实验五. 细胞染色体制备
染色体制备
染色体制备
【最新版】
目录
1.染色体的概念与组成
2.染色体制备的方法
3.染色体制备的步骤
4.染色体制备的应用领域
5.染色体制备的注意事项
正文
染色体是生物体内的一种重要结构，其主要由 DNA 和蛋白质组成。
在生物学研究和实验中，对染色体的观察和分析十分重要。
染色体制备就是将细胞中的染色体提取出来并进行处理，以便于观察和分析。
下面，我们将详细介绍染色体制备的方法、步骤、应用领域以及注意事项。
首先，染色体制备的方法有很多种，常见的有直接法、间接法和免疫荧光法等。
直接法主要是通过化学试剂将染色体固定并染色，间接法是通过抗体与染色体结合，再进行染色，免疫荧光法则是在间接法的基础上，使用荧光标记的抗体来标记染色体。
其次，染色体制备的步骤主要包括：细胞采集、细胞处理、染色体提取、染色体固定和染色以及染色体检测。
细胞采集是指从生物体中获取细胞样本，细胞处理是为了使染色体更容易提取和固定，染色体提取则是将处理后的细胞中的染色体提取出来，染色体固定和染色是为了使染色体保持稳定并便于观察，染色体检测则是对染色体进行分析。
染色体制备的应用领域广泛，主要用于生物学研究、基因诊断、遗传病筛查和基因编辑等。
通过染色体制备，研究人员可以更好地了解染色体的结构和功能，从而为生物学研究和医学应用提供有力支持。
最后，染色体制备过程中需要注意以下几点：一是细胞采集和处理要尽量保持细胞的活性；二是染色体提取时要避免染色体的损伤和断裂；三是染色体固定和染色时要选择合适的试剂和方法；四是染色体检测时要准确分析染色体的形态和结构。
实验五骨髓细胞染色体的制备及组型分析
实验五骨髓细胞染色体的制备及组型分析一、实验目的初步掌握骨髓细胞染色体的制片及染色技术，学习染色体组型分析方法，观察动物细胞染色体的数目和形态。
二、实验原理真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。
制备染色体标本是细胞遗传学最基本的技术，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交的先决条件。
染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。
最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。
小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织。
利用骨髓的制片技术虽然需要离心以及细致的操作，但其基本程序是简便的。
另外，在骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，因此可以直接得到中期细胞而不必象淋巴细胞或其它组织那样要经过体外培养。
主要的中期相来自成红细胞系统，也来自各种骨髓母细胞。
单核细胞和淋巴细胞的分裂相是较少的。
不过，在染色体制片上已无法区别上述来源。
多倍体的中期相（4n、8n和16n）往往来自于巨核细胞。
对大型动物通常采用对骨骼、脊柱或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。
通过骨髓得到的染色体是比较简便的，一般也无需无菌操作。
在临床上多用于白血病的研究。
在实验条件下，这种染色体是机体内真实情况的反映，因此在药品检验、环境监测、食品检验等工作以及致畸、致癌、致突变等研究中，利用骨髓制片的方法易于观察毒性物质在体内对细胞和染色体的影响。
不过，在有些情况下，穿刺取骨髓较困难，或者希望对同一个体材料进行连续的对比取材，以观察药物或环境因素对人类或动物的影响及染色体的动态变化。
这时，采用外周血细胞而不伤害供血者直接制备染色体的技术就十分有利了。
在动物实验时，可在取材前经腹腔注射有丝分裂抑制剂，一般常用秋水仙素。
秋水仙素是从百合科秋水仙属的一个种——秋水仙的器官和种子内提炼出来的一种植物碱。
因有剧毒，故使用时要特别注意，切勿使药液进入眼内或口中。
实验五 细胞染色体数目分析
中，置55℃～60℃水浴1.5h～2h后，加甲醇50mL， 静置24h以上，过滤即成姬姆萨染色液原液，装于 棕色瓶内保存备用。 10% Giemsa染液：取原液1份加入9份 0.01mol/L pH7.2 PBS中混匀。
