莪术油对大鼠乳腺癌癌前病变MVD及相关调控因子VEGF／FLK表达的干预作用研究

１．３检测指标 ①乳腺组织病理观察：比较增生特点、细胞分级、ＤＮＡ倍体分析。观察ＤＭＢＡ诱导乳腺癌 癌前病变造模结果。观察莪术油对乳腺癌癌前病变的干预作用。 ②免疫组化法检；测ＣＤ３４标记微血管密度ＭＶＤ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ和相关受体ＦＬＫ—ｌ的蛋白表达； ③ＩＰＰ图像处理系统：对免疫组化、原位杂交结果进行定量分析。 ２．实验结果 ２．１大鼠一般情况 至实验结束大鼠存活情况为空白组１２只、病模组１０只、莪术油组９只、康莱特组１０只、 ＴＡＭ组８只，共４９只。
２０１１年中医外科学术年会论文集
腺增生病具有明显心身疾病的特点，祖国医学以舒肝理气的逍遥散施治取得较好疗效即为佐
证。 本研究发现，治疗前１２０例乳腺增生患者的汉密顿抑郁量表（ＨＡＭＤ）平均积分为１９．４３，
属于轻度抑郁的程度，治疗后平均积分为１３．２８，有明显的下降，与治疗前比较Ｐ＜Ｏ．０５， 但尚未降到８（无抑郁）以下；治疗前患者的汉密顿焦虑量表（ＨＡＭＡ）平均积分为１３．３７， 接近肯定焦虑的程度，治疗后平均积分为９．４６，有明显的下降，与治疗前比较Ｐ＜Ｏ．０５，但 尚未降到７（无焦虑）以下。由此可见，乳腺增生患者的抑郁、焦虑水平均高于健康成年人， 虽然经过为期３个月的系统治疗，症状体征明显改善，抑郁、焦虑水平亦明显降低，但这类 人群仍有一定的抑郁、焦虑倾向。因此在临床诊疗过程中，医师应重视对乳腺增生患者的情 绪治疗与心理疏导，耐心地倾听患者的陈述，增加必要的健康宣教，打消患者的顾虑和猜疑， 同时运用医学和心理学两方面的技能为患者解除病痛。
管生成的作用不确切（ｐ＞Ｏ．０５）。 莪术油组与康莱特组对照有显著差异，可显著降低ＭｖＤ表达（Ｐ＜０．０１）；与三苯氧胺组
对照无显著差异（ｐ＞０．０５）。莪术油能够有效抑制乳腺组织的血管生成，作用与三苯氧胺相
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近，优于康莱特组，提示莪术油通过影响血管生成，抑制或逆转乳腺组织增生，是逆转乳腺 癌的又一机制。
２．２
ＭＶＤ面密度值变化
表１
ＭＶＤ面密度值比较（ｉ±ｓ）
与空白对照组对照，疾病模型组口Ｐ＜０．０５，提示疾病模型组ＭＶＤ显著增高，大鼠乳腺癌 前病变阶段微血管密度显著增高。 与疾病模型组对照，莪术油组和三苯氧胺组木Ｐ＜０．０１，提示两组均可显著降｛ｋｉＭＶＤ阳性 腺上皮细胞百分率表达；康莱特组ＭＶＤ表达与疾病模型组无显著差异，提示康莱特组抑制血
著差异（ｐ＞０．０５）
莪术油组与康莱特组对照有显著差异，可显著降低ＦＬＫ表达（Ｐ＜０．０１）；与三苯氧胺组 对照无显著差异（ｐ＞０．０５）。莪术油能够有效抑制乳腺组织的血管生成调控因子受体ＦＬＫ表达， 作用与三苯氧胺相近，优于康莱特组，提示莪术油逆转血管生成相关因子ＶＥＧＦ及受体ＦＬＫ表
达，影响血管生成，抑制或逆转乳腺组织的增生。 ３讨论
莪术油对大鼠乳腺癌癌前病变ＭＶＤ及相关调控因子ＶＥＧＦ／ＦＬＫ表达的干预作用研 究
刘晓菲１，宋爱莉１，李静蔚１，殷玉琨ｌ １山东中医药大学附属医院乳腺外科济南２５００１１
