菌种选育方法
菌种选育的常用途径
菌种选育的常用途径引言菌种选育是一种重要的微生物学研究领域，通过对不同菌种的筛选和改良，可以获得具有特定功能的菌株，应用于农业、医药、食品等领域。
本文将详细介绍菌种选育的常用途径，包括菌种筛选、遗传改良和代谢工程等方面。
菌种筛选菌种筛选是菌种选育的第一步，通过对大量的菌株进行筛选，找到具有特定功能的菌种。
常用的菌种筛选途径包括：1. 传统筛选法传统筛选法是指通过传统的培养基和培养条件，观察菌株在不同环境下的生长情况和代谢产物的产量，从中选出具有优良性状的菌株。
这种方法简单易行，但效率较低。
2. 高通量筛选法高通量筛选法是利用自动化设备和高通量平台，对大量的菌株进行快速筛选。
常用的高通量筛选方法包括微孔板筛选、流式细胞术和荧光素酶报告基因等。
这种方法高效快速，能够同时处理多个菌株。
3. 分子生物学筛选法分子生物学筛选法是通过对菌株的基因组进行分析，筛选出具有目标基因或特定代谢途径的菌株。
常用的分子生物学筛选方法包括PCR技术、基因芯片和下一代测序等。
这种方法能够准确地确定菌株的遗传特征，对于寻找具有特定功能的菌株具有重要意义。
遗传改良遗传改良是菌种选育的关键步骤，通过对菌株的基因进行改造或调控，使其具有更好的性状和功能。
常用的遗传改良途径包括：1. 诱变诱变是指通过物理或化学手段对菌株的基因进行改变，产生突变体。
常用的诱变方法包括辐射诱变和化学诱变。
诱变可以导致菌株的遗传多样性增加，从而增加筛选到具有特定功能的菌株的概率。
2. 基因工程基因工程是指通过外源基因的引入或菌株内部基因的改造，使菌株具有特定的性状和功能。
常用的基因工程方法包括基因克隆、基因敲除和基因表达调控等。
基因工程可以准确地改变菌株的遗传特征，实现对菌株的精确改良。
3. 重组DNA技术重组DNA技术是指通过DNA片段的重组和重排，实现对菌株基因组的改造。
常用的重组DNA技术包括PCR扩增、限制酶切和连接等。
重组DNA技术可以实现对菌株基因组的精确改造，为菌种选育提供了有力的工具。
常用菌种选育原理的种植方法
常用菌种选育原理的种植方法今天给大家介绍一下常用菌种选育原理的种植方法！一、人工选种的方法：1.自然选种：该法是通过广泛异地引种、野生采集、孢子分离等途径获得菌种，将其进行驯化移栽，使其逐渐适应当地环境条件，并从中选优汰劣，选出性状优异的菌株。
在菌种生产以及试验性栽培中，反复进行比较和选择，最终确定优良的食用菌品种。
2.杂交育种：该法是通过将不同遗传性状的亲本之间进行交配，使遗传物质重新组合配对，通过双亲性状的优势互补或借助于以一个亲本的优点去克服另一亲本的缺点，产生具有其双亲优点的育种方法。
杂交育种一般有单孢杂交、多孢杂交、单双核杂交、原生质体融合等方法，一般科研、育种上多采用单孢杂交或原生质体融合，通过这些办法处理的菌种常常可表现出较强的“杂交优势”。
3.诱变育种该法是利用物理的或化学的方法处理细胞群体，促使菌种的细胞遗传物质发生性状的改变，然后从变异的菌种中选出具有优良性状的菌种的方法。
科研上常用的主要有辐射诱变育种，如紫外线照射、X射线等高能量射线，以及用一些化学药剂进行诱变育种。
4.基因工程育种该法是在基因分子水平上的遗传工程，又称基因操作、基因克隆、脱氧核糖核酸（DNA）重组技术等，基本原理就是把我们需要的目标基因通过载体DNA与原品种的DNA结合，然后人工导入一个受体细胞内，以让外来的遗传物质在其中“着生”，进行正常的复制，从而获得预先设计的新菌种。
二、菌种分离技术方法：多孢分离：该法是利用子实体弹射许多孢子在同一培养基上，让其萌发、自由交配，从而获得纯母种的方法。
该法简便易行，在食用菌选种中应用普遍。
（1）整菇孢子弹射法：该法适用于伞菌类的孢子采集。
在无菌室（箱）中，将经消毒处理的整只种菇插入无菌平皿孢子收集器里，之后使用透明玻璃钟罩将其罩住，于见光、适温下使菇自然弹射孢子。
24h后，将玻璃钟罩打开，从培养皿内获取孢子。
（2）试管插割法：在无菌箱内，迅速用无菌试管插割种菇有菌褶一侧，直至取下组织块。
选育优良菌种的方法
选育优良菌种的方法
如何选育优良菌种：
一、筛选有利环境：
1.搜集不同地域不同时期的信息，并结合本地环境，筛选出有利的菌源；
2.对筛选出来的地域进行微生物调查分析；
3.比较等温滴虫、红螨等不同菌株的生长状况，根据客观数据选取稳健的菌种；
二、模拟适应土壤环境：
1.调查分析当地土壤成分，模拟土壤成分；
2.根据不同的营养液和施肥技术，选定优质菌种；
3.鉴定在该土壤条件下，菌株对病原因子的防护效果；
三、采用现代诊断技术：
1.检测菌株表征参数，核实其属种和类型；
2.运用基因测序技术，分析各菌株的遗传参数；
3.应用肿瘤细胞毒力实验和抗真菌、抗紫外、抗旱性等试验，了解菌株的适应性；
四、利用抗性强的优良菌株：
1.评价菌株抗药性、抗内毒素和危害生物毒素等；
2.运用合成细菌表面多肽技术，选育出抗性较强的菌株；
3.利用基因组学、代谢途径学和蛋白质组学等技术，筛选出优良菌株；
五、调节和分离菌株：
1.搜集真菌素、定殖菌素和合成腐植酸等抑制剂，精选优良菌株；