6、细胞：Marc-145细胞
7、载玻片：4℃预冷
三、操作方法
秋水仙素处理，使细胞停止分裂 取对数生长期的Marc-145细胞一瓶，加入秋 水仙素到培养液内使终浓度为0.4μg/ml。 37℃温箱中继续培养2.5-3h。 收集处理的细胞 倾出秋水仙素处理液，用0.25%胰酶溶液消 化细胞，细胞消化好后加入DMEM培养液将细 胞吹下。 1600r/min离心5min收集细胞。
实验五
细胞染色体分析
(秋水仙素裂解法)
一、原理
细胞处于分裂中期时染色体的长短和大小恰
到好处，是研究染色体最好时期。
秋水仙素能破坏细胞纺锤体,并阻止其形成, 使分裂的细胞停留在分裂中期。 秋水仙素使染色体收缩，形成清晰的轮廓。 低渗液处理可使细胞肿胀，染色体分散 空气干燥使细胞和染色体展平。
二、实验材料
1、有丝分裂抑制剂 100×浓缩的秋水仙素（20μg/ml）：将0.1mg
秋水仙素溶于5ml重蒸水中，分装后冰冻保存。
2、细胞消化液：0.25%胰蛋白酶溶液
3、低渗溶液：0.075mol/L KCl
4、固定液：甲醇∶冰乙酸（3∶1混合）
5、染液(Giemsa 吉姆萨染液)
姬姆萨染色液原液：姬姆萨染料0.6g加于50mL甘油
再 次 加 入 固 定 液 800μl ， 轻 轻 混 匀 ， 静 置 2030min或4℃过夜，1600r/min离心5min，弃l固定液，混匀。 吸取50μl细胞悬液于4℃预冷的干净载玻片上， 轻吹液滴，使细胞悬液铺展于玻片上，室温下自 然干燥。（在显微镜下观察，如果细胞均匀地铺 开，细胞不重叠，则用同样细胞浓度制备细胞样
5-牛蛙骨髓染色体标本的制备与观察
报告成绩实时记录成绩实验五牛蛙骨髓染色体标本的制备与观察学生姓名学号班级座位号：同组同学日期：年月日备注：【Introduction】（1）简述染色体显色技术：将没有染色的中期染色体经过预处理后，再用不同的方法和染料处理，使染色体上出现明暗相间或深浅不同的明显而稳定的斑带。
每条染色体都可被准确识别和鉴定，甚至染色体结构异常也可被检出。
染色体显色技术分为两大类，一类是产生的染色带分布在整个染色体上，如G、Q和R带；另一类是只能使少数特定的区域显带，如C、T和N带。
染色体显色技术极大地促进了细胞遗传学的发展，使每条染色体都可被准确识别和鉴定，甚至出现小的染色体结构异常也可被检出。
（2）制备中期染色体标本的原理和应用：识别染色体的形态特征的最佳时期是细胞有丝分裂中期和早后期。
这时染色体收缩程度最大，形态最稳定，并且分散排列、易于计数。
如果在同一时间内获得不同物种的染色体标本，就可以了解不同物种之间的染色体水平的异同；或者在同一时间内获得同一物种不同技术处理条件下的染色体标本，还可以了解不同技术处理对染色体的影响。
【Materials & methods】实验仪器：复式双筒显微镜（带油镜）；Motic数码互动系统；擦镜纸/盖玻片；载玻片/镊子；记号笔；小片滤纸；移液器/吸头；香柏油/二甲苯；搪瓷盘，剪刀，烧杯，小离心管，玻璃注射器；离心机，一次性手套，骨剪（实验班公用），冰箱（0℃）。
实验材料：肉用成体牛蛙（两组1只）。
实验试剂：0.65％生理盐水；甲醇—冰醋酸(3:1)固定液；蒸馏水；自来水;Giemsa染液。
实验操作：1．动物前期处理：牛蛙称重→注射秋水仙素→3.5~4小时后麻醉→取牛蛙→肢解。
2．取骨髓：剪下四肢→剔骨→剪开骨髓腔→生理盐水冲洗→分四个离心管离心→弃去上清液→生理盐水吹打沉淀物→合并于一管。
3．低渗：每管加蒸馏水1 ml→吹打混匀→30度下静置20 min。
4．固定：离心→弃去上清液→加甲醇-冰醋酸固定液l ml→固定15分钟→吹打悬浮→重复上面步骤一次→离心→弃去上清液→吹打悬浮。
实验五-人类染色体标本制备
实验五-人类染色体标本制备实验目的了解人类染色体的结构和形态，学习制备人类染色体标本的方法。
实验原理人类染色体是由DNA和蛋白质组成的细胞核内生物大分子。
它们是非常细小的、线性的、染色体形态因不同的染色体而异。
人的细胞内共有46条染色体，其中，44条是自动对应的配对染色体，男性有一对性染色体（XY），女性有两条同源性的性染色体（XX）。
制备人类染色体标本需要对细胞进行处理，使其在显微镜下展示出明显的染色体结构。
