第二节 分光光度法
分光度光度法
分光度光度法分光光度法学习资料一、分光光度法的基本概念1. 定义- 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
它利用物质对光的选择性吸收特性，不同的物质由于其分子结构不同，对不同波长的光有不同程度的吸收。
2. 原理基础- 朗伯 - 比尔定律（Lambert - Beer law）是分光光度法的基本定律。
- 朗伯定律指出：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度与光通过的路径长度成正比，即A = k_1b（其中A为吸光度，b为光程长度，k_1为比例常数）。
- 比尔定律指出：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度与吸光物质的浓度成正比，即A = k_2c（其中c为吸光物质的浓度，k_2为比例常数）。
- 合并朗伯定律和比尔定律得到朗伯 - 比尔定律：A=varepsilon bc，其中varepsilon为摩尔吸光系数，单位为L/(mol· cm)，它表示物质对某一特定波长光的吸收能力，varepsilon越大，表明该物质对该波长光的吸收能力越强。
二、分光光度计的结构与组成1. 光源- 提供足够强度和稳定的连续光谱。
在可见光区常用钨灯或卤钨灯，其发射光的波长范围为320 - 2500nm；在紫外光区常用氢灯或氘灯，发射光的波长范围为180 - 375nm。
2. 单色器- 它的作用是将光源发出的复合光分解为单色光。
主要部件包括狭缝、准直镜和色散元件（如棱镜或光栅）。
通过调节狭缝宽度可以控制出射光的带宽和光强。
3. 样品池- 用于盛放被测溶液。
在可见光区可以使用玻璃样品池，而在紫外光区则需使用石英样品池，因为玻璃对紫外光有吸收。
4. 检测器- 检测透过样品池后的光强，并将光信号转换为电信号。
常见的检测器有光电管和光电倍增管等。
光电倍增管具有更高的灵敏度，可检测微弱的光信号。
5. 信号显示与处理系统- 将检测器输出的电信号进行放大、处理，并以吸光度或透光率等形式显示出来。
分光光度法
( C )2. 用普通分光光度法测得标液c1的透光度为20%， 试液的透光度为12%；若以示差分光光度法测定以c1 为参比，则试液的透光度为
A. 40% B. 50%
C. 60%
D. 70%
( D )3. 按一般光度法用纯溶剂做参比溶液时，测得某试 液的透光度为10%。若参比溶液换为透光度为20%的
(×) 4. 有色溶液的吸光度为0，其透光率也为0。
1.5 吸 光 系 数
吸光系数K物理意义：吸光物质在单位浓度、 单位厚度时的吸光度。
1. 质量吸光系数 c单位g/L，b单位cm，K单位L ·g-1 ·cm-1 A = Kbc
2. 摩尔吸光系数 c单位mol/L，b单位cm，ε单位L ·mol-1 ·cm-1 A = εbc
1.4 光吸收基本定律—朗伯比尔定律
( ✓)1. 朗伯－比耳定律的应用条件：一是必须使
用单色光；二是吸收发生在均匀的介质；三是吸 收过程中，吸收物质相互不发生作用。
(×) 2. 有色物质的吸光度A是透光度的倒数。 (×) 3. 在分光光度分析中，入射光强度与透射光
强度之比称为吸光度，吸光度的倒数的对数为透 光率。
( ✓)1. 如果显色剂有色，则要求有色化合物与显色剂
之间的颜色差别要大，以减小试剂空白值，提高测定 的灵敏度。通常把两种有色物质最大吸收波长之差称 为“对比度”。一般要求显色剂与有色化合物的对比 度在∆λ60nm以上。
( ✓)2. 分光光度法中，可选择不同厚度的比色皿以
控制吸光度在合适范围内。
1.5 吸 光 系 数
摩尔吸光系数ε意义： 1）吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数。 2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。 3）可作为定性鉴定的参数。 4）同一物质在不同波长下的ε值不同。
§2.2 双波长和三波长分光光度法
2和K1分别为在λ2和 λ1处的放大系数；组分A和B 在λ2和 λ1处的吸光度分别为
A B A B A 、 A 和 A 、 A 2 1 1，则 2
S＝K2 A2＋K2 A2－K1 A1－K1 A1
