蛋白质组学蛋白质组学相关技术及发展文献综述
蛋白质组学及其技术发展
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蛋白质组学综述
蛋白质组学在肿瘤研究中的应用摘要：随着人类基因组全序列草图的完成，从基因水平向蛋白质水平的深化，已成为生命科学研究的迫切需要和新的任务。
蛋白质组学的建立为研究蛋白质水平的生命活动开辟了更为广阔的前景，提供了新型有效的研究手段。
从蛋白质整体水平上研究肿瘤的发生与转移，寻找与肿瘤发生及转移相关的新的蛋白质、肿瘤特异性的标志物及肿瘤药物治疗的靶标，对肿瘤的诊治将起到重要作用。
本文对肿瘤蛋白质组学的研究进展进行了简要综述。
关键词蛋白质组学蛋白质组肿瘤研究进展人类基因组计划全基因组测序的完成，标志着后基因组时代的到来，其主要任务是分析细胞全部蛋白质的结构、功能和相互作用，即蛋白质组学。
恶性肿瘤是危害人类的主要疾病之一，但其发生发展机制仍不清楚，诊断、治疗效果也不理想，而蛋白质组学方法可望为肿瘤发生机制的研究和防治带来新的突破。
本文将蛋白质组学基本概念、研究技术和肿瘤蛋白质组学研究进展作一综述。
1. 蛋白质组和蛋白质组学概念蛋白质组（proteome）的概念最早是由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins等于1994年在意大利的一次科学会议上提出的，他们对蛋白质组的定义：“蛋白质组指的是一个基因组所表达的蛋白质”；即“proteome”是由蛋白质的“prote”和基因组的“ome”字母拼接而成。
它是对应于一个基因组所有蛋白质构成的整体，而不是局限于一个或者几个蛋白质。
由于同一基因组在不同细胞、组织中的蛋白质表达情况各不相同，即使是同一细胞，在不同的发育阶段、不同的生理病理条件下甚至不同的环境影响下，其蛋白质的存在状态也不尽相同。
因此，蛋白质组是一个在时间和空间动态变化着的整体。
蛋白质组学（proteomics）是指以蛋白质组为研究对象，从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成与活动规律。
蛋白质组学研究主要包括：①表达蛋白质组学(expression proteomics)，研究细胞或组织中蛋白质表达的质和量的变化，以及不同时间基因表达谱的改变；②功能蛋白组学(functional proteomics)，研究在不同生理和病理条件下，细胞中各种蛋白质之间的相互作用关系及其调控网络，以及蛋白质的转录后修饰等；③结构蛋白组学(structure proteomics)，以阐明生物大分子蛋白质的三维结构特性为目的[1]。
生物医学中的蛋白质组学研究进展
生物医学中的蛋白质组学研究进展近年来，生物医学研究中的蛋白质组学已受到广泛关注。
蛋白质组学是一种高通量技术，可以对大量的蛋白质进行分析，从而为研究生物学、生物化学、医学、药学等领域提供更深入的了解和新的解决方案。
蛋白质组学研究是一种把人体中的所有蛋白质进行系统分析的科学方法。
通过蛋白质组学研究，可以加深人们对蛋白质的认识，探讨蛋白质在复杂生物学基础上的功能以及与疾病的关系。
这一方法已经极大地推动了生物学、生命科学和生物医学的发展。
近年来，许多科学家已经把研究重心转向蛋白质组学，在这一领域里取得了许多进展。
现在，蛋白质组学已经成为医学诊疗和新药研发的重要方法。
一、蛋白质组学技术蛋白质组学技术是指将蛋白质从生物样品中提取出来，并通过分离和鉴定来确定其种类、数量、结构和功能等的技术。
具体包括质谱技术、二维凝胶电泳、蛋白质芯片、蛋白质相互作用技术等。
1.质谱技术质谱技术最为成熟，在蛋白质组学中得到广泛应用。
分析前，蛋白质需要经过某些步骤，如消化、分离、富集，最后才能进入质谱仪。
2.二维凝胶电泳二维凝胶电泳分离、定量、鉴定和分析蛋白质是蛋白质组学中最经典和传统的方法之一。
这种技术可以将复杂的蛋白质混合物分离成数千个不同的蛋白质，对于大量蛋白质的鉴定具有非常大的优势。
