第5章 间接凝集反应技术

第五章间接凝集反应技术(Indirect agglutination reaction technique)一、概述（一）原理可溶性抗原（或抗体）吸附于免疫学反应无关的颗粒（称为载体）表面上，当这些致敏的颗粒与相应的抗体（或抗原）相遇时，就会产生特异性的结合，在电解质参与下，这些颗粒就会发生凝集现象。

这种借助于载体的抗原抗体凝集现象就叫做间接凝集反应。

载体的存在使反应的敏感性得以大大提高。

间接凝集反应的优点为：①敏感性强：间接凝集反应是最敏感性的血清学反应方法之一，可以检测到微量的抗体和抗原；②快速：一般1h～2h即可判定结果，若在玻板上进行，则只需几分钟；③特异性强；④使用方便、简单。

（二）载体具有吸附抗原（或抗体）的载体很多，如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物的红血球、某些细菌等。

良好载体有如下几点基本要求：①在生理盐水或缓冲液无自凝倾向；②大小均匀；③比重与介质相似，短时间内不能沉淀；④无化学或血清学活性；⑤吸附抗原（或抗体）后，不影响其活性。

目前应用最广的是人的O型红血球和绵羊红血球。

而后者应用更广，因为其来源方便。

另外绵羊红血球的表面有大量的（约1 000个以上）糖蛋白受体，极易吸附某些抗原物质，吸附性能好，且大小均匀一致。

（三）间接凝集的分类1．根据载体的不同，可分为间接炭凝、间接乳胶凝集和间接血凝等。

2．根据吸附物不同可分为间接凝集反应（吸附抗原）和反向间接凝集反应（吸附抗体）。

3．根据反应目的不同，又可分为间接凝集抑制反应和反向间接凝集抑制反应。

·1·4．根据用量和器材的不同又可分为试管法（全量法）、凹窝板法（半微量法）和反应板法（微量法）。

二、间接炭凝反应（一）原理间接炭凝集反应简称炭凝。

它是以炭粉微粒作为载体，将已知的抗体球蛋白吸附于这种载体上，形成炭粉抗体复合物，当炭血清与相应的抗原相遇时，二者发生特异性结合，形成肉眼可见的炭微粒凝集块。

目前炭凝反应已用于炭疽、鼠疫和马副伤寒性流产等病的诊断。

（二）材料与试剂1．炭粉炭粉粒子最好大小在0.12mm～0.15mm，目前市场上出售的炭粉均不合要求，必须过300目／寸的标准筛以300r／min离心去沉淀，再以3 000r／min 离心去上清，收集沉淀物。

2．高免血清3．待测标本4．灭活兔血清5．正常血清6．标准抗原7．0.05mol/L pH7.2PBS液8．1％硼酸的PBS液（三）操作方法1．炭致敏取湿炭粉0.25g（干粉0.10g），加入经56℃～60℃灭活30min的稀释高免血清3ml，充分摇匀，置37℃致敏30min，不时摇动，取出后用pH 7.2 PBS 液洗涤3次。

