相对荧光定量PCR的常用方法和注意事项
定量pcr的方法
定量pcr的方法定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是一种在实验室中常用的分子生物学技术，旨在定量测定DNA或RNA分子的相对丰度。
本文将详细介绍定量PCR的原理、操作步骤以及应用领域。
一、定量PCR的原理定量PCR的原理基于聚合酶链反应（PCR）技术，该技术通过复制模板DNA 或RNA分子的特定片段来实现特异性扩增，从而产生大量复制产物。
在定量PCR 中，引入一种特定的荧光探针，该荧光探针与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的数量与初始模板分子量成正比，因此可以通过测量荧光信号的强度来定量PCR产物中的特定DNA或RNA分子序列的相对丰度。
二、定量PCR的操作步骤1. 制备PCR反应体系：将反应缓冲液、模板DNA或RNA、引物、荧光探针、聚合酶、核苷酸和水混合制备反应体系。
反应体系中的核苷酸是用来提供DNA 或RNA的基本成分。
2. 热循环条件设置：选择合适的PCR仪，并设置合适的热循环条件。
热循环的三个步骤包括变性、退火和扩增。
3. 变性步骤：将反应体系加热至高温，通常为94-98，使DNA或RNA解性，即DNA双链分离，RNA变性为单链，使模板分子可供扩增。
4. 退火步骤：降低温度到引物特异性结合的温度，引物会与模板分子特异性结合，这通常在50-65之间进行。
5. 扩增步骤：将退火的反应体系加热至合适的温度，通常为72，此时聚合酶开始合成新的DNA链，延伸引物。
该步骤重复多次，每次扩增会产生两倍数量的DNA或RNA分子。
6. 荧光检测：在PCR反应进行过程中，荧光探针会与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的强度与扩增产品的数量成正比。
7. 数据分析：使用特定的软件来分析荧光信号数据，将其转化为反应物的初始模板浓度。
可以通过比较不同样本的荧光信号强度来定量比较DNA或RNA的相对丰度。
定量PCR的实验流程及注意事项
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
扩增子设计
● 扩增子长度：75-200bp ● 避免二级结构 ● 利用mFold 分析二级结构
借助熔解曲线分析结果
10,000 copies of input nucleic acid
80 copies
Amplicon
Nonspecific product
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
好的引物及扩增子设计
● 提高扩增反应的效率 ● 提高反应的特异性、减少非特异性扩增 ● 提高产量和灵敏度 ● 减少多重PCR的交叉影响
准确、可重复的结果
引物设计
● 避免二级结构 ● GC含量控制在50-60% ● 连续的G或C不超过3个碱基 ● 5’末端不含G
通过引物设计提高特异性
● BLAST ● 使用SYBR Green方法时考虑到以后采用探针法 ● 进行多重PCR的可能 ● 测试多个引物对 ● 选择无引物二聚体且扩增效率最高的引物对
未知样品 标准品梯度 阳性对照 阴性对照 基因组对照
● 校准生物学误差：看家基因 ● 降低其余误差： 样品重复实验
重复
● 定量PCR中样本（包括对照及标准品）一般需要3个重复 ● 一般重复间允许的差异≤0.5Ct（理想的状态≤0.25Ct） ● 理想的重复:
¾ 准备反应体系master mix, 包括样本 ¾ 使用热启动taq酶，避免非特异产物的扩增 ¾ 分装mix时使用一个枪头 ¾ 充分旋涡震荡5秒以上
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
荧光定量PCR是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测来对PCR产物进行实时定量分析的技术。
1. 原理：
荧光定量PCR利用荧光染料或者荧光探针，标记扩增过程中的每一个循环的产物，这些荧光标记的产物在激发光的作用下会发出荧光。
随着反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号也随之增强。
通过对荧光信号的实时监测，可以推断出样本中起始模板的数量。
2. 方法：
主要方法包括探针法、SYBR Green I染料法和分子信标法等。
探针法使用与目标序列特异性结合的荧光探针来标记PCR产物。
SYBR Green I染料法则是利用染料与双链DNA的结合特性，将染料添加到反应体系中，随着PCR产物的增加，染料的荧光信号也增强。