3.蛋白质芯片蛋白质芯片被认为是蛋白质组学领域中非常有前途的技术之一，即将大量不同的蛋白质在几张平凡玻片或其他基材上通过特殊的技术进行分析。
蛋白质芯片具有高通量、高精度、高效性和可重复性，对于筛选药物靶点、发现新的蛋白质以及蛋白质相互作用等方面都具有很强的优势。
4.蛋白质相互作用技术蛋白质相互作用技术通过探测不同蛋白质之间的相互作用，能够解决许多疾病发生的分子机制问题。
蛋白质相互作用技术已经成为细胞生物学、医学等领域的研究重点。
二、蛋白质组学在疾病的研究中的应用蛋白质组学关注蛋白质的表达、定量、亚细胞位点定位、翻译后修饰等，在生物医学研究中，已经广泛地应用于疾病的诊断、治疗和预防等方面。
蛋白质组学的研究方法和进展
蛋白质组学的研究方法和进展蛋白质是细胞中最重要的一类生物大分子，不仅构成生物体的大部分物质，而且参与多种生物过程。
在生物学的研究中，蛋白质组学就是广泛用于研究蛋白质及其解析结构、功能和相互作用的一种技术。
蛋白质组学技术的不断发展，为科学家们提供了更广阔的研究领域和更深入的认识和理解。
一、蛋白质分离技术蛋白质在细胞中有着多种不同的类型和数量，分离这些蛋白质对于进一步的研究至关重要。
凝胶电泳是一种最早应用于蛋白质分离的技术，在这一技术中，蛋白质被分离到一条凝胶条中，并且能够根据其分子量进行鉴定。
近年来，液相色谱技术得到快速发展，以逆相高效液相色谱（RP-HPLC）为主的技术广泛应用于蛋白质的分离、富集和纯化中。
二、蛋白质鉴定技术现代蛋白质组学技术的特点是高通量、高分辨率、高灵敏度和准确率。
鉴定样品中的所有蛋白质非常复杂，多组学技术的整合在蛋白质组学的研究中显得尤为重要。
代表性的鉴定技术是质谱法，可将蛋白质析出后离线或在线进行鉴定。
其中，MALDI-TOF 质谱技术是蛋白质鉴定中的重要方法之一，该技术使用激光脱附离子化（MALDI）策略以减少化学修饰和分离过程对蛋白质结构的影响。
三、蛋白质表达技术从DNA转录到蛋白质翻译的过程，是生物体逐步实现功能的一个重要环节。
蛋白质表达技术是在外部体系中重现这一过程的有效方法，在研究中应用极为广泛。
常见的蛋白质表达系统有大肠杆菌、酵母、哺乳动物等，其中，大肠杆菌是最常用的单细胞表达体系。
近年来，蛋白质表达与修饰的转化药学已经成为一个热门领域，各种新型表达体系也层出不穷。
四、蛋白质数据分析鉴定蛋白质，只是蛋白质组学研究的第一步，有关数据分析和解释的关键环节，对于进一步的研究显得尤为重要。
目前，由于蛋白质比较庞大并且互相之间联系复杂，因此数据分析技术的不断发展就格外重要了。
从最初的数据搜索和标识，到后来的蛋白质序列分析、结构预测、功能预测和网络分析等，蛋白质数据分析技术已经成为蛋白质组学研究的重要环节。
蛋白质组学研究的现状和未来
蛋白质组学研究的现状和未来随着科学技术的不断发展，各个领域也越来越得到人们的重视。
其中，生命科学领域的研究成果对医学、生物学等领域都有着深刻的影响。
而蛋白质组学作为一种较为新兴的技术，其研究也受到了越来越多的关注。
本篇文章将介绍蛋白质组学研究的现状和未来。
一、蛋白质组学研究的背景蛋白质是生命体中最为重要的分子之一，它们负责调节生命体内的许多关键过程，如催化化学反应、支持细胞结构和传递信号等。
蛋白质组学研究的目的就是发现、识别、定量、分析和模拟生物体中所有蛋白质在特定时间和环境下的表达、结构、功能、相互作用和调节。
与其它技术不同的是，蛋白质组学通过综合分析其它多种技术获得的大量数据，从而全面认识生物体中蛋白质在宏观和微观层面上的作用机制。
二、蛋白质组学研究的核心技术蛋白质组学是一种综合的技术，并需要多种技术的有机结合才能实现从样本中获得大量有关蛋白质的信息。
在这个过程中，其中最主要的技术是质谱技术和蛋白质芯片技术。
1、质谱技术质谱技术是一种分析技术，通过质谱仪将大分子物质分解成其成分离子，并对这些离子的分子质量进行质量测定、分析和鉴定。
应用到蛋白质组学研究中，它可以通过肽段质谱和蛋白质质谱分析等手段，对蛋白质进行鉴定和定量的工作。
同时，质谱技术作为高通量研究中的核心技术之一，也可通过基于“表征-鉴别-定量”策略从样本中高效地获得大量的蛋白质。