最后一次用含1％硼酸和1％兔血清的PBS液洗涤一次，离心去上清，再取此液3ml，混匀即可。

同时以正常血清致敏的炭粒处理，以作对照。

致敏血清（加1/万硫柳汞防腐）于室温或4℃冰箱中保存，一年内有效。

2．取洁净玻璃板一块，以玻璃铅笔划成小格，加被检标本0.10ml，再加免疫炭血清0.05ml，充分混匀，静止1min~5min，判定结果。

同时设三个对照：⑴免疫炭血清+标准抗原。

⑵正常炭血清+标准抗原。

·2·⑶正常炭血清加待检抗原。

（四）结果判定在对照完全成立的情况下，判定本试验结果：“＋＋＋＋”：炭粉全部凝集，液体完全清亮透明。

“＋＋＋”：炭粉大部分凝集，液体透明。

“＋＋”：炭粉一半凝集，液体较透明。

“＋”：炭粉微凝集，但与对照有差别，液体混浊。

“—”：炭粉不凝集，液体不透明。

炭凝以“＋＋”做为反应滴度的终点。

三、反向间接乳胶凝集反应（一）原理同炭凝，只是载体换为聚苯乙烯乳胶，它是一种由0.6μm～0.7μm的颗粒所组成的胶体溶液，具有良好的吸附蛋白质的性能。

间接乳胶凝集目前已用于鼠疫菌、沙门氏菌、流感杆菌、脑膜炎双球菌、葡萄球菌肠毒素等的诊断。

（二）材料与试剂1．聚苯乙烯乳胶2．免疫血清3．正常血清4．标准抗原5．待检抗原6．0.02Mol/L pH8.2硼酸缓冲液硼砂 6.67g硼酸8.04gH2O 加至 1 000ml7．生理盐水（三）操作方法1．乳胶液制备取聚苯乙烯乳胶0.10ml，加灭菌蒸馏水0.40ml，再加pH8.2硼酸缓冲液2ml，混合后即为25倍稀释的乳胶液。

·3·2．乳胶致敏在上述乳胶液中滴加稀释的免疫血清0.20ml～0.70ml，边加边摇，当出现肉眼可见的颗粒后，仍继续加血清，直至颗粒消失，成为均匀的乳胶悬液为止。

镜下检查应无自凝。

使用时，应与一定稀释度的相应抗原出现阳性反应，与生理盐水出现阴性反应为合格。

加防腐剂后，于冰箱内保存。

注意防止冰冻。

同时以正常血清代替免疫血清进行乳胶致敏，以作对照。

3．取洁净玻板一块，用玻璃铅笔划成小格，滴加待检样品0.10ml，再滴加高免血清致敏乳胶0.01ml，以牙签或火柴杆混匀，在3min内判定结果。

（四）结果判定“＋＋＋＋”：全部乳胶凝集，成絮状团块，液体清亮。

“＋＋＋”：大部分乳胶凝集成较小的颗粒，液体清亮。

“＋＋”：半量乳胶凝集成细小颗粒，液体混浊。

“＋”：较少量的乳胶凝集成可见的细颗粒，液体混浊。

“－”：全部乳胶仍为均匀液体，无颗粒。

以“＋＋”作为该反应滴度的终点。

四、间接红血球凝集反应间接红血球凝集反应（简称间接血凝）是间接凝集反应中应用最广的一种方法。

（一）原理以红血球为载体的间接凝集反应叫做间接血凝。

将抗原吸附在红血球上用以检测微量抗体称为正向间接血凝，以抗体吸附于红血球上，检测相应的抗原，称为反向间接血凝。

用抗原吸附红血球，一般比较容易，但用免疫血清吸附红血球，则困难得多，而且往往不易获得良好的结果，因为免疫血清中的成分非常复杂。

许多其他蛋白质和非抗体活性的免疫球蛋白占据红血球的表面，而影响血球的特异性凝集。

（二）材料与试剂1．红血球2．反应板分聚苯乙烯塑料板和有机玻璃板（聚甲基丙烯酸甲酯），每板又有96孔和72孔两种规格。

按孔型又可分为V和U型两种，V型具有更典型的凝集模型，U型有时比V型的血清效价高1～2孔。

反应板不能煮沸消毒和浸泡于来苏儿水中。

消毒可用0.5％甲醛溶液，1％新洁尔灭及紫外线照射等。

·4·3．稀释棒由合金制成。

棒头有8条沟，吸液量为0.025ml，通过火焰，使表面氧化变粗易于吸取液体。

它的作用是蘸取、转移、混合液体。

为了长期保持棒头的氧化层，每使用20次左右，应过火焰一次。

4．标准滴管每滴0.025ml。

5．微型振荡器6．兔血清盐水作为稳定剂，用于悬浮致敏红血球以及稀释供试血清。

制法为：无菌采取兔血，收集血清，灭活后4℃保存。

同时，取所需量加4倍量的2.5％血球悬液，混匀，37℃水浴10min，以吸附异嗜性凝集素，离心后取上清；再以pH7.2PBS 稀释成1％兔血清盐水，冰箱保存可供数日内之用。

7．抗原尽可能使用高纯度的抗原。

8．供试血清或其它含抗体材料供试血清必须灭活，加9倍2.5％的红血球悬液，37℃水浴10min～20min，进行吸收，然后离心，取上清，即为1:10的血清稀释液。

