凝集反应(肥达反应、血型鉴定)
凝集反应
1பைடு நூலகம்
一、凝集反应的概念及特点
定义：细菌，螺旋体，红细胞等颗粒性 抗 原,或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合 成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原） 发生特异结合，在适当电解质存在下，形成 肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应 （agglutination)。 反应的两个阶段：1）抗原抗体的特异性结合 阶段，2）出现肉眼可见的凝集现象。
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特点：抗原抗体反应既可以在体内作为 体液免疫应答的效应机制自然发生，也 可以在体外作为免疫学试验的结果而出 现，体外实验的抗原抗体反应称为血清 学反应（serological reaction).
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二.直接凝集反应
定义：细菌、红细胞等颗粒性抗原在适量电解 质的参与下，直接与相应抗体结合，出现肉眼 可见的凝集现象，该反应中的抗原称为凝集原 （agglutinatinogen)，抗体称为凝集素 （ agglutinin)。 一）玻片凝集试验（ABO血型鉴定）；二） 试管凝集试验（肥达试验）。
缘皱缩成花边状
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自身红细胞凝集试验
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自身红细胞凝集试验特点：双 功能抗体的存在，用全血量少，
检测快速。用于快速体外 筛检。
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抗球蛋白参与的血凝试验
1945年，Coombs建立的一种间接血凝试 验，又称Coombs试验或桥梁连接反应
直接Coombs试验 检测红细胞上的不完全抗体
间接Coombs试验 检测游离在血清中的不完全抗体
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四、间接血凝试验 （ hemagglutination test)
肥达实验实验报告
一、实验目的1. 了解肥达反应的基本原理和方法。
2. 掌握肥达反应的操作步骤和注意事项。
3. 通过实验验证肥达反应在细菌鉴定中的应用。
二、实验原理肥达反应是一种细菌凝集反应，是利用细菌的特异性抗原与其相应的抗体结合后，在一定条件下形成肉眼可见的凝集现象，从而对细菌进行鉴定。
该实验主要针对沙门氏菌属和副伤寒氏菌属进行鉴定。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：显微镜、恒温箱、离心机、试管、吸管、滴管等。
2. 试剂：肥达反应抗原、肥达反应抗体、生理盐水、细菌培养液、生理盐水等。
四、实验步骤1. 将待检菌液与肥达反应抗原进行混合，置于37℃恒温箱中培养1小时。
2. 将培养后的菌液用生理盐水进行稀释，制备成适当浓度的菌液。
3. 取两支试管，分别加入等量的肥达反应抗体和生理盐水作为对照。
4. 将制备好的菌液分别加入两支试管中，分别标记为“实验组”和“对照组”。
5. 将两支试管放入37℃恒温箱中培养1小时。
6. 观察实验组和对照组的试管，若实验组出现明显的凝集现象，而对照组无凝集现象，则表明待检菌为沙门氏菌属或副伤寒氏菌属。
五、实验结果1. 实验组出现明显的凝集现象，对照组无凝集现象。
2. 根据实验结果，可以初步判断待检菌为沙门氏菌属或副伤寒氏菌属。
六、实验讨论1. 肥达反应是一种简单、快速、灵敏的细菌鉴定方法，适用于沙门氏菌属和副伤寒氏菌属的鉴定。