2.测定菌株有效期，并跟踪观测菌株的抗性情况；
3.对菌株进行浓度调节、分离分离，实现菌种的增殖和分布；
六、结语：
选育优良菌种是一个复杂的过程，需要综合运用各种现代技术，根据土壤环境、地域信息以及防护效果等多方面综合分析，逐步搜索、筛选、繁衍和种植过程，才能找到适应于环境的优良菌种。
选育菌种的方法
选育菌种的方法一、引言菌种的选育是微生物学研究中的重要环节，它对于促进农业、食品工业、医药领域的发展具有重要意义。
本文将介绍一些常用的选育菌种的方法，包括传统的筛选方法和基于分子生物学的筛选方法。
二、传统的筛选方法1. 随机筛选法随机筛选法是最常用的菌种选育方法之一。
其步骤包括：从自然环境中收集样品，如土壤、水体等，将样品制成适宜的培养基，然后进行培养。
在培养过程中，通过观察菌落的形态、颜色、生长速度等特征，筛选出具有特殊性状或功能的菌株。
2. 生理选育法生理选育法是根据菌株的生理特性进行选育的方法。
通过调节培养条件，如温度、pH值、氧气浓度等，筛选出适应特殊环境的菌株。
例如，有些菌株能够在高温或低温环境中生长，有些菌株能够在酸性或碱性环境中生长，这些菌株可以被应用于相关领域。
3. 抗性筛选法抗性筛选法是利用抗生素或其他抑制性物质来筛选菌株的方法。
通过将菌株培养在含有抗生素或抑制性物质的培养基上，只有具有抗性的菌株才能够生长并形成菌落。
这种方法可以筛选出具有抗生素抗性、耐酸碱或耐高温的菌株。
三、基于分子生物学的筛选方法1. PCR筛选法PCR筛选法是利用聚合酶链反应(PCR)技术来筛选菌株的方法。
通过设计特异性引物，扩增目标基因片段，然后通过电泳分析扩增产物，筛选出具有特定基因的菌株。
2. 基因克隆筛选法基因克隆筛选法是将目标基因插入表达载体中，然后转化到宿主菌中，通过观察宿主菌的表型变化来筛选菌株。
例如，将具有抗性基因的载体转化到宿主菌中，只有转化成功的菌株才能够生长在含有抗生素的培养基上。
3. 荧光筛选法荧光筛选法是利用荧光蛋白标记目标基因，通过观察菌株产生的荧光信号来筛选菌株。
例如，将荧光蛋白基因与目标基因融合，将融合基因转化到宿主菌中，通过观察菌株产生的荧光信号来筛选具有目标基因的菌株。
四、总结菌种的选育是微生物学研究中不可或缺的一环。
传统的筛选方法包括随机筛选法、生理选育法和抗性筛选法，它们通过观察菌株的形态、生长特性和抗性等来筛选菌株。
选育菌种的方法
选育菌种的方法菌种的选育是微生物研究中的重要环节，合适的菌种对于实验结果的准确性和可靠性起着至关重要的作用。
本文将介绍几种常用的选育菌种的方法。
1. 采样菌种的选育首先需要进行采样，即从自然环境中获取潜在的菌种。
采样时需要选择合适的样品，如土壤、水样、植物表面等，以获取丰富的微生物资源。
采样时要注意避免污染和混杂，使用无菌工具和容器进行采样。
2. 前处理采样回来后，需要进行前处理，以去除不需要的杂质和其他微生物。
常用的前处理方法包括表面消毒、筛选、稀释等。
表面消毒可以使用酒精或含氯消毒剂对样品进行处理，以杀灭表面的细菌和真菌。
筛选可以通过过滤或离心等方法，以去除大颗粒的杂质。
稀释可以将样品进行适当的稀释，以分离出单个菌落。
3. 菌落分离菌种的选育需要从复杂的微生物群落中分离出单个菌落。
常用的方法有平板分离法和液体分离法。
平板分离法是将前处理后的样品均匀涂布在含有适宜培养基的琼脂平板上，通过菌落的形态、颜色等特征进行分离。
液体分离法是将前处理后的样品接种在含有适宜培养基的液体培养基中，通过菌落的沉降速度、浑浊度等特征进行分离。
4. 纯化与鉴定分离出的单个菌落需要进行纯化和鉴定。
纯化是指将单个菌落进行传代培养，使其形成纯种。
常用的方法有传代培养、穿刺法等。
鉴定是指对菌种进行鉴定和分类，常用的方法有形态学观察、生理生化特性检测、基因测序等。
鉴定的目的是确定菌种的物种分类、代谢特性和潜在应用价值。
5. 保存与培养选育出的菌种需要进行保存和培养，以便后续的研究和应用。
保存常用的方法有冷冻保存、干燥保存、液氮保存等。
培养则需要选择适宜的培养基和培养条件，以保证菌种的生长和繁殖。
通过以上几种方法，可以选育出适合研究和应用的菌种。
菌种的选育是微生物研究中的重要环节，只有选育出合适的菌种，才能保证实验结果的准确性和可靠性。
选育菌种需要耐心和细心，同时还需要对微生物的特性有一定的了解和认识，以便进行正确的操作和判断。
菌种选育
基因工程育种
