感受态细胞种类比较
高考生物真题专项解析—转基因生物,从基因工程中溯源
高考生物真题专项解析—转基因生物，从基因工程中溯源考向一基因工程【母题来源】2022年全国乙卷【母题题文】(2022·全国·高考真题)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。
回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。
这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是______，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。
根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA 中的______来进行。
PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明______(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明______。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。
已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。
为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。
基因工程的基本操作流程是______。
[答案](1)逆转录酶##反转录酶(2) 特异性核苷酸序列退火##复性(3) 曾感染新冠病毒，已康复已感染新冠病毒，是患者(4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生S蛋白)【试题解析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；过程：①高温变性：DNA解旋过程(PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开)；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
(1)分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR法需要先得到cDNA，由RNA 到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶(反转录酶)。
生物选修3知识点整理
效率低
第一页，编辑于星期三：六点 五分。
3.运载体
(1)作用：
①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。 ②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。 (2)种类：质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。
(3)条件：
①有一个或多个限制酶切位点 ②能自我复制
③有标记基因
（4）一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求， 因此在基因工程中，对某些天然的载体进行人工改造。
③卵黄膜封闭作用---防止多精入卵的第二道屏障
④入卵后，尾部脱离，核膜破裂，形成雄原核 同时卵子被激活，完成减二分裂，形成雌原核
第十六页，编辑于星期三：六点 五分。
5.卵裂期：透明带内进行，胚胎总体积略减小，细胞行有丝分裂 6.桑椹胚（32个），之前每个细胞都具全能性
7.囊胚：内细胞团 滋养层
8.透明带破裂：孵化
2）DNA的拼接技术---基因工程
17.基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质
18.蛋白质工程：第二代基因工程
基因修饰或基因合成
第八页，编辑于星期三：六点 五分。
第二章 细胞工程
1.植物的组织培养 离体的组织、器官或细胞
一、植物细胞工程 脱分化
愈伤组织
再分化
植物体
外植体
营养：蔗糖、矿质元素（无机盐）
无机盐、维生素、激素、 氨基酸、核苷酸、葡萄糖、 血清 液体培养基
细胞全能性
脱毒植株、微型繁殖、人工种子
获得新植株
蔗糖、矿质元素、维生素、 植物 激素、有机添加剂 固体培养基
第十二页，编辑于星期三：六点 五分。
ห้องสมุดไป่ตู้
（二）动物体细胞核移植技术 原理：动物细胞核的全能性
各种感受态细胞
5
2011年7月
⑵ 质粒DNA的质量和浓度 A. 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率 与外源DNA的浓度在一定范围内成正比； B. 对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转 化效率低； C. 重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状 重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10100倍。
3
9）向管内加入800ul的无抗LB培养液，37 ℃培养 45分钟。
2011年7月
10）取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的 LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温 放置几分钟。
2011年7月
37 ℃培养45分钟
热击转化实验回顾
37 ℃培养45分钟
2011年7月
谢谢大家！ 祝：身体健康， 学习愉快！
6
原理：受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法， CaCl2等化学试剂法）处理后，细胞膜的通透性发生 变化，能容许外源DNA分子通过。
感受态细胞
2011年7月
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）细 胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种 生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定 的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
3.1 实验材料与仪器准备
E. coli DH5α菌；LB液体培养基； LB固体培养基；100 mmol/L CaCl2溶液。
2011年7月
高速冷冻离心机
恒温摇床
制冰机
3.2 CaCl2法制备感受态细胞及热击转化 2011年7月
1）从 LB 平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落， 接种于2.5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养 12h 左右。
重组DNA导入受体细胞
2、原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：
原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性 系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到的也 多是无特异性空间结构的多肽链。 原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统， 而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧 链的糖基化或磷酸化等修饰作用。 原核生物细胞内源性蛋白酶易降解空间构象不正 确的异源蛋白，造成表达产物不稳定等。
转化因子的吸收。双链 DNA 分子与结合蛋白 作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而 另一条链则被吸收到受体菌中。 整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复 合物前体结构，它能有效地保护单链DNA免受各 种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色 体DNA处。 转化因子单链DNA的整合。供体单链DNA片段通 过同源重组，置换受体染色体DNA的同源区域， 形成异源杂合双链 DNA结构。
从遗传性考虑： 重组缺陷型recA－，用于基因扩增或高效表达的
受体细胞（recA-）
限制系统的缺陷，或是修饰系统的缺陷。避免 对外源DNA的除解。外切酶和内切酶活性缺陷
（recB-，recC-，hsdR-）
与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与 载体选择标记互补的表型）
具有较高的转化效率
二、受体细胞
受体细胞(receptor cell)：又称为宿主细胞 (host cell)，是指能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞 感受态(competence)：是指细菌吸收外源DNA的 生理状态。 感受态细胞(competence cell)：是指具有接受外 源DNA能力的细胞。
受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋 白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细 胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达。
感受态细胞种类比较
Gene type
特点
用途说明
DH5α
F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ（lacZYA-argF）U169, hsdR17（rK-, λ-）
种常用于质粒克隆的菌株。其Φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。
分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。
BL21（DE3）
F- ompT gal dcm lon hsdSB（rB- mB-）λ（DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5）
该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。
The two strains are E. coli B/r strains and do not contain the lon protease. They are also deficient in the outer membrane protease, OmpT. The lack of these proteases reduces degradation of heterologous proteins expressed in the strains.
