液相色谱技术及应用
高效液相色谱技术在药物分析中的应用
高效液相色谱技术在药物分析中的应用导语：药物分析是药学领域中的重要分支，它涉及到药物的质量控制、研究与开发等方面。
而高效液相色谱技术（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）由于其高灵敏度、高分辨率、高选择性和广泛适用性等特点，在药物分析领域得到了广泛的应用。
一、HPLC技术原理HPLC技术是一种液相色谱分离方法，其原理是将待测样品通过一定方式注入到固定相柱中，再通过流动相的作用下，样品成分在固定相上发生分离。
在HPLC 系统中，流动相的选择和条件的控制对于药物分析具有重要的意义。
二、药物分析中常用的HPLC技术1. 反相色谱法反相色谱法是药物分析中应用最广的HPLC技术之一。
常用的反相色谱固定相包括C18、C8、C4等。
反相色谱法适用于疏水性药物的分析，其分离效果好，分析时间短。
2. 离子对色谱法离子对色谱法适用于具有阴、阳离子特性的药物分析。
通过加入适当的离子对试剂，可以改变流动相的离子性，使某些离子化合物在色谱柱上发生离子对形成，从而实现对药物的选择性分离。
3. 手性色谱法手性色谱法主要用于对具有手性结构的药物进行分析。
由于手性药物对于人体的作用机制存在差异，因此对药物的手性分析具有重要意义。
手性色谱可通过手性固定相或手性添加剂来实现对手性化合物的选择性分离。
三、HPLC技术在药物质量控制中的应用药物质量控制是药物研究与开发的重要环节，而HPLC技术在药物质量控制中起到了关键作用。
通过HPLC技术，可以对药物的纯度、含量、残留物等进行准确测定，确保药物的质量安全。
四、HPLC技术在药物研究与开发中的应用在药物研究与开发过程中，HPLC技术发挥了重要的作用。
通过HPLC技术，可以对药物的代谢产物、药代动力学等进行研究，从而了解药物在体内的转化和效应。
此外，HPLC技术还可用于药物配方的优化和稳定性研究等方面。
五、HPLC技术在中药分析中的应用中药是我国传统文化的重要组成部分，在现代药物分析中，HPLC技术被广泛应用于中药的质量控制和成分分析。
高效液相色谱法及其在药物分析中的应用
高效液相色谱法及其在药物分析中的应用以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。
用常压输送流动相的方法为经典液相色谱法，这种色谱法的柱效能低、分离周期长。
高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，简称HPLC）是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法。
与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①应用了颗粒极细（一般为10µm以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；②采用高压输液泵输送流动相，流速快，一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；③广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了灵敏度。
目前，已经发展了多种不同的固定相，有多种不同的分离模式，使高效液相色谱法的应用范围不断扩大。
下面介绍高效液相色谱法的有关知识，新的方法和技术以及在药物分析中的应用。
一、分类高效液相色谱法按分离机理的不同可分为以下几类：（一）吸附色谱法（adsorptionchromatography）以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色谱法。
使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。
在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力的不同而被分离。
组分的极性越大、固定相的吸附力越强，则保留时间越长。
流动相的极性越大，洗脱力越强，则组分的保留时间越短。
（二）液-液分配色谱法（liquid-liquidchromatography)液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂，分离时，组分溶入两相，不同的组分因分配系数（K)的不同而被分离。
目前广泛使用的化学键合固定相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的，使用化学键合固定相的色谱方法（简称键合相色谱法）可以用分配色谱的原理加以解释。
键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位，是应用最广的色谱法。
按照固定相和流动相极性的不同，分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类。
高效液相色谱的原理及应用
高效液相色谱的原理及应用一、引言高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种广泛应用于生化、制药、食品安全等领域的分析技术。