9．醛化剂甲醛、戊二醛、丙酮醛等。

10．优质鞣酸11．0.15Mol/L pH6.4PBS液，用于红血球致敏。

12．0.15Mol/L pH7.2PBS液，用于一般稀释液。

13．0.02％牛血清白蛋白PBS液14．生理盐水（三）红血球的处理1．新鲜红血球新鲜红血球用阿氏液保存于4℃，可供3周内使用。

采用新鲜红血球做凝集反应，模型新鲜，典型，而且敏感性也比醛化红血球高出1～2个滴度。

但用新鲜红血球致敏后，保存时间短，而且不同动物个体和不同批次来源的红血球均有差异，影响试验结果和分析。

为了克服这一缺点，目前多采用醛化红血球或鞣化红血球。

2．红血球醛化极其优点（1）醛化方法：常见的醛化剂有甲醛、戊二醛和丙酮醛。

甲醛醛化过程：①将红血球用pH7.2PBS反复洗涤4次，以除去血清蛋白以及红血球表面的胶体物质；②按1︰8的比例取红血球（压积）和3％甲醛液（用pH7.2PBS稀释，预先冷却至4℃），缓慢混合，加胶塞4℃作用24h，不时摇动；③倾去上清液，再以1︰2（V／V）加入36％～38％冷的（10℃）甲醛溶液，混匀，再放入4℃24h；④⑷离心去上清，以生理盐水反复洗涤4次。

彻底清除甲醛液，最后以生理盐水配成10％悬液甲醛化红血球，加1／万硫柳汞防腐，4℃保存。

戊二醛醛化过程：①取新鲜红血球，以生理盐水洗涤4次；②以0.15Mol/L pH 7.2·5·PBS配成1％戊二醛溶液，4℃保存备用；③将100ml 1％冰冷的戊二醛液加入到10ml～15ml红血球中，边加边搅拌（也可置电磁搅拌器上）30min；④离心去上清，以生理盐水洗涤4次，最后以PBS液（或生理盐水）配成10％悬液，加1／万硫柳汞，4℃保存。

丙酮醛—甲醛双醛化过程：①取新鲜红血球，洗涤4次，配成8％的悬液；②于红血球悬液中加等量的3％丙酮醛室温电磁搅拌16h～18h；③洗涤5次，再配成8％的悬液；④于红血球悬液中加等量的3％甲醛，电磁搅拌16h～18h；⑤洗涤5次，最后以pH 7.2 PBS配成10％的悬液，加1／万硫柳汞防腐，4℃保存。

（3）醛化红血球的优点：①性质稳定，不影响红血球表面的吸附能力；②重复性好，易标准化。

③可较长期保存，醛化后4℃保存，有效期可至1年，如冻干保存，有效期则更长。

（4）影响醛化的因素：①红血球的洁净程度：由于红血球表面残留血浆蛋白和其它胶质，易引起自家凝集，所以一定要充分洗净；②红血球的浓度：醛化时应尽量使红血球稀释度低一些，以减少红血球的凝集和变形；③醛化时的温度与醛化红血球的质量有很大关系，一般认为最好是37℃。

但有人认为应于4℃进行醛化；④醛化剂的浓度和醛化次数：醛化剂的浓度过大，易引起红血球皱褶，浓度过低，又会增加溶血机会，所以一般以3％醛化浓度为宜。

家禽红血球一般醛化1～2次即可，而哺乳动物红血球醛化2次比醛化1次要好，敏感性高，保存时间也长。

不同的双醛化，其抗原致敏作用有所不同，表5－1是各种双醛化法的结果比较。

脉冲／min是I标记的特异性抗体结合到细胞上的指标，脉冲数越大，结合抗体量也越多。

但是从表5－1中可以看出结合量同可测出的抗原滴度是不平行的。

适当的振荡可使醛化剂与红血球充分接触，并可排除凝块形成。

但过分地振荡，则易产生气泡，引起红血球变形。

3．红血球鞣化多糖、脂多糖、类脂等一些半抗原易于吸附红血球表面，所以一般醛化处理即可。

但对于许多蛋白质抗原，由于不易吸附于红血球表面，所以在醛化的基础上，必须再以一定浓度的鞣酸进行处理，强化它对蛋白质的吸附能力。

有人认为双醛化后可不必进行鞣化。

首都医院做了“丙酮醛＋甲醛＋鞣化”和·6·不加鞣化得出相同的抗原滴度。