常用的制备方法是细胞悬液滴落法，即将细胞悬液滴于载片上，在经过一系列的处理后，使其形成明显的染色体结构。
实验步骤1.取合适数量的细胞悬液，滴在已经清洗干净的载片上；2.将载片在干燥器中干燥1小时左右；3.取三瓶试剂，分别为80%乙醇、95%乙醇、细胞色素，放置在洁净的台面上备用；4.将载片沉于80%乙醇中，浸泡5分钟；5.将载片取出，去除乙醇，挥干后，再将载片沉于95%乙醇中，浸泡5分钟；6.将载片取出，去除乙醇，挥干后，将其浸泡在细胞色素溶液中15-30秒；7.将载片在流动自来水下快速漂洗干净，挥干，然后在100%乙醇中固定3-5分钟；8.将载片气干（可用酒精灯），涂两三滴甘油，再覆盖薄玻璃片即可。
实验结果制备好的人类染色体标本可以用显微镜观察到细胞核内的染色体。
成品的标本应该能够清晰地显示出染色体的结构和形态，如下图所示：chromosome1.jpg实验注意事项1.操作时要注意卫生和安全；2.选择细胞悬液的质量对制备染色体标本的质量会有影响；3.操作中需要用到一次性手套；4.操作时尽可能避免离心过度，避免对细胞造成破坏。
实验通过本次实验，我们学习了制备人类染色体标本的方法，掌握相关的操作技巧，对人类染色体的结构和形态有了更深入的了解。
在实验过程中，需要注意卫生和安全，避免对实验者本身和实验环境造成不必要的伤害。
染色体制备
染色体制备染色体制备是指通过特定的实验方法，从细胞中提取染色体并进行处理，以获得高质量的染色体样品用于后续实验研究。
染色体是细胞中的遗传物质，其中包含着基因并承载着遗传信息。
因此，对染色体的制备是理解生物遗传学和基因组学的基础。
在染色体制备过程中，首先需要选择适当的细胞来源。
常用的细胞来源包括动物组织、人类血液、植物根尖等。
不同的细胞来源有不同的特点和处理方法，需要根据实验目的选择合适的细胞来源。
接下来，需要用适当的方法将细胞破碎，使染色体释放出来。
常用的破碎方法包括机械破碎、酶解和超声波破碎等。
机械破碎是将细胞通过高速离心或搅拌等方法破碎，使染色体释放到溶液中。
酶解是利用特定的酶，如蛋白酶和核酸酶等，将细胞的细胞壁和细胞膜降解，释放出染色体。
超声波破碎则是利用超声波的振动作用破坏细胞结构，使染色体释放。
在染色体破碎后，需要进行染色体的纯化和富集。
常用的纯化和富集方法包括差速离心、密度梯度离心和磁珠富集等。
差速离心是根据染色体在离心过程中的沉降速度差异，将染色体从其他细胞组分中分离出来。
密度梯度离心是利用不同密度的溶液，将染色体在离心过程中在不同密度梯度上分离出来。
磁珠富集则是利用特定的磁性珠子，将染色体与磁珠结合，通过磁场将染色体富集到特定位置。
染色体制备后，还需要进行染色体的固定和染色。
固定是通过化学处理使染色体的结构保持不变，常用的固定方法有甲醛固定和冷冻固定等。
染色则是利用染色剂对染色体进行染色，以便观察和分析。
常用的染色方法包括吉姆萨染色、乌仑染色和荧光原位杂交等。
吉姆萨染色是最常用的染色方法，通过吉姆萨染料对染色体进行染色，使染色体呈现出特定的颜色和形态。
染色体制备是基因组学和细胞生物学研究中重要的实验步骤。
通过染色体制备，可以获取高质量的染色体样品，为后续的染色体结构和功能研究提供基础。
同时，染色体制备技术的不断发展，也为研究人员提供了更多更精确的工具和方法，使得对染色体的研究更加深入和全面。
染色体标本的制备及组型观察 实验报告
细胞生物学实验报告染色体标本的制备及组型观察1.实验目的：掌握染色体标本制作的基本方法；认识不同生物的染色体的状态，学会做染色体组型图。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、离心管、离心机、小烧杯、冰箱、酒精灯、小烧杯（1）实验药品：蒸馏水、0.9% NaCl溶液、0.3% KCl溶液，固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、秋水仙素（2）实验材料：小鼠3.实验原理：（1）制作染色体标本的意义：了解染色体的特征（形态、大小、数目）——绘制染色体组型图染色体组型：把真核动物一个体细胞各染色体按长度、形状、着丝粒位置排列成一定顺序。
染色体核型：某一物种特有的一组或一套染色体的形态特征。