本文将详细介绍高效液相色谱的原理及其在不同领域中的应用。
二、高效液相色谱的原理高效液相色谱是一种基于分配和吸附作用的色谱技术。
其原理如下：1.分配作用: 样品在液相中均匀分散，样品中的组分按溶解度的不同在液相和固定相之间分配，从而实现对样品的分离。
2.吸附作用: 组分在固定相上通过吸附作用与固定相表面相互作用，进一步实现对组分的分离。
3.色谱柱: 高效液相色谱中常使用填充在色谱柱中的固定相，通过色谱柱中的孔隙结构和表面特性实现对样品的分离。
三、高效液相色谱的应用高效液相色谱技术广泛应用于以下几个领域：1. 生化分析高效液相色谱在生化分析中起着重要的作用，可以用于蛋白质、核酸、糖类等生物大分子的分离和定量分析。
•分离蛋白质: 高效液相色谱可以通过选择合适的固定相和流动相，实现对蛋白质的不同特性进行分离，如分离不同分子量的蛋白质。
•分析核酸: 高效液相色谱可以通过裂解DNA或RNA，使用特定的检测方法，实现核酸的定量分析。
•糖类分析: 高效液相色谱可以用于糖类的检测和分析，对食品、医药等行业具有重要意义。
2. 制药领域高效液相色谱在制药领域中应用广泛，可用于药物的分离、纯化和定量分析等。
•药物分离和纯化: 高效液相色谱可以通过调整固定相和流动相的性质，实现对复杂药物混合物的分离和纯化。
•药物含量测定: 高效液相色谱可用于药物中成分的定量分析，以保证药物的质量和安全性。
•质量控制: 高效液相色谱可用于制药过程中的质量控制，例如检测制药中间体和产成品中的杂质和不纯物。
3. 食品安全高效液相色谱在食品安全领域中起着重要的作用，可用于检测和分析食品中的有害物质和添加剂。
•残留农药检测: 高效液相色谱可以用于检测食品中农药的残留量，以保障食品安全。
液相色谱法应用
液相色谱法应用
液相色谱法是一种广泛应用于化学分析和生物化学的分离技术。
液相色谱法与气相色谱法相比，具有更高的分离效率和更广泛的应用范围。
液相色谱法可以用于分离、纯化、定量和鉴定化合物，常用于药物分析、食品分析、环境监测、生物分析等领域。
液相色谱法的原理是利用样品在流动相中与固定相相互作用，通过在固定相中分离组分来分离混合物。
流动相可以是水、有机溶剂或其它液体，固定相可以是各种材料，如硅胶、C18、离子交换树脂等。
液相色谱法可采用不同的检测器，如紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
液相色谱法有许多不同的变体，如高效液相色谱、超高效液相色谱、离子色谱等，每种变体都有其特定的应用领域和优势。
例如，高效液相色谱可以在较短的时间内分离出许多化合物，而超高效液相色谱则具有更高的分辨率和更高的灵敏度。
液相色谱法是一种快速、准确、灵敏、可靠的分离技术，已经成为化学分析和生物化学的重要工具之一。
在未来，液相色谱法有望进一步发展，扩大其应用范围和提高其分离效率，对于解决实际问题和推动科学进步具有重要的作用。
- 1 -。
液相色普法的特点和应用范围
液相色普法的特点和应用范围液相色谱法（Liquid Chromatography，LC）是一种基于样品在液体流动相中与固定相相互作用而实现分离的色谱技术。
液相色谱法具有以下特点和应用范围。
特点：1. 良好的分离能力：液相色谱法可以分离各种不同极性、大小、结构以及化学特性的化合物，包括有机物、无机物、生物大分子等。
通过选择不同的固定相和流动相，可以实现对复杂混合物的高效分离和纯化。
2. 高灵敏度和选择性：液相色谱法可以通过优化流动相的组成、流速和温度等条件，实现对目标化合物的选择性提取和分离，从而提高分析的灵敏度。
同时，液相色谱法还可以与各种检测器（如紫外检测器、荧光检测器、质谱仪等）结合使用，进一步提高分析的灵敏度和选择性。
3. 分析速度快：液相色谱法的分析速度相对较快，通常在10分钟以内可以完成一次分析。
此外，液相色谱法还可以采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）等技术，进一步提高分析速度和分离效果。
4. 操作简便：相对于气相色谱法和其他分析方法，液相色谱法的操作相对简便，不需要特殊的气体供应和气密性。
同时，液相色谱法的样品制备相对简单，可以直接将待测样品溶解于流动相中进行分析。
5. 广泛的应用范围：液相色谱法在医药、化工、食品、环境监测等领域具有广泛的应用。
例如，在医药领域，液相色谱法可以用于药物的纯度检验、药物代谢产物的分析、病患体内药物的监测等。
在食品领域，液相色谱法可以用于食品添加剂的检测、农药残留的分析、食品中营养成分的测定等。
在环境监测领域，液相色谱法可以用于水质、大气和土壤中有害物质的监测和分析。
应用范围：1. 药物分析：液相色谱法是药物分析中最常用的分析方法之一。
它可以用于药物的纯度检验、药物代谢产物的分析、药物在血液中的监测等。
液相色谱法在药物分析中具有分离效果好、分析速度快、操作简便等优点。
2. 食品分析：液相色谱法在食品分析中也有广泛的应用。
液相色谱工作原理及应用
定期检查并更换进样针、密封垫等易损件，确保 仪器正常运行。
常见故障类型及排除方法
压力异常
检查泵头、单向阀等部件是否堵塞或磨损，清洗或更换相应部件； 检查流动相是否过滤干净，避免杂质堵塞流路。