调节仪器中的信号放大 器，使干扰组分B在波长λ2 和λ1处的信号相等，由此得 系数倍率K为：
第二节 双波长和三波长分光光度法 一．双波长分光光度法的原理
双波长分光光度法是在传统的单波长分光度法的基础上发 展起来的。单波长分光光度法要求式样本身透明，不能有混 浊，如果是试样溶液在测量过程中逐渐产生浑浊便无法正确 测定。对于吸收峰相互重叠的组分或背景很深的试样分析， 也很难得到准确的结果。 双波长分光光度法的建立，在一定程度上克服了单波长 法的局限性，扩展了分光光度法的应用范围，在选择性、灵 敏度和测量精密度等方面都比单波长法有进一步的改善和提 高。
二． 三波长分光光度法的原理和应用
1．基本原理
如图所示，在任一吸 收曲线上，可以在任意选 择的三个波长处测量吸光 度。根据三角形和三角形 相似，可推导出在上述三 个波长处测量的吸收度具 有下列函数关系： 三波长法原理图
式中，m和n分别表示(2 -1)和(3 -2)的数值。1、2和3 分别为待测物在三波长处的摩尔吸光系数；C为待测物的摩尔浓 度；b为光程。方程中的系数 可预先求得，A值 与待测物浓度成正比，因而可通过曲线求出样品中待测组分的 含量。 从上图可知，如选择的三个波长相应于吸收曲线上三点处 于一条直线上，则测得的A值为零。因此，当干扰组分的吸收 光谱为一直线（如浑浊产生的干扰），则在任选的三个波长处 测定，测得的值与干扰物浓度无关，如果干扰物为一吸收曲线， 只要在曲线上找到处在一条直线上的三点，在此三点相应的波 长处测定，由于干扰物在此三波长处的值为零，故测得的只与 待测组分的浓度有关。
分光光度法
第二节分光光度法(一)基础知识分类号：P2-O一、填空题1．分光光度法测定样品的基本原理是利用朗伯—比尔定律，根据不同浓度样品溶液对光信号具有不同的，对待测组分进行定量测定。
答案：吸光度(或吸光性，或吸收)2．应用分光光度法测定样品时，校正波长是为了检验波长刻度与实际波长的，并通过适当方法进行修正，以消除因波长刻度的误差引起的光度测定误差。
答案：符合程度3．分光光度法测定样品时，比色皿表面不清洁是造成测量误差的常见原因之一，每当测定有色溶液后，一定要充分洗涤。
可用涮洗，或用浸泡。
注意浸泡时间不宜过长，以防比色皿脱胶损坏。
答案：相应的溶剂(1+3)HNO3二、判断题1．分光光度计可根据使用的波长范围、光路的构造、单色器的结构、扫描的机构分为不同类型的光度计。
( )答案：正确2．应用分光光度法进行试样测定时，由于不同浓度下的测定误差不同，因此选择最适宜的测定浓度可减少测定误差。
一般来说，透光度在20％～65％或吸光值在0.2～0.7之间时，测定误差相对较小。
( )答案：正确3．分光光度法主要应用于测定样品中的常量组分含量。
( )答案：错误正确答案为：分光光度法主要应用于测定样品中的微量组分。
4．应用分光光度法进行样品测定时，同一组比色皿之间的差值应小于测定误差。
( ) 答案：错误正确答案为：测定同一溶液时，同组比色皿之间吸光度相差应小于0.005，否则需进行校正。
5．应用分光光度法进行样品测定时，摩尔吸光系数随比色皿厚度的变化而变化。
( ) 答案：错误正确答案为：摩尔吸光系数与比色皿厚度无关。
三、选择题1．利用分光光度法测定样品时，下列因素中不是产生偏离朗伯—比尔定律的主要原因。
( )A．所用试剂的纯度不够的影响B．非吸收光的影响C．非单色光的影响D．被测组分发生解离、缔合等化学因素答案：A2．分光光度计波长准确度是指单色光最大强度的波长值与波长指示值。
( )A．之和B．之差C．乘积答案：B3．分光光度计吸光度的准确性是反映仪器性能的重要指标，一般常用标准溶液进行吸光度校正。
分光光度法 科普
分光光度法科普分光光度法（Spectrophotometry），简称分光法，是一种广泛应用于生物、化学、医药等领域的分析技术。
它基于物质对不同波长光的吸收或透射性能，通过测量光的强度变化来定量或定性分析物质的浓度。
本文将介绍分光光度法的原理、仪器配置以及应用。
一、原理分光光度法的原理基于比尔－朗伯定律（Beer-Lambert Law），该定律描述了物质溶液对单色光的吸光度（Absorbance）与物质的浓度以及溶液的光程（即光线通过溶液的路径长度）成正比的关系。
其数学表达式为：A = ε×c×l，其中A表示吸光度，ε是摩尔吸光系数，c是物质的浓度，l是光程。
当物质吸收一束光时，其吸收强度与入射光强度呈指数关系。