2. 在实验过程中，应注意以下几点：（1）实验操作要规范，避免污染。
（2）菌液浓度要适宜，过高或过低都会影响实验结果。
（3）观察结果时要细心，以免误判。
七、实验结论通过本次实验，我们掌握了肥达反应的基本原理和方法，验证了肥达反应在细菌鉴定中的应用。
实验结果表明，待检菌为沙门氏菌属或副伤寒氏菌属。
八、实验反思1. 在实验过程中，发现部分操作步骤不够熟练，导致实验结果不够理想。
2. 通过本次实验，认识到自己在实验操作和理论理解方面的不足，需要进一步加强学习和实践。
3. 在今后的实验中，将更加注重实验操作的规范性，提高实验结果的准确性。
临床医学检验技术(师)：凝集反应考试试题
临床医学检验技术(师)：凝集反应考试试题1、单选引起冷凝集素综合征的自身抗体主要是（）A.IgAB.IgGC.IgMD.IgEE.IgD正确答案：C参考解析：本题要点是冷凝集素综合征的特点。
冷凝集素综（江南博哥）合征是免疫球蛋白M（IgM）抗体引起的自身免疫性疾病，其特点是在较低的温度下，这种抗体能作用于患者自己的红细胞，在体内发生凝集，阻塞末梢微循环，发生手足发绀症或溶血。
在体外，抗体与抗原发生作用的最适宜温度是0~4℃，在37℃或30℃以上的温度，抗体与红细胞抗原发生可逆的分解，症状迅速消失。
2、单选根据致敏载体用的是抗原或抗体以及凝聚反应方式，间接凝集反应不包括（）A.正向间接凝集反应B.反向间接凝集反应C.间接凝集抑制反应D.协同凝集反应E.间接血细胞凝集反应正确答案：E参考解析：根据致敏载体用的是抗原或抗体以及凝聚反应的方式，间接凝集反应可分为正向间接凝集反应、反向间接凝集反应、间接凝集抑制反应、协同凝集反应。
3、单选Coombs试验的直接法和间接法的主要区别是（）A.前者是检测完全抗体，后者是检测不完全抗体B.前者是凝集反应，后者是沉淀反应C.两者判断结果的方法不同D.前者是检测IgG型抗体，后者是检测IgM型抗体E.前者是检测在体内已致敏的红细胞上的不完全抗体，后者是检测游离在血清中的不完全抗体正确答案：E参考解析：抗人球蛋白参与的血凝试验包括直接Coombs试验和间接Coombs试验，分别检测红细胞上的不完全抗体和游离在血清中的不完全抗体。
4、单选冷凝集试验使用的红细胞是（）A.O型红细胞B.AB型红细胞C.A型红细胞D.B型红细胞E.绵羊红细胞正确答案：A参考解析：由肺炎支原体感染引起的原发性非典型肺炎患者的血清中常含有较高的冷凝集素，它能与患者自身红细胞或O型人红细胞于4℃条件下发生凝集，在37℃时又呈可逆性完全散开。
5、单选将红细胞悬液分别加到血型卡的两个区域内，再分别加入抗"A"和抗"B"血清，检测结果：血"AB"型。
(推荐)肥达反应
肥达氏反应肥达试验是一种试管凝集反应。
用已知的伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙型副伤寒杆菌H抗原,与病人血清作定量凝集试验,以测定患者血清中无相应抗体存在,作为伤寒、副伤寒诊断的参考。
[项目名称]肥达氏反应这项化验是检查患者是否被伤寒或副伤寒杆菌感染。
[别名]伤寒杆菌凝集试验[英文缩写]WR[参考值]伤寒杆菌凝集价H<1：160，O<1：80；副伤寒凝集价A<1：80，B<1：80，C<1：80[临床意义]机体感染伤寒、副伤寒杆菌后会产生相应抗体，正常人因隐性感染或预防接种，血清中可含有一定量的抗体。
一般当H≥1：160，O≥1：80，副伤寒凝集价≥1：80时，才有诊断意义。
病程中应每周复查一次，如病人H与O的凝集价均高于参考值或较原凝集价升高4倍以上，则患伤寒的可能性很大。
若H凝集价高而O低于正常值，则可能是以往预防接种疫苗的结果或非特异性回忆反应所致。
伤寒、副伤寒血清凝集试验（肥达氏试验）正常范围：0＜1:80 H＜1:160A、B、C均＜1:80检查介绍：本试验（又称肥达Widal试验）可协助诊断伤寒、副伤寒。
一般病人抗体多在发病后1周出现，以后逐渐上升。
临床意义：O、H凝集价均有增高者可诊断伤寒；O及A、B、C（其中之一项）凝集价增高时，可诊断甲、乙、丙的某一种。