乳腺癌癌前病变是乳腺癌发生的重要阶段，与血管生成密切相关。本研究拟建立化学致 癌齐ＩＪＤＭＢＡ诱导大鼠乳腺癌癌前病变模型，观察莪术油的调控作用，以ＴＡＭ为对照。检测乳腺 导管上皮细胞、间质细胞、血管内皮细胞的血管生长因子（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ）及其受体（ＦＬＫ一１） 的蛋白表达。研究乳腺癌癌前病变与血管生长因子的相关性，从阻断血管生成的角度探讨莪 术油对乳腺癌癌前病变的干预治疗机理及量效关系，阐明抗血管生成的作用靶点和作用机 制，为中医药逆转乳癌癌前病变、预防乳腺癌提供理论依据和治疗方法。 乳腺癌癌前病变的研究与血管生成、细胞凋亡的研究紧密联系［１］。近年研究发现，血 管生成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）与乳腺良性疾病恶变、肿瘤的发生、发展、转移和预后均有密切的关 系［２，３，４］。既往在血管生成与乳腺癌癌前病变的实验中发现，从轻度非典型增生、中重度 非典型增生到乳腺癌，各组血管密度（ＭｖＤ）逐渐增高，研究证实乳腺癌癌前病变与血管生
莪术油对大鼠乳腺癌癌前病变组织中ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ表达的影响
宋爱莉许振国殷玉琨李静蔚刘晓菲孙子渊
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莪术油对大鼠乳腺癌癌前病变MVD及相关调控因子 VEGF／FLK表达的干预作用研究
作者： 作者单位： 刘晓菲， 宋爱莉， 李静蔚， 殷玉琨 山东中医药大学附属医院乳腺外科 济南 250011
３．１莪术油对乳腺癌前病变大鼠微血管密度ＭＶＤ的影响 ＤＭＢＡ复制乳腺癌癌前病变大鼠模型后乳腺组织的乳腺癌癌前病变大鼠微血管密度表达 显著增高，随之增生——癌前病变——癌变的病变进程而呈现增高趋势，表１显示莪术油组、 三苯氧胺组均能显著降低乳腺癌癌前病变大鼠ＭＶＤ，莪术油能够有效抑Ｎ－孚ｔ，腺组织的血管生 成，作用与三苯氧胺相近，优于康莱特组。 ３．２莪术油对乳腺癌前病变大鼠血管生成调控因子ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ（ＦＬＫ）的影响 ＤＭＢＡ复制乳腺癌癌前病变大鼠模型后乳腺组织的乳腺癌癌前病变大鼠微血管密度表达 显著增高，随之增生——癌前病变——癌变的病变进程而呈现增高趋势，表２，３显示莪术 油组、三苯氧胺组均能显著降低乳腺癌癌前病变大鼠ＶＥＧＦ及受体ＦＬＫ表达，作用与三苯氧 胺相近，优于康莱特组。提示莪术油通过干预血管生成及相关调控因子的机制达到干预乳腺
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（ＤＭＢＡ）１ ００ｍｇ／ｋｇ。
（３）时间：造模后第１０周开始给予药物治疗４周，实验时间共１４周。 （４）取材：实验结束前一天大鼠胸部脱毛；麻醉方法：戊巴比妥３０ｍｇ／ｋｇ腹腔注射；取
第３、４、５对乳房放入中性福尔马林液中固定。 （５）统计方法：方差分析或ｔ检验，应用ＳＡＳ统计软件。
模型组无显著差异（ｐ＞０．０５）
莪术油组与康莱特组对照有显著差异，可显著降低ＶＥＧＦ表达（Ｐ＜０．０１）：与三苯氧胺组 对照无显著差异（ｐ＞Ｏ．０５）。莪术油能够有效抑制乳腺组织的血管生成调控因子ＶＥＧＦ表达， 作用与三苯氧胺相近，优于康莱特组，提示莪术油逆转血管生成相关因子ＶＥＧＦ表达，影响血
管生成，抑制或逆转乳腺组织的增生。
２．４
ＦＬＫ面密度值变化
表３
ＦＬＫ面密度值（阳性腺上皮细胞百分率）比较（．ｉ示疾病模型组ＶＥＧＦ受体ＦＬＫ［ｊＮ性腺上皮细 胞百分率显著增高，大鼠乳腺癌前病变阶段ＦＬＫ表达率显著增高。
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２０１１年中医外科学术年会论文集
与疾病模型组对照，莪术油组和三苯氧胺组木Ｐ＜０．０１，提示两组均可显著降＇ｆ氐ＦＬＫ阳性 腺上皮细胞百分率，有效降低了腺上皮细胞ＦＬＫ的表达。康莱特组ＦＬＫ表达与疾病模型组无显
成的关系。研究乳腺癌癌前病变阶段血管生成和ＶＥＧＦ及受体ｆｌｋ相关调控因子的表达，运用