通过对不同波长的光通过物质溶液后，测量出透射光的强度变化，可以推算出物质的浓度。
二、仪器配置分光光度法常用的仪器是分光光度计，主要由光源、单色器、样品池、检测器和信号处理器组成。
1. 光源：分光光度计使用的光源通常是白炽灯或者氘灯。
白炽灯可以发出连续谱的光，而氘灯通常用于紫外光区域的分析，因为氘灯可以发出紫外光谱。
2. 单色器：用于将连续谱的光分解为单色光，常见的单色器有棱镜和光栅。
棱镜通过光的折射来将光分解为不同波长，而光栅则是通过光的衍射来实现。
3. 样品池：用于盛放溶液样品，通常是石英或玻璃制成。
不同颜色的玻璃样品池会对特定波长的光产生吸收，因此石英或透明玻璃是更好的选择。
4. 检测器：分光光度计常用的检测器是光电二极管或光电倍增管。
光电二极管可以将光转化为电信号，并输出给信号处理器。
5. 信号处理器：用于接收检测器发出的电信号，将其转化为可读的吸光度值，并进行数据处理。
三、应用分光光度法在许多领域都有着广泛的应用。
1. 生物学领域：在生物学研究中，分光光度法可以用于分析DNA、蛋白质、酶活性等。
例如，通过测量DNA溶液对260nm波长的紫外光的吸光度，可以估算出DNA的浓度和纯度。
分光光度法的原理
分光光度法的原理分光光度法是一种常用的分析化学方法，它通过测量溶液中物质对特定波长的光的吸收或透射来确定物质的浓度。
这种方法在化学、生物学、环境科学等领域都有广泛的应用，是一种非常重要的分析技术。
分光光度法的原理基于比尔定律，即溶液中物质对光的吸收与物质的浓度成正比。
当一束光通过溶液时，溶液中的物质会吸收部分光线，其吸收量与物质的浓度成正比。
根据比尔定律，吸光度与浓度之间存在线性关系，因此可以通过测量吸光度来确定溶液中物质的浓度。
分光光度法的核心设备是分光光度计，它能够测量样品对特定波长光的吸收或透射。
在进行分光光度测定时，首先需要选择适当的波长，使得样品对该波长光具有较大的吸光度。
然后将样品置于分光光度计中，测量其吸光度。
根据比尔定律，可以通过吸光度与浓度的线性关系来计算样品的浓度。
分光光度法的优点之一是其灵敏度高，可以测量极微量的物质。
此外，分光光度法还具有快速、准确、简便的特点，适用于各种类型的溶液样品。
因此，分光光度法在实验室和工业生产中都得到了广泛的应用。
在实际应用中，分光光度法还可以与其他分析方法相结合，如色谱法、电化学法等，以提高分析的准确性和可靠性。
此外，分光光度法还可以用于监测环境中的污染物质、检测生物样品中的代谢产物等，具有重要的环境和生物应用价值。
总之，分光光度法是一种重要的分析化学方法，它基于比尔定律，通过测量溶液中物质对光的吸收或透射来确定物质的浓度。
分光光度法具有灵敏度高、快速、准确、简便等特点，在化学、生物学、环境科学等领域有着广泛的应用前景。
通过不断的技术创新和方法改进，分光光度法将会在更多领域发挥重要作用，为科学研究和工业生产提供有力支持。
第十章 分光光度法
注：溶液的透光率T反映了物质对光的吸收程度， T越大表示它对光的吸收越弱；反之，T越小，表 示对光的吸收越强。
T 取值为0.0 % ~ 100.0 %
T
全部吸收
T = 0.0 %
全部透射 T = 100.0 %
2.吸光度： 为透光率的负 A lg I0 lg 1 ＝ lgT
（四）吸光系数 1．定义（物理意义）
一定条件下，吸光物质在单位浓度及单位液层 厚度时的吸光度，叫这个物质的吸光系数。
2．两种表示方法
(1) 摩尔吸光系数( ε )：表示一定波长下，吸光物质的溶液
浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。
(2)百分吸光系数(
E1% 1cm
)：表示一定波长下，吸光物质的溶
黄 橙
红
/nm 颜色 400-450 紫
450-480 蓝 480-490 青蓝 490-500 青 500-560 绿 580-610 黄 610-650 橙 650-760 红
互补光 绿
黄 橙 红 紫 蓝 青蓝 青
物质的颜色与光的关系：
完全吸收
光谱示意 复合光
表观现象示意
完全透过
吸收黄色光
二.物质对光的选择性吸收
A. A~λ曲线
B. A~c曲线
C. A~V曲线
D. E~V曲线
4、紫外分光光度法中，为了使测定结果有较高 的灵敏度和准确度，入射光的波长应（ ）
A．最大吸收波长
B．最小吸收波长
检测器 作用：将光信号转换为电信号，并放大 光电管，光电倍增管