3. 注意事项：
荧光定量PCR对样品纯度要求较高，应避免杂质的干扰。
反应体系中的成分和浓度需要精确控制，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR的结果解读需要参考标准曲线，以确定未知样本中的目标序列数量。
4. 在临床与科研中的应用：
在临床应用中，荧光定量PCR被广泛用于病原体检测、基因突变分析、遗传病诊断以及癌症研究等。
例如，用于检测病毒如HIV、HBV等的载量，或者检测癌症相关基因的表达水平。
在科研领域，荧光定量PCR可用于基因表达分析、基因组学和表观遗传学研究中。
例如，比较不同组织或细胞类型的基因表达差异，或者研究表观遗传修饰对基因表达的影响。
总的来说，荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量分析方法，对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
7500荧光定量PCR仪使用说明(相对定量)
7500荧光定量PCR仪使用说明
注意事项：
实验过程必须戴干净的一次性乳胶手套进行操作。
PCR反应所用的96孔板、8联管或单管必须适合ABI7500专用，禁止使用凸盖PCR管。
（以下过程按字母顺序a→q进行操作）
创建反应板文件
双击电脑桌面上SDS软件图标 打开SDS软件；
在对话框中选择Create New Document…，或选择菜单栏File > New；
为每个反应孔指定探针和任务
为反应孔设置样品名
使用8联管两侧需用空管支撑，使用单管四角需用空管支撑，以防止板槽受力不均。
实验数据用格式化U盘拷ຫໍສະໝຸດ ，数据可暂存于本机电脑硬盘中，各实验室D盘中有指定文件夹，中心外部人员数据存于“FUWU”文件夹下的子文件夹中。
操作步骤
开机
依次打开电脑显示屏、主机，输入开机密码“7500”。
放入反应板
注：关闭仪器托盘时，应按一个角度推压托盘的右侧。
荧光PCR定量质量控制及防污染措施
荧光PCR定量质量控制及防污染措施解放军第三0⼆医院王海滨写在课前的话近⼏年在临床检测病毒核酸和细菌核酸上，荧光定量PCR技术越来越⼴泛。
但是如何进⾏治疗控制以及出现污染后怎样进⾏清除污染？本⽂主要讲述怎样来防⽌污染的产⽣。
⼀、荧光PCR定量的概述（⼀）荧光PCR定量的原理实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加⼊荧光基团，利⽤荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进⾏定量分析的⽅法。
常规的PCR也就是电泳PCR，它是合成⼀个正向引物和反向引物为⽬的模板，即DNA或RNA作为⼀个模板扩增，扩增后通过跑电泳的⽅式来检测它存在与否，是相对量的变化。
由于跑电泳经常导致产物外泄，因此污染的⼏率⽐较⾼。
近⼏年 PCR 扩增时在参⼊⼀对引物的同时参⼊单个特异性的荧光探针，该探针为⼀寡核苷酸，两端分别标记单个报告荧光基团和单个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时， Taq 酶的5'端～3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从⽽荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增⼀条 DNA 链，就有单个荧光分⼦构成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物构成完全同步。
通过荧光物质参⼊和TapMan探针技术来做实时荧光PCR,避免了电泳检测结果的过程,使整个PCR过程从扩增到检测都在⼀个封闭的状态。
荧光集团⽬前临床常⽤的有两个，⼀个是SYBR green，⼀个是TapMan探针。
SYBR green是⼀类荧光染料，能与所有的 DNA 双链相结合，对 DNA 模板没有选择性，所以特异性不如 TaqMan 探针。
变性后双螺旋变成单链，然后作为扩增的模板。
在扩增的过程中由变性到负性扩出了另⼀条链和模板DNA进⾏退⽕变成双链。
这时SYBR green染料与 DNA 双链结合,发出荧光信号。
⽤SYBR green荧光染料来作为指⽰剂时，中间要加⼀个溶解曲线来证实它的特异性的问题。
荧光定量PCR应用指南
荧光定量PCR应用指南荧光定量PCR（Fluorescent quantitative PCR）是依靠荧光信号的强度来定量PCR产物的一种PCR技术。
