15研究微生物的基本方法

第5章研究微生物的基本方法随着现代医学及相关科学技术的发展，各学科相互交叉和渗透，医学微生物学检验技术已深入到细胞、分子和基因水平，许多新技术、新方法已在临床微生物实验室得到广泛应用。

医学微生物学实验室的基本任务之一是利用微生物学检验技术，准确、快速检验和鉴定临床标本中的微生物，并对引起感染的微生物进行耐药性监测，为临床对感染性疾病诊断、治疗、流行病学调查及研究等提供科学依据。

第一节显微镜观察由于细菌个体微小，肉眼不能看到，必须借助显微镜的放大才能看到。

一般形态和结构可用光学显微镜观察，其内部的超微结构则需用电子显微镜才能看清楚。

常用显微镜有如下几种。

1．普通光学显微镜采用自然光或灯光为光源，其波长约为0.4μm。

显微镜的分辨率为波长的二分之一，即0.2μm，而肉眼可见的最小形象为0.2mm。

故用油（浸）镜放大1 000倍，能将0.2μm的微粒放大成肉眼可见的0.2mm。

普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的观察。

2．暗视野显微镜常用于观察不染色微生物形态和运动。

在普通显微镜安装暗视野聚光器后，光线不能从中间直接透入，视野呈暗色，当标本接受从聚光器边缘斜射光后可发生散射，因此可在暗视野背景下观察到光亮的微生物如细菌或螺旋体等。

3．相差显微镜相差显微镜利用相差板的光珊作用，改变直射光的光位相和振幅，将光相的差异转换为光强度差。

在相差显微镜下，当光线透过不染色标本时，由于标本不同部位的密度不一致而引起光相的差异，可观察到微生物形态、内部结构和运动方式等。

4．荧光显微镜荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同，主要区别在于光源、滤光片和聚光器。

目前大多数使用的是落射光装置，常用高压汞灯作为光源，可发出紫外光或蓝紫光。

滤光片有激发滤光片和吸收滤光片二种。

用蓝光的荧光显微镜除可用一般明视野聚光器外，也可用暗视野聚光器，以加强荧光与背景的对比。

本法适用于对荧光色素染色或与荧光抗体结合的细菌的检测或鉴定。

5．电子显微镜用电子流作为光源，波长与可见光相比差几万倍，大大提高了分辨力，并用磁性电圈作为光学放大系统，放大倍数可达数万倍或几十万倍，常用于病毒颗粒和细菌超微结构的观察。

8.2制片和染色一. 非染色标本非染色标本一般可用于观察细菌形态、动力及运动情况。

细菌未染色时无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。

有鞭毛的细菌运动活泼，无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。

梅毒苍白密螺旋体、钩端螺旋体、弯曲杆菌等的活菌各有特征鲜明的形态和运动方式，具有诊断意义。

常用的方法有压滴法、悬滴法和毛细管法等。

1．悬滴法在洁净凹玻片的凹孔四周涂上凡士林，用接种环取一环菌悬液放在盖玻片中央，再将凹玻片的凹孔对准盖玻片中央的液滴并盖上，然后迅速翻转，轻压盖玻片，使其与凹孔边缘的凡士林粘紧封闭后置高倍镜下（或暗视野）观察。

2．压滴法用接种环取一环菌悬液置于洁净玻片的中央，在菌悬液上轻轻盖上一盖玻片，注意避免产生气泡并防止菌悬液外溢，静止数秒钟后置高倍镜下明视野（或暗视野）观察。

3．毛细管法主要用于厌养菌动力的检查。

通常选用60~70mm长。

0.5~1.0mm孔径的毛细管虹吸厌养菌悬液后，用火焰将毛细管两端熔封。

并用塑胶纸将毛细管固定在载玻片上，置高倍镜下暗视野观察。

二、染色标本检查细菌标本经染色后，由于细菌与周围环境间在颜色上形成鲜明对比，故在普通光学显微镜下可清楚地观察到细菌的形态特征（如细菌的大小、形状、排列等）和某些特殊结构（如荚膜、鞭毛、芽孢等），并可根据染色反应性对细菌加以分类鉴定。

（一）细菌染色的一般程序细菌染色的一般程序是：涂片（干燥）—固定—染色（媒染）—（脱色）—（复染）。

1．涂片制备血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液体培养物，直接在载玻片上作薄膜涂片；尸检或感染动物组织，病变局部涂抹采样的棉拭子直接涂片。

固体培养基上的菌落或菌苔的制片，先用接种环取一环生理盐水置载玻片中央，再用无菌接种环取少量的培养物在生理盐水中磨匀，涂布成1cm2大小的涂面，置室温下自然干燥或远火慢慢烘干。