随着DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前，特别是当人们了解到遗传密码是由RNA转录 表达的以后，生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设想在分子的水平上去 干预生物的遗传特性。 如果将一种生物的DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA 重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后 代的传统做法完全不同。 这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那 种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由 重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。 基因工程是生物 工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。 所谓基因工程 （genetic engineering)是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体 细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物 的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接 起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的 复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。
步骤
自然选育的步骤主要是：采样，增长培养，培养分离和筛选等。采样 筛选的菌种采集的对象以土壤为主， 也可以是植物、腐败物品和某些水域等。土壤是微生物的汇集地，从土壤中几乎可以分离到任何所需的微生物， 故土壤往往是首选的采集目标。微生物的营养需求和代谢类型与生长环境有很大关系。富集培养 由于采集样品 中各种微生物数量有很大差异，若估计到要分离的菌种数量不多时，就要人为增加分离的概率，增加该菌种的数 量，称为富集培养。纯种培养尽管通过增长培养的效果很好，但是得到的微生物还是处于混杂状态，因为样品中 本身含有许多种类的微生物。所以，为了取得所需的微生物纯种，增殖培养后必须进行分离。平板分离法由接种 环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物 细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后， 可在平板表面得到单菌落。分离方法有三种：即划线分离法、稀释法和组织分离法。稀释分离法 在溶液中再加 入溶剂使溶液的浓度变小。亦指加溶剂于溶液中以减小溶液浓度的过程。浓溶液的质量×浓溶液的质量分数=稀溶 液的质量×稀溶液的质量分数生产能力考察 初筛一般通过平板稀释法获得单个菌落，然后对各个菌落进行有关 性状的初步测定，从中选出具有优良性状的菌落。例如，对抗生素产生菌来说，选出抑菌圈大的菌落；对于蛋白 酶产生菌来说，选出透明圈大的菌落。此法快速、简便，结果直观性强。缺点是培养皿的培养条件与三角瓶、发 酵罐的培养条件相差大，两者结果常不一致。
五种菌种选育的方法
五种菌种选育的方法1. 筛选优良菌株：通过对菌种进行筛选，选出具有较高产量、快速生长、稳定性等良好性状的菌株。
可以通过观察菌株的形态特征、生长速度以及产物产量等指标进行初步筛选。
2. 交配选育：将具有不同有益特征的两个菌株进行交配，产生具有更优秀性状的杂种，进一步提高菌种的产量和品质。
3. 基因工程改良：通过基因工程技术对菌株的基因进行修改和调整，强化其有益性状，例如提高产量、耐逆性或产物纯度。
4. 微生物育种：利用微生物的自然变异、诱变或基因重组等方法，通过筛选和选育，培育出具有优良性状的菌株。
5. 隔离培养：从自然环境或特定寄主体内分离出有良好性状的菌株，单独培养并进行繁殖，以保持其稳定性和纯度。
6. 高通量筛选：利用高通量技术，如高通量测序、高通量筛选装置等，对大量菌株进行快速筛选和检测，以选取具有优良性状的菌株。
7. 环境适应培养：通过将菌株暴露在不同环境条件下，如不同温度、盐度、pH值等，挑选出能适应多种环境的菌株，提高其应用广泛性和稳定性。
8. 选择性培养基：根据特定的性状需求，调配选择性培养基，利用特定生理功能或代谢产物的需求，筛选出具有目标性状的菌株。
9. 抗菌素筛选：利用抗菌素对菌株进行筛选，选择出对某种特定抗菌素敏感或耐药的菌株，为后续应用提供基础。
10. 应激培养：通过暴露菌株于适宜剂量的外界应激因子，如氧化应激、低温应激等，筛选出对应激因子具有较高耐受能力的菌株。
11. 连续培养：通过在连续培养系统中进行菌株的增殖和筛选，选出适应此种培养方式的优良菌株。
12. 自动化选育：利用自动化系统对菌株进行快速筛选、监控和评价，提高选育效率和可控性。
13. 发酵条件优化：通过改变发酵条件中的温度、pH值、气体供应等参数，优化菌株的生长和产物产量，提高其应用效果。
14. 组合选育：将具有不同优势特征的菌株进行组合，形成互补优势，从而提高整体产量和产品品质。
15. 代谢工程优化：通过调整和改变菌株的代谢途径和代谢产物分布，来增强产物的产量和纯度。
菌种选育方法
组 织 或 细 胞 染 色 体 D N A
限 制 性 内 切 酶
基因片段
克隆载体
重 组 DNA分 子
受体菌
精选完含 整pp重 t课件组 分 用细胞总mRNA 制备全套双链cDNA后， 建立的基因。简称 c－。cDNA