该技术通过在PCR反应体系中添加特异性荧光探针，利用荧光信号的强度来反映PCR产物的数量。
荧光定量PCR在生物医学研究、基因表达分析、致病微生物检测等领域有着广泛的应用。
下面将介绍荧光定量PCR的原理、实验步骤和一些注意事项。
一、原理：荧光定量PCR最常用的荧光探针是TaqMan探针，TaqMan探针是由两个DNA引物和一个荧光标记的探针组成。
当PCR反应进行到延伸阶段时，引物和探针结合到靶序列上形成荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过检测荧光信号的强度可以定量PCR产物的数量。
二、实验步骤：1.设计引物和探针：选择特异性的引物和探针对目标序列进行扩增。
引物和探针的设计需要遵循一些原则，如避免引物和探针之间的自互补性、探针需选择合适的荧光染料等。
2.准备PCR反应体系：根据PCR反应需要，准备PCR反应体系。
一般包括模板DNA、引物、探针、聚合酶、缓冲液等。
3.荧光定量PCR反应：将PCR反应体系加入到荧光定量PCR仪中，进行PCR反应。
PCR反应的条件需要根据目标序列的特性进行优化，包括温度、延伸时间等。
4.数据分析：通过荧光定量PCR仪记录荧光信号的强度，根据荧光信号的强度可以反应PCR产物的数量。
通过数据分析软件对荧光信号进行定量计算，获得PCR产物的数量。
三、注意事项：1.引物和探针的设计需要严格控制，确保其特异性，避免与非靶序列结合。
2.PCR反应的条件需要进行优化，不同的目标序列可能需要不同的温度、延伸时间等。
3.控制实验中的阳性对照和阴性对照，确保实验结果的可靠性。
4.严格遵守无菌操作，避免PCR反应体系受到外源性污染。
5.选择合适的荧光定量PCR仪进行实验，确保获得准确的荧光信号强度数据。
6.实验过程中需严格按照操作规程进行，避免操作失误对实验结果产生影响。
荧光定量PCR技术的使用教程
荧光定量PCR技术的使用教程PCR（聚合酶链式反应）技术是分子生物学中常用的实验手段之一，它可以扩增起始序列的DNA片段。
荧光定量PCR技术是PCR技术的一种改进方法，它结合了PCR扩增和荧光检测技术，可以对扩增产物进行精确的定量分析。
本文将详细介绍荧光定量PCR技术的使用步骤和相关注意事项。
第一步：准备实验材料与试剂在进行荧光定量PCR实验前，首先需要准备好以下实验材料和试剂：1. DNA模板：可以是DNA提取物、血浆、组织样本等。
2. 引物（Primer）：引物对应于目标序列的两端，用于扩增DNA片段。
应选择合适的引物，包括正向引物和反向引物。
3. 标记荧光的探针（Probe）：探针可以是DNA分子、RNA分子或合成的寡核苷酸，用于检测PCR扩增产物。
4. dNTPs混合液：包含dATP、dCTP、dGTP和dUTP。
5. 磷酸缓冲液：用于维持PCR反应的酸碱平衡。
6. DNA聚合酶：用于酶切和DNA复制。
7. MgCl2：用于在PCR反应体系中提供镁离子。
8. 蒸馏水：用于稀释试剂和制备反应体系。
第二步：制备PCR反应体系1. 在无菌试管中依次加入如下试剂，制备PCR反应体系：- 1 μL DNA模板- 1 μL 正向引物- 1 μL 反向引物- 0.5 μL 荧光探针- 10 μL 2× PCR反应缓冲液- 0.5 μL 10 mM dNTPs混合液- 0.2 μL DNA聚合酶- 1 μL 25 mM MgCl2- 35.8 μL 蒸馏水注意：根据实验需求和试剂浓度的不同，反应体系中有时需要调整试剂的用量。
2. 轻轻混匀试管中的液体，避免形成气泡。
第三步：进行PCR扩增反应1. 将PCR反应体系分装至PCR管或96孔板中。
2. 将PCR管或96孔板放入PCR仪中，并设置合适的PCR程序。
- 初始变性：95°C，5分钟- 循环变性：95°C，30秒- 退火温度：根据引物的Tm值进行调整，通常为50-65°C，持续30秒- 延伸：72°C，持续1分钟- 终止延伸：72°C，10分钟3. 根据需要，可以设置PCR程序的循环次数。
pcr相对定量原理
pcr相对定量原理
PCR相对定量是一种常用的实验方法，用于测量目标基因在样品中的相对表达水平。
该方法基于聚合酶链反应（PCR）的原理，通过共扩增目标基因和内参基因，利用其在不同样品中的扩增产物浓度比值来间接推断目标基因的表达水平。
PCR相对定量的步骤通常包括以下几个关键步骤：首先，需要设计合适的引物，这些引物需要特异性地扩增目标基因和内参基因。
接下来，在PCR反应中，需要将反转录的RNA转换为cDNA，并与引物和适当的PCR反应缓冲液一起添加到PCR管中。
然后，在一系列PCR循环中，通过不断的变性、退火和延伸步骤，使DNA序列得以扩增。
最后，通过凝胶电泳、荧光测量等方法，可以测量PCR扩增产物的浓度，并计算出目标基因与内参基因之间的相对表达水平。