信号输出 表头、记录仪、屏幕、数字显示
第十章
1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源 热辐射光源适用350nm-800nm，用于可见 光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源适 用150nm-400nm，用于紫外光区，如氢灯 和氘灯。
分光光度法专业知识课件
E1’ molecular vibration E1’’ molecular rotation E0 Ground level
互补（色）光
complementary colors
第一节 分光光度法 基本原理
若溶液选择性地吸收了某种颜色旳光， 则溶液呈吸收光旳互补色。
二．物质旳吸收光谱
用不同波长旳单色光依次
① c 一定, A∝b Lambert ② b 一定, A∝c Beer
A =εbc
三、Lambert-Beer定律
A =bc
溶液厚度b, 单位:cm
浓度c，单位molL-1
摩尔吸光系数，单位Lmol -1cm-1
若用质量浓度替代c
A = ab
质量浓度 , 单位: gL-1
质量吸光系数a, 单位: Lg -1cm-1
常用参比溶液
成份 溶剂 显色剂
溶剂空白 √ ×
试样
×
其他 合用范 围
× 显色剂、试 样均无吸收
试剂空白 √ √ 试样空白 √ ×
×
√ 试样无吸收 显色剂有吸
收
√
√ 显色剂无吸 收，试样有
吸收
第四节
提升测量敏捷度和精确度旳措施 自学 要点看： 分光光度法旳误差起源 显色剂旳选择 测定条件旳选择
本章小结
As，在相同条件下测出试样溶液旳吸光度 Ax，则试样溶液浓度cs可按下式求得：
Ax /As= cx / cs cx = cs Ax /As
参比（空白）溶液 blank
I 参比溶液旳作用：扣除一切不起源于 目旳产物旳光吸收。
如：消除吸收池、溶剂、试剂、干扰物旳影响。
常用参比溶液：
①溶剂空白 ②试剂空白 ③试样空白
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4V5560.2.38717043 =2.40×102 Lmol-1cm-1
A415 4T1ib5 cT i 4V1b5 cV
cTi 5.39104mol/L cV 1.26103mol/L
A455 4T5ib5 cT i 4V5b5 cV 原 cTi5.3 91 0 452.6 71 0 3(mo)l
苯和N-亚硝基二甲胺的紫外吸收光谱图
红移与蓝移
➢ 有机化合物的吸收谱 带常常因引入取代基 或改变溶剂使最大吸 收波长λmax和吸收强 度发生变化:
➢ λmax向长波方向移 动称为红移，向短波 方向移动称为蓝移 (或 紫移)。吸收强度即摩 尔吸光系数ε增大或减 小的现象分别称为增 色效应或减色效应， 如图所示。
思考题
1
吸光光度法的定性与定量分析 的基础是什么？
2 分光光度计的基本组成？常用的光源 及单色器？
相同的条件测得A415=0.645, A455=0.553,
求原混合液中钛和钒的浓度。
4T1i5101..403651203 =8.21×102 Lmol-1cm-1
4T5i510.0.26416023 =4.64×102 Lmol-1cm-1
4V1560.2.28511043 =1.60×102 Lmol-1cm-1
可检10-8~10-9s 短脉冲信号
光电二极管阵列
光电二极管阵列 (photodiode array) 检测器为多道光检测 器，可同时检测多个波长的光强度。
优点: 不怕强光、耐振动、耐冲击、小型、重量轻、耗 电少、寿命长、可靠性高及读出速度快等优点，不存在 时间滞后现象，可应用于化学反应动力学研究。
有选择性吸收作用而产生了不同颜色。
光吸收曲线
吸收峰：光吸收程度最大处对应的波长。
KMnO4的颜色及吸收光谱
叶绿素的结构和吸收光谱
光吸收的基本定律：朗伯—比尔定律
朗伯—比尔定律适用的条件
吸光度的加和性
例: 钛-H2O2和钒-H2O2络合物的最大吸 收波长分别在415nm和455nm处，取50.00mL 1.06×10-3mol/L钛-H2O2溶液，定容100mL, 以1cm比色皿在415nm和455nm处测得吸光度 分别为0.435和0.246; 取25.00mL 6.28×10-3mol/L 钒-H2O2溶液，定容100mL, 以1cm比色皿在415nm和455nm处测得吸光度 分别为0.251和0.377。取20.00mL钛钒混合 液，加入H2O2显色后定容为100mL，以上述