（2）染色体组型图的应用①鉴别生物种类：兔44条；小鼠40条；大鼠42条；鸡78条；猫38条；狗78条；马64条②遗传病的诊断和研究：三体综合征（含三条21号染色体）、卵巢退化症（含45条染色体，比正常人缺少一条性染色体）、睾丸退化症（含47条染色体，比正常人多一条X或Y染色体）等因此，我们可以给孕妇抽取羊水检查器胎儿的染色体，做遗传病早期诊断。
（3）染色体标本的制作①观察：由于分裂期中期的染色体染色体凝集程度最高，因而我们应尽量使细胞停留在分裂期中期以便观察。
②细胞：为尽量看到多的染色体，我们应当选取具有旺盛分裂能力的细胞，这样的细胞可以来自:胸腺、骨髓、睾丸、小肠等。
我们在此实验中使用的是小鼠的精巢细胞。
在做人的染色体标本时，我们使用的是血液里的淋巴细胞。
③药物：PHA（植物细胞凝集素）：PHA具有促进细胞凝集和分裂的作用。
PHA可以使血液中的淋巴细胞还原至淋巴母细胞（只存在于骨髓中）秋水仙素：秋水仙素可以破坏微管的组装，纺锤体不能形成，细胞分裂停在中期。
与秋水仙素作用相同的药物还有长春花碱、鬼臼素、苯环己烯等。
可以促进胃管组装的药物有紫杉酚、重水等。
④空气干燥：使细胞与染色体易于分离⑤低渗作用：水进入细胞内，细胞内容空间变大，染色体距离变大，易于分离、展平。
实验五：小鼠骨髓染色体的制备与C带染色
一.小鼠骨髓染色体的制备
【实验目的】 n 学会小鼠骨髓染色体标本的制备
【实验原理】
n 处于分裂期的细胞经秋水仙素处理,由于阻断了 纺锤丝微管的组装,使细胞分裂停止于中期,此 时染色体达到最大收缩,具有典型的形态。
n 本实验所用的小鼠骨髓细胞具有高度的分裂活 性并且数量非常多,经秋水仙素处理后,可使分 裂的细胞阻断在有丝分裂中期,再经低渗、固定、 滴片染色等处理,便可制作较好的小鼠骨髓细胞 染色体标本。
【仪器、材料和试剂】
n （一）仪器 光学显微镜,冰箱,恒温水浴锅。
n （二）材料 n 已制备好的小鼠骨髓染色体载玻片,染色缸,烧杯,镊子
等。 n （三）试剂 n 盐酸(0.2mol/l),5％Ba(OH)2(50℃预热),2×SSC溶液
(60-65℃预热),Giemsa染液
【实验步骤】
1.按上述小鼠骨髓染色体的制备步骤制备染色体
二.染色体C带的制备
【实验目的】 学会小鼠骨髓染色体C带的制备
【实验原理】
n 借助特殊的燃料及染色程序,使染色体的一定部 位呈现深浅不同的带纹,可用来鉴别染色体组, 单个染色体以及深入认识染色体的结构和功能。
n C带可使着丝粒区,端粒区的异染色质及其他染 色体区段的异染色质部分呈Giemsa深染,其他 部分呈淡染。
（三）试剂
n 1．秋水仙素:以1mg/mL的浓度溶于0.85％ 生理盐水中。
n 2．低渗液: 0.075mol/lKCl取5.59gKCl加 到1000mL蒸馏水中,在37℃下预热。
n 3．固定液:甲醇:冰醋酸以3:1配制(新鲜的)
【实验步骤】
1.取雌雄小鼠各一只,注射秋水仙素0。1mL于腹腔中,经3。54h后拉颈椎处死。 2.剪开腹腔,剥离出两条后肢,由股骨关节处剪断,取下后肢(注 意不要将股骨剪断)。 3.将骨骼外面的肌肉尽可能剪掉,剩下附着在骨骼上的少许肌 肉,用棉花或 纱布蘸75％酒精来回搓,直到骨骼外面不带任何肌肉为止。 4.剥离股骨,并将股骨头的两端减去少许,然后用4号针头插入 骨髓腔内,将股骨穿通(注意:不要用力过大,以防骨骼破裂)。
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3) 离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之， 细胞易丢失；
4) 载玻片要洁净，预冷；滴片时确定将材料滴在玻片上；
实验步骤
1.秋水仙素预处理: 收集生长旺盛的细胞1ml，轻轻吹 打散，加入秋水仙素1ul，继续培养6-8小时（已完成 ）；
2. 预处理后的细胞，以1000rpm离心5min，去上清；
3. 低渗处理：加入1ml低渗液，轻轻吹打，使细胞重悬 ，然后补加7ml低渗液，室温下静置20min
4. 预固定：加入3-4滴固定液后，轻轻混匀，避免粘 连，1000rpm离心5min，去上清；
5. 固定：沿管壁慢慢加入3ml固定液，2min后用吸 管轻轻吹打，使细胞分散，固定10min后， 1000rpm离心5min，去上清；
10. 染色：在干燥的载玻片上滴Giemsa，染色 10min，细水冲洗后，空气干燥；