在高通量蛋白质组学研究中，质谱技术所扮演的角色越来越重要，其自动化、灵敏度、精度、准确度和高通量检测能力甚至被认为是蛋白质组学研究的“金标准”。
2、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是以蛋白质为基质，类似于DNA芯片的方法检测和解析蛋白质功能。
与质谱技术所使用的方法不同，蛋白质芯片技术则基于蛋白质本身对于化学环境、温度、酸碱性、电场等因素的变化反应产生的行为，检测和解析蛋白质的性质和功能。
对于蛋白质芯片技术的发展实现，一方面这种技术可针对某些单一蛋白质的研究，另一方面也可针对高通量蛋白质研究。
蛋白质组学研究内容和相关技术
一、什么是蛋白质组？与基因组差别？蛋白质组学的主要研究内容及技术体系？答：蛋白质组：Proteome，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是由Marc Wilkins 在1994年提出的。
基因组：Genome，一个细胞或者生物体所携带的一套完整的单倍体序列，包括全套基因和间隔序列。
可是基因组测序的结果发现基因编码序列只占整个基因组序列的很小一部分。
因此，基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。
二者区别：蛋白质组研究和基因组研究依然是形影相随的两个重要领域，它们之间既为互相补充又能互相帮助，但二者之间仍有一些区别：蛋白质组：多样性，无限性，动态性，空间性，互相作用。
基因组：同一性，有限性，静态性，周期性，孤立性。
蛋白质组学的主要研究内容：（1）表达蛋白质组学(expressionproteomics)：是对蛋白质组表达模式的研究，即检测细胞、组织中的蛋白质，建立蛋白质定量表达图谱，或扫描表达序列(EST)图谱。
在整个蛋白质组水平上提供了研究细胞通路、疾病、药物相互作用和一些生物刺激引起的功能紊乱的可能性，对寻找疾病诊断标志、筛选药物靶点、毒理学研究等具有重要作用。
（2）细胞图谱蛋白质组学(cellmapproteomocis)：是对蛋白质组功能模式的研究，即确定蛋白质在亚细胞结构中的位置和鉴定蛋白质复合物组成等，便于研究蛋白质在细胞内的行为、运输及蛋白质相互作用网络关系，它对确定蛋白质功能和疾病诊疗的靶位极有价值。
蛋白质组学技术体系：（1）蛋白质组学分离技术，在整个蛋白质组学的研究中，分离技术是最基础的部分。
蛋白质组学的研究方法和进展
蛋白质组学的研究方法和进展蛋白质组学的研究方法主要包括样品制备、质谱分析以及数据分析三个阶段。
在样品制备阶段，研究人员需要选择合适的方法来提取和纯化蛋白质。
常用的方法包括差凝蛋白法、电泳法、柱层析法等。
质谱分析是蛋白质组学的核心技术，主要有两种方法：质谱图谱分析和质谱定量分析。
质谱图谱分析可以通过比对已知蛋白质的质谱图数据库来鉴定未知蛋白质；质谱定量分析可以测定样品中各个蛋白质的数量变化。
数据分析是蛋白质组学研究的关键环节，用于解读大量的质谱数据。
近年来，蛋白质组学的研究取得了诸多重要进展。
首先，高通量质谱技术的发展使得大规模蛋白质组学研究成为可能。
比如，液相色谱和质谱联用技术（LC-MS/MS）可以同时检测数千种蛋白质，大大提高了鉴定和定量蛋白质的效率和准确性。
其次，全蛋白质组学的研究范围不断拓展。
除了研究细胞蛋白质组，研究人员还开始探索组织蛋白质组和生物体蛋白质组等更高层次的组学研究。
通过研究这些复杂组织中蛋白质的种类和功能，可以深入了解细胞和生物体的复杂生理和病理过程。
此外，蛋白质组学也开始向单细胞水平的研究发展，可能为研究细胞发育、疾病药物靶点等方面提供新的突破口。
蛋白质组学在医学和生命科学领域有着广泛的应用前景。
通过深入了解蛋白质组的变化和相互作用，可以揭示细胞和生物体的生理和病理过程，为疾病的早期检测和诊断提供重要依据。
蛋白质组学也可以用于发现新的疾病标志物、筛选新药靶点以及评估药物的疗效和安全性。
此外，蛋白质组学还可以用于研究生命起源、进化以及各种生物学过程的分子机制。