PCR相对定量的关键在于选择一个合适的内参基因。
内参基因通常是在不同样品中表达稳定且不受待测条件影响的基因。
通过将目标基因的表达水平与内参基因的表达水平相对比，可以消除样品间的差异，提高实验结果的可靠性。
需要注意的是，PCR相对定量的结果仅能提供一种相对的表达量信息，并不能给出精确的绝对表达水平。
因此，在进行PCR相对定量实验时，需要进行适当的内部对照组设计和统计分析，以确保实验结果的准确性和可靠性。
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相对定量方法实际操作
（常用方法）
1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置）
1).先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个
基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。
2).同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中
公式：
P1 P2
F=2—
待检样品看
家基因平均
Ct值
对照组目的
基因平均Ct
值
对照组看家
基因平均Ct
值
—
待检样品目
的基因平均
Ct值
——
Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用
1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点
是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。
2). 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真
实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。
3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基
因和看家基因做两组标准曲线。
Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于
0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量
分析。
反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。
此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。
应用实例：
如上图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。
软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。
从上图可知，两组标准曲线的M值分别为-3.525和-3.467，两者的
差值<0.1，因此，这组看家基因和目的基因可以用Comparative Delta-delta Ct 法两进行相对定量。
在完成上述预实验之后，接下来就可以正式对待测样品进行定量分析。
在该实验中，分别对待测样品的看家基因和目的基因进行扩增，下图即为一个标准的扩增分析结果：
为进行Comparative Delta-delta Ct分析，需要对样品进行一些编辑。
简而言之，即将目的基因和看家基因分别编辑在两页中（page），并将同一样品命名成相同名称。
在该实验中，分别对三个样品A、B、C进行了分析，其中1-9号管检测了看家基因，10-18号管检测了目的基因。
可通过NEW 新建一个page ，并通过Selected 选择每页中分析的对像。
将两组基因分别编辑在两页中，并将相同的样品命名成同一名称后，即为下图所示：
样品编辑好后就可进行分析工作。
通过进入Analysis ，分别对page1和page2进行分析。
注意：由于没有标准品，软件无法自动给出阈值，需用手动设定，软件会提示需手动进行阈值设定，此时只要点中右侧按扭，在荧光曲线图中上下拖
动光标即可。
完成两页分析之后，再进入Delta Delta CT 分析界面，选择show ，此时，软件的向导界面会提示使用者一步步完成设置：
Page 2：目的基因，其中10-18号管通过YES 选中，样品分别命名为A 、B 、C ，其它未选中的样品可以不进行编辑。
Page 1：看家基因，其中1-9号管通过YES 选中，样品分别命名为A 、B 、C ，其它未选中的样品可以不进行编辑。