紫敏光电管阴极表面涂有锑和铯，适用200~625nm 红敏光电管阴极表面涂有银或氧化铯，适用625~1000nm
光电倍增管
光电倍增管(photomultiplier)是由一个光阴极和多个二次 发射电极 (打拿极)和阳极所组成，其灵敏度比光电管要 高得多。
9~12个打拿级
1个光电子可 产生106~108 个电子
测定高浓度试样和混浊试样以及多组分混合物的定量 分析具有很大优越性，提高了测量灵敏度和准确度。
三、显色反应及分析条件的选择
显色反应条件的选择
四、吸光光度法仪器测量误差及其消除 入射光波长的选择
光度计读数范围的选择
参比溶液的选择
溶液浓度的测定
➢工作曲线法 绘制工作曲线； 测样品A，在曲线上获得对应浓度。
常用检测器：光电管、光电倍增管、光电二极管阵列、 光电池、电荷耦合器件。
光电管
光电管 (phototube) 是由封装在真空封套里的一个半圆柱 面形阴极和一个丝状阳极组成。阴极的凹面上有一层对 光敏感的碱金属或其氧化物，受光照射可发射光电子。
当在两极间加上电压时， 即会产生光电流，流经 负载电阻 ( 一般 106~109 ) 时会产生 一定电压降。经放大 后将信号输给指示仪 表或记录仪。
分光光度计类型
单波长双光束分光光度计
特点： (1) 同时测量参比池和样品池， (2) 双单色器，提高分辨率降低杂散光 (3) 自动测量 (4) 附件扩展功能
常用型号：北京普析通用公司TU-1221型/T6，岛津UV2501型，PE的Lambda系列及HP的8453型等。
双光束光度计
动画
(三) 双波长分光光度计 为克服由于非特征吸收信号 ( 如试液混浊引起的散射， 比色皿与空气界面和比色皿与溶液界面的折射差别等) 影响而带来测定误差，而设计双波长分光光度计。
组成：Hale Waihona Puke 射狭缝、准直镜、色散元件、出射狭缝
入射狭缝：限制杂散光进入 色散元件：将复合光分解为单色光，有棱镜和光栅两种 准直镜：将来自色散元件的平行光束聚集在出射狭缝上 出射狭缝：将固定波长范围的光射出单色器，可以限
制通带宽度。
单色器的性能直接影响射出光的纯度，从而影响测定 的灵敏度、选择性及校正曲线的线性范围。单色器质 量好坏，主要取决于色散元件的质量。
原 cV1.2 61 0 356.3 01 0 3(mo)l
二、光度分析的方法和仪器
721 可见分光光度计
722系列 可见分光光度计
751分光光度计
SP-756P紫外可见分光光度计
单色器
单色器(monochromator) 是一种把来自光源的复合光分 解为单色光，并分离出所需波长光束的装置。
迁产生的R 带。 （3） 250-300 nm 有中等强度的吸收峰（ε=200-
2000），芳环的特征 吸收（具有精细解构的B带）。 （4） 200-250 nm有强吸收峰（ε104），表明含有一
个共轭体系（K）带。共轭二烯：K带（230 nm）； 不饱和醛酮：K带230 nm ，R带310-330 nm 260nm,300 nm,330 nm有强吸收峰，3,4,5个双键的共 轭体系。
➢比较法
五、吸光光度法的应用
六、紫外吸收光谱分析法
波长10～400nm为紫外光，10～200nm为远紫外光， 200～400nm为近紫外光。
有机化合物结构与紫外信息的关系
（1）200-400nm 无吸收峰。饱和化合物，单烯。 （2） 270-350 nm有吸收峰（ε=10-100）醛酮 n→π* 跃
第二节 分光光度法
常用光谱分析仪器 紫外-可见分光光度计 原子吸收分光光度计 红外光谱仪 原子发射光谱仪 荧光分析仪 原子荧光分析仪等
颜色的产生
如果把适当颜色的两种光按一定 强度比例混合可得到白光，这两 种颜色的光称为互补色光。
物质对光的选择性吸收
➢ 颜色的产生：不同的物质只对不同的、特定波 长的光有较强的吸收。物质对不同波长的光具
检测器
在测量中须把光信号变化转换成电信号的变化才能定量 测量，这种把光信号转换成电信号的装置称为光电转换 器 —— 检测器。 对检测器的要求主要有：
① 产生的电信号必须与照射到它上面的光束的强度 有恒定函数关系；
② 必须能对一个很大的波长范围的光具有响应，否 则应用局限性大；
③ 灵敏度要高，响应速度要快，产生的电信号要易 于检测或放大且噪声要低。