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２０１１年中医外科学术年会论文集
中药从抗血管生成角度阻断、逆转乳腺癌癌前病变的进展，对乳腺癌的二级预防具有重要的
临床意义。
１材料与方法 １．１实验动物及材料 动物：６周龄健康、未育、ＳＤ系雌性大鼠７２只，清洁级。 试剂：即用型ＳＡＢＣ试剂盒、ＤＡＢ－氨基联苯胺显色试剂盒、即用型ＳＡＢＣ试剂盒、ＤＡＢ－－－－氨 基联苯胺显色试剂盒、兔抗人／鼠ＶＥＧＦ抗体、ＦＬＫ－１多克隆抗体等，ＶＥＧＦ、ＦＬＫ一１的ｍＲＮＡ水平 探针及试剂盒等。 仪器：光学显微镜、隔水式电热恒温培养箱、ＩＰＰ图像处理系统、ＤＮＡ分析系统、流式细
２．３
ＶＥＧＦ面密度值变化
表２
ＶＥＧＦ面密度值（阳性腺上皮细胞百分率）比较（ｙ±ｓ）
与空白对照组对照，疾病模型组ＯＰ＜０．０５，提示疾病模型组ＶＥＧＦ［ｊＨ性腺上皮细胞百分 率显著增高，大鼠乳腺癌前病变阶段ＶＥＧＦ表达率显著增高。 与疾病模型组对照，莪术油中剂量组和三苯氧胺组木Ｐ＜０．０ｌ，提示两组均可显著降低 ＶＥＧＦ［ｊＮ性腺上皮细胞百分率，有效降低了腺上皮细胞ＶＥＧＦ的表达。康莱特组ＶＥＧＦ表达与疾病
ｌｍＬ／１００９腹腔注射。
③疾病模型组（１５只）：一次性灌胃ＤＭＢＡｌＯＯｍｇ／ｋｇ（１ｍＬ／ｌＯＯｇ），第ｌＯ周开始生理盐水
ｌｍＬ／ｌＯＯｇ腹腔注射。
④康莱特组（１５只）：在造模的基础上，第１０周开始康莱特２ｍＬ／ｌＯＯｇ腹腔注射。 ⑤三苯氧胺组（１５只）：在造模的基础上，第１０周开始三苯氧胺２ｍＬ／ｌＯＯｇ灌胃。 （２）造模方法：动物适应环境饲养一周后，一次性胃灌服７，１２一二甲基苯并葸
本文链接：/Conference_7689268.aspx
癌前病变的目的。
我们在既往研究［３］乳腺增生、乳腺癌前变人体组织及动物实验课题中发现在乳腺增生 阶段已有血管新生，ＭＶＤ（微血管密度）、ＶＥＧＦ、ＰＣＮＡ（细胞增殖核抗原）表达上调［６］［７］。 在癌前变阶段，运用彩色Ｂ超多普勒在人体乳腺组织中明显探测到新生血管血流，且随着单 纯乳腺增生一癌前病变一乳腺癌的病机演变，新生血管显著增多，血流密度分级增高，ＶＥＧＦ、 ｂＦＧＦ及受体表达增多，且与病理组织增生分级呈显著相关，反映出在癌前病变这一特殊阶 段与血管生成、血管生长因子有密切的相关性。本实验验证了莪术油干预乳腺癌癌前病变的 作用机制，莪术油具有降低乳腺癌癌前病变大鼠乳腺血管生成及相关调控因子表达的作用。
胞仪。
药品：二甲基苯并葸（ＤＭＢＡ）、莪术油注射液、三苯氧胺。 １．２实验方法 将大鼠７２只随机分５组，初始一次性胃灌服７，１２一二甲基苯并葸（ＤＭＢＡ）ｌＯＯｍｇ／ｋｇ，饲养 至９周制造大鼠乳腺癌癌前病变模型。 空白对照组（１２只）：一次性灌胃生理盐水ｌｍＬ／１００９，第１０周开始生理盐水ｌｍＬ／１００９腹 腔注射，常规饲养１４周。疾病模型组（１５只）：一次性灌胃ＤＭＢＡｌＯＯｍｇ／ｋｇ（１ｍＬ／１００９），第 １０周开始生理盐水ｌｍＬ／１００９腹腔注射，常规饲养１４周。莪术油组（１５只）：在造模的基础上， 第１０周开始莪术油２ｍＬ／ｌＯＯｇ腹腔注射，常规饲养１４周。康莱特组（１５只）：在造模的基础上， 第１０周开始康莱特２ｍＬ／ｌＯＯｇ腹腔注射，常规饲养１４周。三苯氧胺组（１５只）：在造模的基础上， 第１０周开始三苯氧胺２ｍＬ／ｌＯＯｇ灌胃，常规饲养１４周。 （１）分组：将大鼠７２只随机分５组。 ①空白对照组（１２只）：空白对照组（１２只）：一次性灌胃生理盐水ｌｍＬ／１００９，第１０周开 始生理盐水ＩｍＬ／ｌＯＯｇ腹腔注射。 ②疾病模型组（１５只）：一次性灌胃ＤＭＢＡｌＯＯｍｇ／ｋｇ（ｉｍＬ／１００９），第１０周开始生理盐水