蛋白质表达。
BL21（DE3）plysS
F- ompT gal dcm lon hsdSB（rB- mB-）λ（DE3）pLysS（cmR）
基因工程简答题总结
基因工程原理复习题思考题5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。
同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。
同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。
分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。
不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。
）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。
不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。
7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。
（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。
2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。
这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。
3、足够多的载体和插入片段是最重要的。
4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修饰过的T7 DNA聚合酶6）逆转录酶7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
EColi感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速 颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变 性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构
色，可确定DNA在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素：
DNA的分子大小； 琼脂糖浓度； DNA构象； 电场强度； 碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。
三．实验材料与设备：
1、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养 箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速 离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝 胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰 上放置2～3min；
溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部 分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep 管中；
7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀， 室温放置2min. 8、 12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙 醇洗涤一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸 上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含20 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或 TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约 8min)，存于－20℃或直接用于酶切。
BL21
Chaperone Competent Cells BL21系列使 用 说 明 书TaKaRa Code : D9120-9125制品说明 Chaperone Competent Cells BL21 Set 是由分别转化一种伴侣蛋白质粒（Chaperone Plasmid Set (TaKaRa Code：D3340)）的E.coliBL21制成的感受态细胞。
可直接转化靶蛋白表达质粒。
E.coli BL21来源于B 株，为Lon 蛋白水解酶、omp T 外膜蛋白水解酶缺陷型，因此,表达的外源蛋白在该体系中有更高的稳定性，常用于表达外源蛋白。
然而，在E.coli 中表达的外源蛋白常常会发生各种问题，例如，形成不溶的包涵体（Inclusion bodies）等。
原因大多是表达的蛋白质没有进行正确的折叠。
本制品中含有五种类型的质粒(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16)，每一种质粒都是能有效表达一组协同作用、共同参与蛋白折叠的被称作“Chaperone team”的分子伴侣。
靶蛋白与其中一种“Chaperone team”共同表达，便可增加可溶性蛋白质的回收比率，而用通常方法，由于包涵体的形成，这些表达蛋白质常常是不可回收的。
当进行靶蛋白与“Chaperone team”共表达实验时，通常需要三步：1. 用伴侣蛋白质粒转化宿主E.coli ；2. 用转化体制备感受态细胞；3. 靶蛋白表达质粒转化感受态细胞。
如果使用本产品，只需一步转化就可构建靶蛋白与“Chaperone team”的共表达体系，因为使用的E.coli BL21感受态细胞已转化有一种伴侣蛋白质粒。
Chaperone Competent Cells BL21有五种类型，非常适合于表达外源蛋白。
但该产品不适合于启动子为T7的蛋白质表达体系：如pET系列，因为作为宿主E.coli BL21株不表达T7 RNA 聚合酶。
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BL21 StarTM(DE3):
F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcmrne131(DE3)
The two strains carry a mutated rne gene (rne131) which encodes a truncated RNase E enzyme that lacks the ability to degrade mRNA, resulting in an increase in mRNA stability.
蛋白质表达。
BL21（DE3）plysS
F- ompT gal dcm lon hsdSB（rB- mB-）λ（DE3）pLysS（cmR）
该菌株带有pLysS,具有氯霉素抗性。此质粒还有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。
分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。
JM109
endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ（lac-proAB）e14- [F' traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]hsdR17（rK-mK+）。
部分抗性缺陷，适合重复基因表达，可用于M13克隆序列测定和蓝白斑筛选。
用于真核蛋白表达（表达稀有密码子）
分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。
BL21（DE3）
F- ompT gal dcm lon hsdSB（rB- mB-）λ（DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5）
该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。
BL21 Star (DE3)pLysS carries the pLysS plasmid which produces T7 lysozyme (see page 1). The BL21 Star (DE3) strain does not carry a plasmid expressing T7 lysozyme.
Rosetta™2 host strains are BL21 derivatives designed to enhance the expression of eukaryotic proteins thatcontain codons rarely used in E. coli. These strains supply tRNAs for 7 rare codones (AGA, AGG, AUA, CUA,GGA, CCC, and CGG) on a compatible chloramphenicol-resistant plasmid. The tRNA genes are driven by theirnative promoters.
The two strains are E. coli B/r strains and do not contain the lon protease. They are also deficient in the outer membrane protease, OmpT. The lack of these proteases reduces degradation of heterologous proteins expressed in the strains.
Expressing Heterologous Genes
BL21 StarTM(DE3)pLysS:
F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcm rne131(DE3) pLysS (CamR)
RosettaTM2 Competent Cells
F- ompT hsdSB(rB-MB-) gal dcm pRARE2 (CamR)
名称
Gene typeV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ（lacZYA-argF）U169, hsdR17（rK-, λ-）
种常用于质粒克隆的菌株。其Φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。