复制
双链cDNA 载体
精选完整ppt课件
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工程菌不稳定性的表现(倾向)
工程菌的不稳定包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个 方面。
质粒的丢失；
由于质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是两种菌的 混合物。在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的 比生长速率往往小于不含重组质粒的比生长速率，即宿 主细胞的生长优势对工程菌的发酵极为不利。
精选完整ppt课件
17
（二）克隆载体的选择
精选完整ppt课件
18
（三）外源基因与载体的连接
粘性末端连接
GGATCC GGATCC CCTAGG CCTAGG
G GATC GCGAT CCTG AGCCTG AG
DNA连接酶
GGATCC
CCTG AG
精选完整ppt课件
19
（四）重组DNA导入受体菌
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22
抗药性标记选择（插入失活法）：
将目的基因插入带ampr和tetr基因的载 体中，则tetr基因失活。在分别 含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中 培养，进行筛选。
精选完整ppt课件
23
精选完整ppt课件
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标志补救（marker rescue）
若目的基因能够在宿主菌表达，且表达 产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对 营养素的依赖表型来筛选。
精选完整ppt课件
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如转化后用选择压力确定含有重组质粒的克隆株，而在利用克隆菌进行
发酵生产时，经常采取施加选择压力的方法消除重组质粒的不稳定，以
提高菌体纯度和发酵生产率。
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施加选择压力
A 抗生素添加法 通常在重组质粒上含有抗药性基因。在克隆菌发酵
时，于培养基中加入适量的相应抗生素，可阻止丢失了重组质粒的非生 产菌的生长。
生物工艺学
2 菌种选育(4)
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1
主要内容
菌种选育
自然选育
诱变育种
抗噬菌体菌株的选育
杂交育种
原生质体融合技术
DNA重组技术
菌种保藏
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2
2.2.6 DNA重组技术
概述
基因工程（genetic engineering） ：在生物体外，通过对 DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行 改造和重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组 基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物（70年代， 基于DNA限制新性内切酶、DNA连接酶的发现） 。
产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对
营养素的依赖表型来筛选。精品课件
25
分子杂交法：
利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素 膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子 杂交，直接选择并鉴定目的基因。
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26
菌落(或噬菌体)原位杂交
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27
2. 非直接选择法：
免疫学方法：利用特异抗体与目的
重组质粒发生DNA片段脱落；
表达产物不稳定。
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工程菌不稳定性的原因
工程菌稳定与否，与重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理 和遗传性及环境条件等因素有关。
质粒本身的分子结构：引起工程菌不稳定常常是由于稳定区 受到影响。另外可能由于重组质粒上有重复序列，或与宿主 染色体有部分同源等都会造成质粒的不稳定