最有意义者系其凝集价逐渐上升并超过参考值。
三、肥达反应【原理】肥达试验是一种试管凝集反应。
用已知的伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙型副伤寒杆菌H抗原，与病人血清作定量凝集试验，以测定患者血清中无相应抗体存在，作为伤寒、副伤寒诊断的【材料】1.患者血清1：10稀释2.伤寒杆菌O菌液、H菌液、甲、乙型副伤寒H菌液3.生理盐水、试管、吸管、56【方法】1.取清洁小试管32支，分成4排，每排8支，依次编号。
2.于小试管内各注入0.5ml生理盐水。
3.于每一排第一管内加入1：10稀释的患者血清0.5ml，用1ml吸管吹吸三次，混匀，吸出0.5ml注入第二管作对倍稀释，……依次稀释至第7管，弃去0.5ml，第8管为对照。
免疫凝集实验
生物检测作业免疫凝集试验免疫凝集试验颗粒性抗原与相应抗体特异性结合后，在适量电解质存在的条件下，可逐渐聚集，出现肉眼可见的凝集现象，成为凝集反应。
直接凝集试验病原菌（如细菌、螺旋体等）颗粒性抗原与相应抗体特异性混合后，在适量电解质存在的条件下，经过一定的反应时间后，出现肉眼可见的凝集现象，称为直接凝集反应。
试验中的抗原称为凝集原；抗体称为凝集素常用的实验方法有玻片法和试管法。
1、玻片法：——细菌薄片凝集试验将已知的抗体滴加于洁净的载玻片或凹玻片孔内，自加入待检病原体悬液混合均匀，同时做生理盐水或正常血清对照。
放置室温内数分钟后即可观察实验结果，出现颗粒状凝集者为阳性反应。
优点：其操作简便、迅速，适用于血型鉴定及微生物的菌种鉴定和分型等。
特别是诊断肠道传染病时用于鉴定病人标本中肠道杆菌的感染。
细菌薄片凝集试验：（1）实验目的：该试验用于菌种的鉴定及分型.（2）实验材料：待测菌培养物、已知菌培养物和已知诊断血清（3）实验过程:1.取洁净玻片一张，用蜡笔画为四格。
2.用接种环无菌去诊断血清各两环分别置于第1、3格中。
3.用接种环取生理盐水各两环分别放于第2、4格中。
4.用接种环取已知菌少许放入第2格生理盐水中混匀，随即转移1环于第1格中混匀。
5.同样用灭菌的接种环取待测菌少许放入第4格生理盐水中混匀，然后移一环菌液于第3格中混匀。
灼烧灭菌。
6.结果：已知菌在诊断血清中应出现颗粒状凝集，若待测菌在诊断血清中也出现颗粒状凝集，表明两种菌为同一种或属。
2、试管法：——肥达试验（试管凝集实验）将已知的抗原与系列等比稀释的待检血清在小试管内混合，39℃温育2~24h后观察结果。
生理盐水加抗原作为对照，应用非特异性自凝现象。
以出现明显的颗粒状或絮片状凝集现象的待检血清最高稀释度作为抗体的效价。
试管凝集实验为半定量试验，常用于某病原微生物感染的免疫学诊断，亦可用已知抗体鉴定未知的抗原。
（1）材料：病人血清、肥达实验诊断抗原、生理盐水、试管、吸管、试管架等。
直接凝集试验(肥达反应)
操作步骤
1、稀释血清(1:10稀释)：取EP管1支，做好标记,加入N.S 450ul，加血清50ul ,混匀备用; 2、 稀释菌液(1:4稀释):取EP管4支，分别标记好H,O,甲,乙, 加入N.S 450ul，加菌液150ul,混匀备用; 3、编号：拿一块反应板标记好一份待测标本号和操作者姓 名，于反应板的第 一排各孔标以H,O,甲,乙。 4、加样：每份标本共4排4孔。各列先分别加入100ul(2 滴)N.S从第1孔至第4孔。再加入已稀释好的待测血清 100ul(2滴)至第1孔，混匀后吸出100ul(2滴)至第2孔， 以此类推稀释至第4孔弃去100ul(2滴) 。 5、加菌液：于各排各孔中分别加入对应的1:4稀释菌液 100ul(2滴) ，此时各列每孔的血清稀释度应该依次为 1:40,1:80,1:160,1:320。 6、 轻轻混匀1min，加盖(贴上封口纸)，37℃水浴，过夜， 次日观察结果。
直接凝集试验
（direct agglutination test ） 肥达反应 （Widal test） test）
微量血凝反应板法