由上至下，依次完成各项设置。
第一项：Validation Run Performed，提示是否已验证过两个基因的扩增效率一致，可用该定量方法进行分析。
选择Yes；
第二项：Gene of Interest Quantitation，选中Page 1或Page 2中编辑了目的基因的那一页；
第三项：Normaliser Quantitation，选中Page 1或Page 2中编辑了看家基因的那一页；
第四项：Calibrator Defined，选中A、B、C三个样品中用来作为对照组的一个。
完成上述四项设置之后，在窗口右侧就显示相对定量结果，如图所示：
结果给出三个样品目的基因和看家基因的平均CT值，以及样品B、C中目的基因的浓度相对于对照组A的比值。
2. 双标准曲线法定量流程（RG6000软件设置）
1). 用双标准曲线法定量时，每次每个基因都需要做目的基因和看家基因的标准
曲线，必需有一组稳定的标准品。
2). 同一样品做标准曲线，分别对目的基因和看家基因做标准曲线，分列在两页
上。
公式：
（基因的浓度由软件根据标准曲线直接给出）
P1 P2
分别分析P1和P2页
选Two Standard Curve 选项
依次填入，并定义对照样品
完成分析
待测样品看家基因浓度 对照组目的基因浓度 对照组看家基因浓度
F= 待测样品目的基因浓度
双标准曲线法的特点、注意事项及实际应用
1. 双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-delta
CT法那样对实验进行严格的优化。
2. 其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。
3. 并且，如果用于做标准曲线的标准品不同于样品，比如标准品为质粒或纯化
的PCR产物，而待测样品为cDNA，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况，因此以标准曲线来计算样品的实际浓度就存在一定误差。
应用实例：
在该实验中，样品管1-6为目的基因的标准曲线，7-12为看家基因的标准曲线，待测样品A、B、C，其中15-17扩增了样品的看家基因，18-20扩增了样品的目的基因。
在用双标准曲线法做相对定量之前，同样需要对样品进行一些编辑。
方法与Delta-delta CT 法类似，即将所有目的基因编辑在一个page 里，所有看家基因编辑在另一个page 里，且相同的样品以同样名称命名。
编辑完成之后即得：
样品编辑好后就可进行分析工作。
进入Analysis ，分别对page1和page2进行分析。
完成分析之后，从Other 进入，选择2 Standard Curves Relative Quantitation 。
根据提示向导依次完成设置。
依次选中目的基因的page 、看家基因的page 以及对照组（例，以A 为对照组），如图：
Page 1：看家基因，其中7-12号管为标准曲线，通过YES 选中，15-17号管为待测样品，分别命名为A 、B 、C ，其它未选中的样品可不以不进行编辑。
Page 2：目的基因，其中1-6号管为标
准曲线，通过YES 选中，18-20号管为待测样品，分别命名为A 、B 、C ，其它未选中的样品可不以不进行编辑。
结果包括计算所得的各标准品及待测样品的浓度及CT值，以及样品B、C的目的基因相对于对照组A的浓度。
3. Comparative Quantitation法定量流程（RG6000软件设置）
1). 该方法并不常用，因为必需确定起始样品的总核酸浓度一致。
在芯片验
证时使用较多，但同样也必需有起始浓度一致的核酸样品。
2). 作为常规的基因表达调控研究，建议研究者使用前两种定量方法。
3). 该方法通过拐点时的循环数来进行相对定量比较，重复性更好。
4). 该方法操作非常简便，无需做标准曲线及设置内参。
使用时，样品均定
义为unknown，分析时选用Comparative Quantitation，确定对照组，
完成分析。
应用实例：
用Comparative Quantitation法进行定量分析时，在保证起始总核酸量一致的前提下，只要对目的基因进行扩增即可，例：待测样品A、B、C，扩增目的基因。
进入Analysis，在Other中选择Comparative Quantitation。
选中后点击Show即给出分析结果。
上图左下方即相对表达量的结果，其中Rep.Conc为样品B、C相对于对照组A 的目的基因浓度。
右侧，可通过修改Calibrator Replicate改变对照组，以获得
不同的比较结果。
在Report中同样给出拐点图和相对定量的比值结果：。