11. 镜检：在低倍镜下寻找染色体分散良好、染色 适中ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。
小鼠中期细胞染色体 （2N=40）
小鼠染色体核型分析
人类慢性骨髓性白血病 （chronic myelogenous leukemia）
• Chr9和Chr22相互易位
• 使得Chr9上的c-abl oncogene和 Chr22上的bcr gene相连，形成融合
基因。 • 其产物是一个融合蛋白 • 这个融合蛋白使细胞不受细胞周期的
控制，导致白血病。 • 只要一个细胞带有这种易位Chr，就
会致病。
猫叫综合征（Cat cry syndrome）
破裂）染色体铺展，同时可使粘附于染色体的 核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有 染色体形态
4. 染料 （ Giemsa ） 不是一种单一染料，而是天青、伊红、甘油和 甲醇的混合物，配制后原液储存， 染色后，染色质呈红色，细胞核是蓝色。
培养瓶
四、实验步骤
培养
秋水仙素
培养液4ml 胎牛血清1ml
培养24小时
1. 秋水仙素 ①阻止微管组装，破坏纺锤体阻断细胞有丝分裂。 ②使染色体收缩成一定的形状。 目的 : 获得大量的中期分裂相细胞。
2. Carnoy固定液 新配置的甲醇 ：冰醋酸混合液 (3:1)。 能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的 完整性，还能够增强染色体的嗜碱性，达到优良 染色效果
3. 低渗液（ 0.075M/L KCl ） 低渗的目的是凭借反渗透作用使细胞膨胀（但不
每ml培养液 加1ug
继续培养3-5小时
1. 取样
2. 离心
3. 低渗
取1ml培养液于 10ml离心管
1000rpm 离心5分钟
弃上清
加KCl 8ml 混匀
37℃处理20分钟
4. 预固定
5. 固定
6. 二次固定
加3-4滴固定液， 轻轻吹打后，离
心去上清
加3ml固定液， 2min后轻轻吹
打后，固定 10min,离心去
三、实验试剂及仪器
材料：具有很强生长分裂能力的细胞系（Hela细胞、 白血病K562细胞、C2C12，BHK细胞等）
仪器：恒温培养箱、离心机、显微镜 培养瓶、移液管、载玻片
试剂：培养液（RPMI1640、M199、DMEM等）、 胎 牛 血 清 、 双 抗 、 NaHCO3 、 生 理 盐 水 、 肝 素 、 1.0g/L 秋 水 仙 素 溶 液 （ 0.1% ） 、 低 渗 液 （ 0.075M/L KCl）、固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)、Giemsa染液
6. 二次固定：加3ml固定液，吹打均匀，固定10min 后，1000rpm离心5min，去上清；
7. 三次固定：重复第6步；
8. 制悬液：去上清后剩0.5ml固定液，用吸管轻轻 吹打使其成为细胞悬液；
9. 滴片：将冰冷的载玻片倾斜30℃，吸取细胞悬液 距离载玻片至少1m滴于载玻片上，吹散，空气 干燥；
上清
加3ml固定液，轻 轻吹打后，固定 10min后，离心
去上清
7.
8.
9.
三次固定 （同6）
制片
预冷冰片
距离20cm以上 玻片倾斜30℃
迅速吹气
过火焰 3-5次
10.
11.
12.
空 气干燥
染色
Giemsa 染色10min
细水流冲洗
13.
14.
吹干
镜检
五、注意事项
1）秋水仙素处理时间要把握好，时间过长，分裂细胞多， 染色体短小；反之，则少而细长
• 临床表现： – 喉部发育不良，哭声似猫叫 – 身体与智能发育不全，小头畸形，满月形脸，眼距宽，低耳位，高鼻梁 – 在婴儿期或幼儿期夭折
• 病因： – 5号染色体短臂缺失，5p-综合征
实验五
组织培养细胞染色体的制备
实验目的 实验原理 实验试剂与仪器 实验步骤 注意事项
一、实验目的
了解组织细胞的培养方法。 掌握染色体标本的制备方法。
二、实验原理
二、实验原理
处于指数生长期的细胞，经过短期培养后， 用秋水仙素处理，可把细胞分裂阻截在中 期，再经过低渗、固定、滴片和染色，就 可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可 以清楚地对染色体进行观察。