2．固定目的是杀死细菌，凝固细菌蛋白及结构，便于染色；促使细菌粘附在载玻片上，避免在水洗过程中被水冲掉；改变细菌对染料的通透性，有利于菌细胞内结构的染色。

通常用火焰加热固定，将已干燥的涂片在火焰中迅速通过3次，以手背皮肤接触玻片不烫为佳。

3．染色根据检验目的不同，选择不同的染色方法进行染色。

染色时滴加染液，以复盖标本为度。

4．媒染凡能增强染料和被染物的亲和力，使染料固定于被染物及能引起细胞膜通透性改变的物质，称媒染剂。

常用的有明矾、鞣酸、金属盐和碘等，也有用加热法促进着色。

媒染剂可用于初染与复染之间，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。

5．脱色凡能使已着色的被染物脱去颜色的化学试剂称为脱色剂。

常用乙醇、丙酮等作为脱色剂。

脱色剂可以查出细菌与染料结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。

6．复染已脱色处理的细菌或其结构常以复染液作复染以便于观察。

复染液与初染液的颜色不同而成一鲜明对比。

复染不宜太强，以免掩盖初染的颜色。

（二）常用染色法1. 单染色法只用一种染料染色。

由于大多数细菌胞浆内含有酸性物质，可与碱性染料结合，故常用吕氏美蓝、结晶紫和稀释石碳酸复红等染液。

此法可观察细菌的大小、形态与排列，不能显示细菌的结构与染色特性。

2．复染色法用两种或两种以上不同染料可将细菌染成不同的颜色，除可观察细菌的大小、形态与排列外，还反应出细菌染色特性，具有鉴别细菌种类的价值。

常用的有革兰染色法和抗酸染色法。

（1）革兰染色：①细菌涂片经火焰固定，加结晶紫染液染1min，清水冲去染液。

②加碘液媒染 1min，水洗，甩干。

③用95%乙醇脱色，轻轻摇动约30s，至无紫色洗落为止，水洗，甩干。

④加稀释石碳酸复红或沙黄染液数滴进行复染，约30s，水洗。

⑤干后显微镜下镜检观察结果，革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌为红色。

（2）抗酸染色：萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法：①细菌涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸气出现，切不可沸腾。

染液因蒸发减少时，应随时补充，防止染液蒸干。

持续染5min（奴卡菌需要加长时间），水洗，甩干。

②滴加3%盐酸乙醇脱色，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗，甩干。

③加吕氏美蓝复染液数滴复染1min，水洗。

④干后显微镜下镜检观察结果，抗酸杆菌染成红色，非抗酸杆菌为蓝色。

金胺O-罗丹明B染色法：①细菌涂片固定后加第1液30~90s。

②弃去第1液后加第2液染15min。

③用第3液脱色1~2min，水洗。

④滴加第4液染30s，水洗，⑤干后置荧光显微镜下镜检观察结果在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。

3．特殊染色法（1）鞭毛染色（改良Ryu法）：①玻片的处理将新载玻片浸泡在95%乙醇中。

临用时取出，以干净纱布擦干。

②在玻片上滴蒸馏水1滴。

③挑取培养物少许，轻触蒸馏水滴顶部，仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。

④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1~2 min轻轻水洗。

⑤干后显微镜镜检观察结果鞭毛和菌体呈紫色。

（2）异染颗粒染色(阿尔培托法)：①细菌涂片经火焰固定，加甲液染色3~5min。

水洗。

②滴加乙液，染1min。

水洗。

③干后显微镜镜检观察结果菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色,用于白喉棒状杆菌染色。

（3）荚膜染色：①奥尔特荚膜染色法：将已固定的细菌涂片滴加3%沙黄染液，用火焰加温染色，持续3min，冷却后水洗，待干镜检。

结果：菌体呈褐色，荚膜呈黄色，此法主要用于碳疽芽胞杆菌。

②Hiss氏硫酸铜法：染液：第一液为结晶紫乙醇饱和液5ml加蒸馏水95ml 的混合液；第二液为20%硫酸铜水溶液。

方法：细菌涂片自然干燥，乙醇固定。

滴加第一液，微加热染1min。

再用第二液将涂片上的染液洗去，勿再水洗，倾去硫酸铜液，以吸水纸吸干镜检。

结果：菌体及背景呈紫色，荚膜呈鲜蓝色或不着色。

（4）芽胞染色：染液：第一液为萋－纳氏石炭酸复红液，第二液为95%乙醇，第三液为碱性美蓝液。

方法：将已固定的细菌涂片滴加第一液，微加热染5min，冷却后水洗。

用第二液脱色2min，水洗。

加第三液复染1min，水洗，待干镜检。

结果：菌体呈蓝色，芽胞呈红色。

4．负染色法背景着色而菌体本身不着色的染色为负染色法。

最常见的是墨汁负染色法，用来观察真菌及细菌荚膜等。

在标本涂片处滴加染液，混合后加上盖玻片(勿产生气泡)，轻压。

在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞，转高倍镜或油镜确认，如新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，背景为黑色。

5．荧光染色法经荧光素染色的细菌，或荧光素标记的荧光抗体与相应抗原的细菌、病毒结合形成的复合物，在荧光显微镜下发出荧光。

8.3 微生物接种和培养大多数细菌均可以通过人工方法培养，而衣原体和病毒的分离培养往往需要活组织、鸡胚、特殊细胞株及动物接种。

只有将微生物培养出来才能对它进行研究、鉴定和应用。

一、接种与分离方法根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。

1．平板划线分离培养法对混有多种细菌的临床标本，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。

临床送检的标本如痰、咽试子、泌尿生殖道的分泌物和粪便等细菌检验均需要借助琼脂平板划线分离目的菌。

平板划线分离法通常有两种方法：（1）分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如痰、泌尿生殖道的分泌物和粪便或混合细菌的分离。

先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的1/4）并作数条划线，再于2、3、4区依次划线。

每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。

一个成功分区划线的平板，培养后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌落。

（2）连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。

方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。

2.琼脂斜面接种法主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。

用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。

生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。

3．穿刺接种法此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。

接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。

双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，穿刺高层部分，退出接种针后直接划线接种斜面部分。