试验原理
将已知伤寒沙门菌的菌体“O”抗原和 鞭毛“H”抗原，以及引起副伤寒的甲、乙 型副伤寒沙门菌的“H”抗原作为诊断菌液 与受检人待测的已稀释的血清在微量血凝 反应板内反应，根据各反应孔内的凝集现 象出现与否，来测定受检者血清中有无相 应抗体以及抗体的效价，判断待。 2、试剂： 生理盐水（NS），伤寒杆菌“H” 抗原和“O”抗原，副伤寒甲“H”抗原、副 伤寒乙“H”抗原的诊断菌液(40亿个菌/ml), 分别用N.S稀释成10亿个菌/ml 的悬液(1:4 150ul+450ulNS)。 3、器材： 恒温水浴箱、微量血凝反应板、 试管架、试管、吸管等。
肥达反应
肥达氏反应肥达试验是一种试管凝集反应。
用已知的伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙型副伤寒杆菌H抗原,与病人血清作定量凝集试验,以测定患者血清中无相应抗体存在,作为伤寒、副伤寒诊断的参考。
[项目名称]肥达氏反应这项化验是检查患者是否被伤寒或副伤寒杆菌感染。
[别名]伤寒杆菌凝集试验[英文缩写]WR[参考值]伤寒杆菌凝集价H<1：160，O<1：80；副伤寒凝集价A<1：80，B<1：80，C<1：80[临床意义]机体感染伤寒、副伤寒杆菌后会产生相应抗体，正常人因隐性感染或预防接种，血清中可含有一定量的抗体。
一般当H≥1：160，O≥1：80，副伤寒凝集价≥1：80时，才有诊断意义。
病程中应每周复查一次，如病人H与O的凝集价均高于参考值或较原凝集价升高4倍以上，则患伤寒的可能性很大。
若H凝集价高而O低于正常值，则可能是以往预防接种疫苗的结果或非特异性回忆反应所致。
伤寒、副伤寒血清凝集试验（肥达氏试验）正常范围：0＜1:80 H＜1:160A、B、C均＜1:80检查介绍：本试验（又称肥达Widal试验）可协助诊断伤寒、副伤寒。
一般病人抗体多在发病后1周出现，以后逐渐上升。
临床意义：O、H凝集价均有增高者可诊断伤寒；O及A、B、C（其中之一项）凝集价增高时，可诊断甲、乙、丙的某一种。
最有意义者系其凝集价逐渐上升并超过参考值。
三、肥达反应【原理】肥达试验是一种试管凝集反应。
用已知的伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙型副伤寒杆菌H抗原，与病人血清作定量凝集试验，以测定患者血清中无相应抗体存在，作为伤寒、副伤寒诊断的参考。
【材料】1.患者血清1：10稀释2.伤寒杆菌O菌液、H菌液、甲、乙型副伤寒H菌液3.生理盐水、试管、吸管、56℃水箱等【方法】1.取清洁小试管32支，分成4排，每排8支，依次编号。
2.于小试管内各注入0.5ml生理盐水。
3.于每一排第一管内加入1：10稀释的患者血清0.5ml，用1ml吸管吹吸三次，混匀，吸出0.5ml注入第二管作对倍稀释，……依次稀释至第7管，弃去0.5ml，第8管为对照。
医学免疫学：实验2 凝集反应(ABO血型测定)
实验目的:
检测血清标本中有无HBsAb
材料:
48孔ELISA板
阳性对照血清（HBsAb） 阴性对照血清 酶标二抗
乙肝病毒表面抗体 诊断试剂盒
洗涤液
底物A和B
微量加样器，待测血清标本等
实验方法
微孔板已包被HBsAg
HBsAg
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
+ + — — ① ① ① ① ② ② ② ②A + + — — ③ ③ ③ ③ ④ ④ ④ ④B + + — — ⑤ ⑤ ⑤ ⑤ ⑥ ⑥ ⑥ ⑥C + + — — ⑦ ⑦ ⑦ ⑦ ⑧ ⑧ ⑧ ⑧D
实验结果
颜色变化或OD（吸光度）值
酶标板
酶标仪Βιβλιοθήκη 样+-1 2 3456
每孔加 50μl 不同的血清样本 Positive control (HBsAb) ：1 滴 Negative control (NS): 1 滴
加样
+
- sample
加酶结合物
enzyme
每孔加酶结合物1滴 混匀， 37 ℃ 30 min.