以dNTP为底物催化DNA的合成反应。
上述三个步骤为一个循环，经25～30次循
环后，可将模板DNA扩增达百精品万课倍件 。
17
（二）克隆载体的选精品择课件
18
GGATCC GGATCC CCTAGG CCTAGG
G GATC GCGAT CCTG AGCCTG AG
DNA连接酶
GGATCC
（三）外源基因与载C体C 的连T接G AG
PCR的反应体系：模板DNA、特异性引物、 DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸(dNTP) 及含有Mg2＋的缓冲液。
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16
PCR的基本反应步骤：
1. 变性：将反应系统加热至95℃ ，使
模板DNA完全变性成为单链；
2. 退火：将温度下降至50℃左右，使引
物与模板DNA退火结合；
3. 延伸：将温度升DNA后， 建立的基因。简称 c－。mRNA逆转录酶
cDNA
复制
双链cDNA
载体
重 组 DNA分 子
受体菌
含 重 组 分 子 的 转 化 菌
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15
PCR
PCR是根据DNA复制的原理，在体外利用 酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA 的专门技术。
4. 聚合酶链反应（polym精e品r课as件e chain reactiD N A
限 制 性 内 切 酶
基因片段
克隆载体
存在于转化细菌内， 由克隆载体所携体菌 精含 品课件重 组 分 子 的 转 化 菌 14
宿主：除上述质粒中有同源序列外，还与宿主的比生长速率、 宿主中重组基因(rec系统)的完整性、重组时有关基因的具 体变异等都有关系。
培养环境：高温、去垢剂(如SDS等)、某些药物(如利福平)、 染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的丢失。
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41
防止或降低工程菌的不稳定性
(1)组建合适载体 在质粒构建时，插入一段特殊的DNA片段或基因
基因工程主要包括两个步骤：
获得目的基因，取得基因的载体，使二者进行体外重组。
将重组的DNA转化到受体的活细胞中去，改变受体细胞的遗 传特性。
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3
精品课件
4
基因工程过程示意图
① ②
③ ④
⑤ ⑥
精品课件
①从细胞中分 离出DNA
②限制酶截取 DNA片断
③分离大肠杆 菌中的质粒
④ DNA重组
⑤用重组质粒 转化大肠杆菌
转化的确切机制还不清楚
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35
重组子筛选-蓝白筛选
精品课件
36
DNA重组－重组子的筛选及表达菌株的转化
重组质粒的提取
表达菌株感受态细胞的制备
转化及复苏
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37
外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
细胞 破碎
培养
蛋白 分离
滤
凝胶
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
免疫
纸
分析
SDS－PAGE
NC 膜
转膜免疫分析
＋
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38
精品课件
30
2 质粒DNA的提取
从含pETBlue-2(或pET21a)质粒的K12菌株提取
精品课件
31
3 DNA重组－限制性酶切和连接
酶 切 反 应 体 系（ 20 uL ）
管号
核酸
10xbufferK
ddH2 O
目的基因
tube1 AKP
2 uL
0 uL
16 uL
10 uL
tube2 pETBlue-2
or pET-21a
ddH2O
T4DNA连接酶
X uL
2 uL
Y uL
1 uL
♦ 140C连接过夜。 ♦ －200C保存，用于转化受体细胞。
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34
大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化
感受态（Competence)： NovaBlue是一种适合用作初始克隆宿主菌的K-12菌 株，细菌处于容易吸收外源DNA的状态
和目的基因而设计的筛选方法。其特
点是直接测定基因或基因表型。
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抗药性标记选择（插入失活法）：