基线漂移
检查检测器是否受到污染或老化，清洗或更换检测器；检查色谱柱 是否失效，更换新的色谱柱。
04 液相色谱在各个领域应 用
生物医药领域应用
药物分析
液相色谱可用于药物成分的分析和纯化，包括天然药物和合成药 物。
生物大分子分离
液相色谱在蛋白质组学、基因组学等领域中用于生物大分子的分 离和纯化。
代谢产物分析
液相色谱可用于生物体内代谢产物的分析和检测，为疾病诊断和 治疗提供依据。
环境监测领域应用
水质分析
液相色谱可用于水中有机物、无机物、重金属等污染物的分析和 监测。
大气污染监测
液相色谱可用于大气中挥发性有机物、颗粒物等污染物的分析和监 测。
土壤污染监测
液相色谱可用于土壤中农药、重金属等污染物的分析和监测。
食品安全领域应用食品添Fra bibliotek剂检测液相色谱可用于食品添加剂的种类和含量的 检测，保障食品安全。
06 液相色谱技术发展趋势 及挑战
技术发展趋势
高效、快速分离技 术
随着色谱柱填料、检测器等技术的不断发展，液相色谱分 离速度和效率不断提高。
智能化、自动化
液相色谱仪器越来越智能化，自动化程度越来越高，减少 了人为操作的误差和干扰。
多维色谱技术
多维色谱技术能够提供更丰富的信息，提高复杂样品的分 析能力。
液相色谱工作原理及 应用
目录
CONTENTS
• 液相色谱基本概念与分类 • 液相色谱工作原理 • 液相色谱实验技术与方法 • 液相色谱在各个领域应用 • 液相色谱仪器维护与故障排除 • 液相色谱技术发展趋势及挑战
液相色谱质谱联用技术在药物分析中的应用
液相色谱质谱联用技术在药物分析中的应用液相色谱质谱联用技术（LC-MS）已经成为分析化学领域中的一项重要工具。
它不仅可以用于生化分析和环境检测，还在药物分析中表现出很强的优势。
本文将重点介绍液相色谱质谱联用技术在药物分析中的应用。
一、液相色谱质谱联用技术的原理及优势液相色谱质谱联用技术是将液相色谱（LC）和质谱（MS）两种技术结合起来，使得样品经过某种分离后直接进入质谱分析器，从而达到高灵敏度，高选择性和高分辨率的目的。
液相色谱的选择性和分离能力可以使样品中各种成分被分离出来，而质谱则以其高灵敏度和特异性，鉴别每一个分离出来的成分，确保每种物质都得到准确的定量和定性分析。
液相色谱质谱联用技术优势显著，其主要表现在以下三个方面：1. 更高的分离能力和选择性，增强样品分离和分析的准确性和可靠性。
2. 具有高度的灵敏性和特异性，能提高分析的探测下限和峰面积，使得样品中的低浓度成分也能准确地被检测到。
3. 可以进行组分结构的确定和鉴定，通过分子离子的质量谱图，可确定组分的分子结构和可能的化学反应路径。
二、液相色谱质谱联用技术在药物分析中的应用液相色谱质谱联用技术在药物分析中的应用已经得到广泛的发展和应用。
主要表现在以下几个方面：1. 药物代谢研究液相色谱质谱联用技术被广泛应用于药物代谢研究中。
通过监测药物的代谢产物，可以研究药物在体内的代谢途径，剖析药物的药效，药物代谢动力学参数和评价药物对人体生理的影响。
2. 药物成分分析液相色谱质谱联用技术可以实现药物中各种成分的分离和分析，确保药物的安全和质量。
通过确定药物中的各种成分，可以评价药物的性质和作用机理，为药物的研发和质量监测提供有力的技术支持。
3. 毒物分析液相色谱质谱联用技术也可以用于毒物分析。
通过对毒物样品进行分离和质谱分析，可以鉴定毒物类别和浓度，及时采取措施，保护公众健康安全。
4. 药物残留检测液相色谱质谱联用技术可以用于药物残留检测。
通过在食品、动物和植物中定量检测药物残留量，可以评估药物对环境和健康的影响，保障食品安全。
高效液相色谱方法及应用
高压输液泵及梯度洗脱装置
一、高压输液泵 高压输液泵可以分为以下两类： 1．恒流泵：可输出恒定体积流量的流
动相。 （1）注射式泵（又称注射式螺杆泵） （2）往复型泵 2．恒压泵：恒压泵又称气动放大泵，
一类是选择性检测器，如紫外一可 见分光光度检测器；
另一类是通用型检测器，如示差折 光检测器。
(1)紫外一可见分光光度检测器。
如今此技术已在分析咖啡中的黄嘌泠、调料中的核苷酸及核苷、果汁中的有机酸、米中的维生素、牛奶中的维生素D等都对食品营养价 值提供有效数据。 热不稳定物、离子型化合物及高聚物的分离及测量有困难，致使其应用受到了很大的限制。 又如止痛药或退烧药也可用此法分离并测得各组分的含量。 染料厂排出废水中的苯胺等。 用液相色谱分析简便迅速。 分析食品中的有毒成分，如苹果中农药萘乙酸、稻米中的黄曲霉素、鱼体中的有机汞等。是输出恒定压来自的泵。二、梯度洗脱装置
1．梯度洗脱（gradient elution）又称 停流进样是在高压泵停止供液、体系压力下降的情况下，将样品直接加到柱头。
一、与经典液相色谱法比较
为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析 用离子交换柱和缓冲游泳梯度淋洗。
多种不同性能的配位体键联在固相基体上 分析食品中的有毒成分，如苹果中农药萘乙酸、稻米中的黄曲霉素、鱼体中的有机汞等。
高效液相色谱法的特点
一、与经典液相色谱法比较 经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装