放射物标记技术 酶标技术
免疫荧光技术
酶联免疫吸附试验
酶免疫组化技术
双抗体夹心法
竞争法
双抗原夹心法
间接法
直接法
原理：间接ELISA法(酶联免疫吸附试验)
不显色
洗涤
洗涤
1.包被已知抗原 2.加入待测标本 （未知抗体？） 3.加入酶标二抗 （即抗抗体 ：抗人Ig的抗体） 4.加入底物
颜色改变 = 待测标本中存在抗体
实验结果
呈红色片状凝集颗粒为阳性 实验结束后，洗涤试管；
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上液半混浊，细菌部分凝集。 上清液混浊，仅有小部分细菌凝集。 不凝集，液体呈乳状与对照管相同。
效价判定：以能出现“++”凝集现象的血清最高稀释度为 该血清的凝集效价。
血清的凝集效价（滴度）：指能与一定量的抗原发生肉眼 可见的明显凝集（即“++”凝集）的血清最高稀释倍数。
血清效价代表血清中抗体的含量，血清效价越高，所含抗
和希氏沙门菌的H抗原的诊断菌液与病人血清做凝集试验，
测定受检血清中有无相应的抗体以及抗体的效价，用于伤 寒副伤寒的辅助诊断或流行病学调查。
材料
伤寒沙门菌O、H菌液，甲型副伤寒沙门菌H菌液和肖氏 沙门菌H菌液。
生理盐水和患者血清（1:10稀释），试管，1ml吸管，试
管4排，每排7支，依次编号。 于每个试管内加入生理盐水0.5ml。 在每排第一管各加患者血清0.5ml，进行倍比稀释。 ml 1 0.5 0.5 1:2 2 0.5 0.5 1:4 3 0.5 0.5 1:8 4 0.5 0.5 1:16 5 0.5 0.5 1:32 6 0.5 0.5 1:64
直接凝集反应
颗粒性抗原与相应抗体直接结合所产生的凝集现象。
间接凝集反应
将可溶性抗原吸附于载体颗粒(如乳胶颗粒、红细胞等)的 表面，称之为致敏颗粒。当致敏颗粒与相应抗体结合，即 可出现凝集现象。
协同凝集实验
金黄色葡萄球菌细胞壁成分中的A蛋白(SPA)能与人及多 种哺乳动物IgG类抗体的Fc段结合。IgG的Fc段与SPA结 合后，两个Fab段暴露在葡萄球菌表面，仍保持其抗体活
O抗体
↑ ↑ ― ―
H抗体
↑ ― ↑ ―
ABO血型鉴定
根据红细胞膜表面有无A抗原和（或）B抗原，将血型分 为A，B，AB，O型4种。
实验材料
载玻片、刺血针、消毒牙签、A型和B型标准 血清、生理盐水、酒精棉球。
实验步骤
1．取一块清洁玻片，在其左右端分别用A、B做好标记。 2．在玻片一端滴加A型标准血清（抗B）一滴，在另一端
滴加B型标准血清（抗A）。
3．穿刺手指取血，玻片的两端标准血清各加一小滴血，用 牙签搅拌，使每侧抗血清和血液混和。每边用一支牙签， 切勿混用。
室温下静置，观察有无凝集现象，
结果判断 血型 A B O AB 抗A试剂 + + 抗B试剂 + +
呈现均匀的淡红色时，表明不凝集，用“一”号表示。
出现细沙状凝集颗粒，表明凝集，用“十”号表示。
性和特异性，当其与特异性抗原相遇时，出现凝集现象。
称为协同凝集反应。
金黄色葡萄 球菌
抗体
可溶性抗原
凝集
直接凝集反应
试管凝集试验——肥达反应 玻片凝集试验——ABO血型鉴定
肥达反应
肥达反应(widal reaction)是用已知的伤寒沙门菌的H抗原 (鞭毛)和O抗原(菌体)以及甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌
弃去0.5ml
7 阴性对照 0.5 ——
生理盐水 受检血清 稀释度
诊断菌液
稀释度 血清最终 稀释度
0.5
1:4 1:40
0.5
1:8 1:80
0.5
1:16 1:160
0.5
1:32 1:320
0.5
1:64 1:640
0.5
1:128 1:1280
0.5
结果
凝集程度：以“+”多少表示 。
（++++）上清液澄清，细菌全部凝集沉淀于管底。 （+++） 上清液轻度混浊，细菌大部分凝集沉淀于管底。 （++） （+） （-）
体的量愈多。一般认为，伤寒沙门菌“O”抗体凝集效价 在1:80以上，“H”抗体凝集效价在1:160以上，引起副伤 寒的沙门菌H凝集效价在1:80以上才有诊断价值。
O与H抗体的诊断意义
O抗体：IgM H抗体：IgG 诊断
肠热症 感染早期或与伤寒沙门菌O抗原有交 叉反应的其他沙门菌感染 预防接种或非特异性回忆反应 患病可能性小
凝集反应
实验目的
掌握凝集反应原理 熟悉肥达试验的方法、凝集效价的判定及 临床意义
抗原与相应抗体特异性结合，在电解质参与下形成肉眼可
见的凝集物，称之为凝集反应。
直接凝集反应：颗粒性抗原与相应抗体直接结合所产生的
凝集现象。
间接凝集反应：将可溶性抗原吸附于载体颗粒(如乳胶颗 粒、红细胞等)的表面，称之为致敏颗粒。当致敏颗粒与 相应抗体结合，即可出现凝集现象。