狅犻：１０．１３４７０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｐｄ．２０１６．０３．００２基金项目：国家自然科学基金（８１２６０４１５）、云南省卫生领军人才项目（Ｌ ２０１２０１） 通信作者：朱宝生，Ｅ ｍａｉｌ：ｂｓｚｈｕ＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ 单基因遗传病（ｍｏｎｏｇｅｎｉｃｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）是由位于同源染色体上的一对等位基因之一或者二者发生突变，导致蛋白结构信息错误或基因表达控制异常而出现的身体结构发育异常和／或生理功能异常，该类疾病一般符合孟德尔遗传方式，所以，又称为孟德尔遗传病（ｍｅｎｄｅｌｉａｎｉｎｈｅｒｉｔｅｄｄｉｓｅａｓｅｓ）［１］。
大多数单基因遗传病是罕见病，其中每一种在全球人口中的平均发生率在１／１００００～１／１０００００［２］，多则在数千个新生儿中出现一例，少则数十万新生儿中出现一例；但对局部地区或者来自某些地区的特定人群而言，某些单基因遗传病的平均发生率可能高达１％～２％，如在东南亚和云南南部的某些少数民族中，地中海贫血和葡萄糖 ６磷酸脱氢酶缺乏症的发生率就高达２％以上［３］。
多重连接依赖式探针扩增技术(MLPA)
不检测染色体的平衡易位
检测染色体数目异常 检测人类基因或基因片段的缺失与重排 基因甲基化检测（MS-MLPA） 肿瘤诊断与治疗方面的应用
探针结构 MLPA 最大的特点在于探针的设计，因而能在一个反应体系中，仅用 一对引物即可扩增45 个不同的核苷酸序列。 针对每个待测基因靶序列设计了一对探针，这一对探针包括一条经化 学合成的短探针（5' 端探针）和一条经M13 噬菌体衍生法制备而来的 长探针（3' 端探针）。
短探针长约50-60 bp，包括一个位于其3' 端幵与靶序列完全互补的杂交序列和一个位于其 5' 末端19 nt 的共同序列，该共同序列与标记的PCR 引物相同。 长探针长约60-450 bp，包括一个位于其5' 末端幵与靶序列完全互补的杂交序列和一个位 于其3' 末端23 nt 的共同序列及两序列间的长度特异填充片段，其共同序列与未标记的PCR 引物相互补。 由于填充片段长短不一而可以区分不同的探针。连接后探针长度在130nt-480nt 之间，相 邻两探针相差6-9 nt。因此可同时检测基因组多达 40种不同靶基因。
扩增产物可用琼脂糖凝胶电泳或通过毛细管电泳等进行分离。 电泳结果经软件（ Genemapper ， GeneMarker ， coffalyser ）分析，得出的探 针峰信号缺失或增高、降低都表示该靶基因拷贝数异常。
灵敏度高 特异性高 精准度高 重复性强
操作简便
高通量检测
不能用于单个细胞的检测 不能用于检测短串联重复序列多态性 ( STR)
HAYS
MLPA技术最早由荷兰学者 Dr . Schouten JP于 2002年提出 ,是一种高通 量、 针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术 ,它利用简 单的杂合 ( hydriation)、 连接 ( ligation)及 PCR扩增 ( PCR amplication)反 应 ,于单一反应管內可同时检测 40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。 到目前为止广泛的应用于基因检测及基因诊断等多个领域 ,如染色体 数目异常 ( Trisomy13、18 & 21)、 遗传性疾病基因缺失重复 (如 DMD、 HNPCC等 )、 基因甲基化检测等。
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MLPA 技术原理
针对每一个待测靶基因序列 ，均有一对 MLPA 探针，由 一个短的化学合成寡核苷酸 片段和一个长的通过磁珠法 制备的寡核苷酸片段组成。 检测时先使待测双链 DNA 变 性解链，加入连接酶，调节 连接温度。若待测核酸中含 有靶序列，则两个探针与待 测核酸互补良好，连接反应 可进行，反之，若其中一条 探针的序列与待测靶基因序 列不完全互补，甚至只有一 个碱基不互补，也会使杂交 不完全而使连接反应无法进 行。