填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经 色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱 入口压力低，仅有低柱效，分析时间冗长。
高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填 在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵 进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散 速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效 和高分离能力。
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液相色谱仪器系统及应用
HPLC硬件基础知识 日常应用注意事项
液相系统维护流程图
线路过滤器
单向阀
色谱柱 柱塞密封圈 手动进样器
检测器
吸滤头
5大系统：
（1）输液系统； （4）检测系统；
（2）进样系统； （5）数据处理系统；
（3）分离系统；
输液系统
接头
不锈钢接头 / 垫圈 主要用于输液泵、进样器的连接 – 能承受 400 kgf/cm2压力
内容简介
色谱发展概况 色谱分离原理 色谱基本理论 输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据输出系统 色谱方法的选择 色谱条件的优化 案例分析 化学因素 机械因素
§1 液相色谱基本概念
§2 液相色谱仪器系统及应用
§3 液相色谱方法开发和优化
§4 液相色谱常见问题及其解决方法
• “ k’ ”是比“ tR”还常用的保留值，它与柱子的大小及流速无关，只与溶 质在固定相和流动相的分配性质、柱温以及相空间比（即固定相和流动相 之体积比）有关。“ k’ ”又定义为在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之 比，消除了保留值的波动因素，而分配系数“ K ”是平衡时物质在两相中 的浓度比。
• k’值的范围：0.4＜k’＜20～30； k’＝2～5为佳，过大则耗时太长。
气相GC中B=2rDm中Dm比HPLC中大105倍
在HPLC中第二项可忽略，故高效液相色谱的范氏方程为：
H = A + Cμ
2.6 µm
2.6 µm
扩散
A = 涡流扩散－多径扩散
仔细填充柱子 使用粒径均一的载体
H E T P A
初始 带宽
最终 带宽
线速度
mAU
3 µm and 580µm particles
不能直接用有机溶剂 冲洗缓冲盐溶液
流动相的更换
不互溶的流动相不能直接更换 缓冲盐不能直接用有机溶剂更换
水
缓冲盐
异丙醇
水
正己烷
有机溶剂
溶剂前处理
过滤：0.45um或更小孔径滤膜
目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱， 尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。 尼龙66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸， 不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂
柱效率（热力学）：
• 定义： 理论塔板数 (
tR N＝
2
柱效
)：
1/2 h 2ơ
每米柱效
ơ—标准偏差，曲线拐点处峰宽的一半， 即峰高0.607处峰宽的一半。 为便于测量，改用半峰宽： W1/2( 或2×△t1/2 ) H 最常用的计算式：
tR N＝5.54 W 1/ 2
H E T P
5 µm
线速度
5
w1/2
6
3 µm
mAU
w1/2
5 6
3
80
4
60
流动相
40
20
滞流的 流动相
0 1 2
Sub-2 µm
3 4 5 6
w1/2
固定相
0
扩散
The Van Deemter Equation
A = 涡流扩散－多径扩散 B = 自由分子扩散 C = 传质阻力 HETP
B u
吸滤头
材料：不锈钢(或陶瓷)烧结，孔径10um
故障：堵塞
表现：管路中不断有气泡生成 措施：用异丙醇（或5％稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水 清洗
Need Not Be Greater Than 1.2
不同分离度比较
Poor efficiency Moderate selectivity R=1
Poor efficiency Good selectivity
R = 1.5
Excellent efficiency Poor selectivity R = 0.5
色谱起源
M. S. Tswett 1906年，俄国植物学家M.S. Tswett 命名这种应用吸附原理分离物质的新方 法为色谱(Chromatography)； 1952年，James和Matrin发明了气 相色谱法；
60年代末，高效液相色谱（HPLC） 崛起； 21世纪，超高压色谱、多维色谱等出现 使得色谱技术进入了飞速发展阶段；
缓冲盐
常用代表性的弱酸的pKa值