将目的基因插入带ampr和tetr基因的载
体中，则tetr基因失活。在分别
含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中
培养，进行筛选。
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标志补救（marker rescue）
若目的基因能够在宿主菌表达，且表达
以使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。
(2)选择适当宿主 重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗
传特性的影响，住选择宿主时，必须确定其遗传特点。相对而言重组质 粒在大肠杆菌中比较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。
(3)施加选择压力 在重组DNA技术中，有好几个方面利用选择压力，
转化（transformation)： 异源DNA分子导入受体细胞的过程
致敏过程: 用理化方法诱导细胞进入感受态的操作
细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外援DNA形成抗DNA酶 的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短时间420C热激处理,促进细 胞吸收DNA复合物
复苏：细菌在非选择性培养基上保温一段时间，使抗性的表型表达后再 转到含抗性的选择性培养基上，长出来的菌落即为转入了外源基因的菌 落
⑥培养大肠杆菌 克隆大量基因
5
基因工程过程流程图
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6
限制性内切酶
1. 分布：主要在微生物中。 2. 特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切 割特定切点。 3. 结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。 4. 举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC 序列，并在G和A之间切开。
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❖ 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的 切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。
工程菌的稳定性问题
由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、人生长激素、 乙肝表面抗原、人促红细胞生成素(EPO)、重组激酶、集落 刺激因子GM-CSF等，成本大大下降
研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出
不稳定性，因而工程菌稳定性的解决已日益受到重视，并成
为基因工程这一高技术成就转变为生产力的关键之一。
（5）控制培养条件 克隆菌所处的环境条件对其质粒的稳定性和表
达效率影响机制错综复杂的而众多的环境因素中，培养基组成、培养温 度、菌体的比生长速率三方面尤为重要，对已经组建完成的克隆菌来说， 选择最合适的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。
（6）可转移性因子会促进插入和丢失的出现，因此所使用的质粒不
粘性末端连接
精品课件
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（四）重组DNA导入受体菌
导入方式：
转化
转导
精品课件
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（五）重组体的筛选
重组DNA导入受体菌后，经过培 养使其大量繁殖，再设法将含有目的 基因的菌落区分鉴定出来，这一过程 即为筛选（screening）精或品课选件 择（selection）。 21
1. 直接选择法： 针对载体携带某种或某些标志基因
基因表达产物相互作用进行筛选。包括：
免疫化学方法
酶免检测法
精品课件
28
（六）克隆基因的表达
表达体系的建立：
表达载体的构建
受体细胞的建立
表达产物的分离、精品纯课件化
29
举例：碱性磷酸酶基因工程菌的构建
2000bp 1000bp
PCR 扩增产物电泳结果
1 PCR基因扩增及扩增产物的回收-碱性磷酸酶基因获得
精品课件
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工程菌不稳定性的表现(倾向)
工程菌的不稳定包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个 方面。