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MLPA 大优点
检测精确度高，能够检 测出单个碱基的突变 或 SNP 及基因拷贝数
一倍量的增加或减少
可实现多重分析，同时对 多种靶基因位点进行检测 检测方法灵活
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MLPA 技术原理
LOPMTM-MLPA实验的
3 个步骤：
结果检测 MLPA
LOPMTM 针对目标序列和用于制备长 探针的与待检测靶片段无关的模 板UT（Unrelated Template），如质 粒等设计进行PCR扩增的引物，其 中的一条引物进行生物素标记，以 质粒为模板进行PCR扩增，从而获 得特异长度的生物素标记的核酸 序列，利用亲和素磁珠进行纯化， 最终获得单链寡核苷酸（非生物素 标记），从而制备获得长度特异的 寡核苷酸单链。
MLPA 技术原理
MLPA技术原理
王晓琳
MLPA 技术原理
2002 年，荷兰科学家发明了一 种名为多重连接探针扩增技术 (multiplex ligation-dependent probe amplification， MLPA) 的高 通量的基因检测方法，该技术利用 核酸杂交、连接反应和 PCR 扩增 反应，可以在同一反应管内对多达 45 种不同的核苷酸序列进行检测和 定量分析。
MLPA 技术原理
★ 琼脂糖凝胶 电泳 ★ PAGE ★ 毛细管电泳 ★ 固相芯片法 ★ 液相芯片法 ★ DHPLC
★ 琼脂糖凝胶电泳 ★ PAGE ★ 毛细管电泳 ★ 固相芯片法 ★ 液相芯片法 ★ DHPLC
MLPA 技术原理
LOPMTM
针对目标序列和用于制备 长探针的与待检测靶片段无 关的模板U（ UnrelatedTemplate），如质 粒等设计进行PCR扩增的引 物，其中的一条引物进行生 物素标记，以质粒为模板进 行PCR扩增，从而获得特异 长度的生物素标记的核酸序 列，利用亲和素磁珠进行纯 化，最终获得单链寡核苷酸 （非生物素标记），从而制 备获得长度特异的寡核苷酸 单链。
MLPA 技术原理
MLPA 技术原理
MLPA 技术原理
MLPA 技术原理
MLPA 技术原理
MLPA 技术原理
多重连接探针扩增技术融合了 DNA 探针杂交和 PCR 技术的特点，且 发扬了其连接依赖的特色，优点如下：
自动化程度高
耗时短，24 h 内即可出结果
Add
所需样本量小，最 少仅需 20 ng DNA Your Text 即可完成检测
MLPA 技术原理
该技术的扩增环节仅需 2 条引物， 一是引物 GP1，另一是引物 GP2。在所 有短探针的 5’端均有一段共同序列，该 序列与引物 GP1 的核酸序列相同；在 所有长探针的 3’端均有一段共同序列， 该序列与引物 GP2 的核酸序列互补。可 见，所有连接探针的 PCR 扩增用的是同 一对引物。
MLPA 技术原理
若两探针连接，则扩增可进行；而若两
探针未连接，则扩增无法进行。各长探针在
共同序列和与同使连接后的
MLPA探针长度不同，故其扩增片段长度亦
不同。一般相临两产物的长度相差6～8 bp， 因此可同时检测基因组的多种不同靶基因。 扩增后进行结果检测分析比对，得出结论。
针对每一个待测靶基因序 列，均有一对 MLPA 探针，由一 个短的化学合成寡核苷酸片段 和一个长的通过磁珠法制备的 寡核苷酸片段组成。检测时先使 待测双链 DNA 变性解链，加入 连接酶，调节连接温度。若待测 核酸中含有靶序列，则两个探针 与待测核酸互补良好，连接反应 可进行，反之，若其中一条探针 的序列与待测靶基因序列不完 全互补，甚至只有一个碱基不互 补，也会使杂交不完全而使连接 反应无法进行。
MLPA 技术原理
该技术主要包括：探针与靶序列的 杂交、探针的特异化连接、连接探针 的扩增和结果的检测分析。针对每一 个待测靶基因序列，均有一对 MLPA 探针，其由一个短的寡核苷酸片段（ 短探针）和一个长的寡核苷酸片段（ 长探针）组成。该技术的特色之一是 仅扩增连接完好的探针，而不是扩增 样本靶序列。