pK1 醋酸 柠檬酸 磷酸 4.87 3.13 2.16 4.76 7.21 6.40 12.32 pK2 pK3
缓冲液
缓冲液的使用
使用前必须过滤 使用后一定要进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损、阻塞:
用含5%甲醇的水溶液冲洗30min（1ml/min），再用甲醇 冲洗30min 用纯水冲洗泵头清洗管路 易受到细菌和霉菌的影响
Analyst, Talanta, Journal of Separation Science, Recent Patents on Nanotechnology,Separation Science & Technology, Current Pharmaceutical Analysis,《环境化学》 等国内外知名刊物评
色谱研究方向
• 高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 气相色谱 Gas Chromatography (GC) 薄层色谱 Thin-Layer Chromatography (TLC) 凝胶电泳 Gel Electrophoresis(GE) 毛细管电泳 Capillary Electrophoresis(CE) 毛细管电色谱 Capillary Electrochromatography(CEC)
60
Sub-2 µm particles
40
20
w1/2
6
w1/2
0
5
0
1
tR
7
2
3
4
5
tR
6
7
Dispersion due to eddy diffusion or multi-path effect
扩散
在液相中影响小 在低流速中影响大 B = 自由分子扩散－纵向扩散
Zero linear velocity
流动相
• 溶剂的等级 – HPLC级 – 优级纯 – 分析纯
微量分析、梯度洗脱
都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒） 优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂 HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质
有机溶剂的等级
• 分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图
Excellent efficiency Moderate selectivity
R=4
•
（ 1）
分配系数
KA≠KB 或k’A≠k’B 是色谱分离的前提!
• （2）容量因子“k’”：
t R－t0 , • k '＝ 溶质在固定相中的量 或： k＝ 溶质在流动相中的量 t0 •
k’
k’ k’β
思考：为什么要优 化流动相比例？
液相色谱分离原理
吸附：物质在两相界面上浓集的现象
色谱法的分离原理：溶于流动相(mobile phase)中的 各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子交换、排阻、 亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不 同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层 析法。
主持科研项目：
1.国家自然科学基金 2.教育部博士点（新教师类）基金 3.中国博士后基金 4.福建省自然科学基金 5.福建省教育厅基金 6.校科技发展基金
审人。目前，已在国际权威刊物上发表 SCI论文20多篇，申请国家发明2项。 目前已发表SCI论文二十余篇，代表性论文：
(1) Anal.Chem, 2006,78,5322-5328(IF=5.9); (2)J.Chromatogr.A, 2007,1170,118-121.(IF=4.2) (3)J.Chromatogr.A, 2009,1216,8612-8622.(IF=4.2); (4) J. Mater. Chem., 2011,21,518-524. (IF=5.1) (5)J.Chromatogr.A, 2010, 1217, 4507-4510.(IF=4.2); (6)mun., 2011,47, 9675-9677.(IF=5.8) ;
垫圈
– 一旦固定，垫圈不可再动
PEEK接头
不锈钢接头
主要用于色谱柱、检测器的连接
– 易于安装 – 能承受 250 kgf/cm2压力
– 容易产生死体积
PEEK接头
死体积
• 死体积可能会引起分离度变差和重现性变差等问题.
公螺母
死体积
管线
好的连接
差的连接
流动相
选择原则 • 采用 “HPLC” 级溶剂 • 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 • 对试样有适宜的溶解度 • 溶剂粘度要小 • 与检测器相匹配
H E T P
B
3
w1/2
线速度
4
Very low linear velocity
mAU 80
5
6
tR
60
40
20
w1/2
0 1
0
At or above optimum linear velocity
2
3
4
5
tR
6