总之，蛋白质组学的发展必将为生命科学研究带来更多的突破和进展。
蛋白质组学(论文)
蛋白质组学【摘要】当今分子生物学领域内，蛋白质组已成为研究的热点。
基因组相对较稳定，而且各种细胞或生物体的基因组结构有许多基本相似的特征；蛋白质组是动态的，随内外界刺激而变化。
对蛋白质组的研究可以使我们更容易接近对生命过程的认识。
蛋白质组学是在细胞的整体蛋白质水平上进行研究、从蛋白质整体活动的角度来认识生命活动规律的一门新学科，简要介绍蛋白质组学的科学背景及其最新发展。
【关键词】蛋白质组实验技术差异蛋白质组学应用前景【正文】1、蛋白质组学产生的科学背景众所周知，始于20世纪90年代初的庞大的人类基因组计划业已取得了巨大的成就，几个物种（包括人类）的基因组序列已经或即将完成。
生命科学已实质性地跨入了后基因组时代，研究重心已开始从揭示生命的所有遗传信息转移到在分子整体水平对功能的研究上。
这种转向的第一个标志是产生了功能基因组学（functional genomics）这一新学科，即从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述_如在RNA水平上通过DNA芯片技术检测大量基因的表达模式。
而第二个标志则是蛋白质组学的兴起。
蛋白质组（proteome）一词是澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams在1994首次提出，最早见诸于文献是在1995年7月的《Electrophoresis》杂志上【1~4】。
它是指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。
蛋白质组学旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式（修饰形式）、结构、功能和相互作用等_国内已有多篇综述文章介绍了蛋白质组学的产生背景与科学意义，从蛋白质组的定义上就可以清楚看出，蛋白质组学不同于传统的蛋白质学科之处在于它的研究是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的，它从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动的角度来揭示和阐明生命活动的基本规律。
2、概念及相关内容蛋白质组用来描述一个细胞、组织或有机体表达的所有蛋白质，蛋白质组学（proteomics）则是研究特定时间或特定条件下这些蛋白质表达情况的科学【5】。
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蛋白质组学蛋白质组学相关技术及发展文献综述蛋白质组学相关技术及发展文献综述张粒植物学211070161概念及相关内容1994年澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组proteome这个概念该英文词汇由蛋白质的“prote”和基因组的“ome”拼接而成并且最初定义为“一个基因组所表达的蛋白质”1。
然而这个定义并没有考虑到蛋白质组是动态的而且产生蛋白的细胞、组织或生物体容易受它们所处环境的影响。
目前认为蛋白质组是一个已知的细胞在某一特定时刻的包括所有亚型和修饰的全部蛋白质2。
蛋白质组学就是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态了解蛋白质之间的相互作用与联系提示蛋白质的功能与细胞的活动规律。
2蛋白质组学的分类蛋白质组学从其研究目标方面可分为表达蛋白质组学和结构蛋白质组学。
前者主要研究细胞或组织在不同条件或状态下蛋白质的表达和功能这将有助于识别各种特异蛋白3目前蛋白质组学的研究在这方面开展的最为广泛其运用技术主要是双相凝胶电泳Two-dimensional gel electrophoresis2DE技术以及图像分析系统当对感兴趣的蛋白质进行分析时可能用到质谱。
由于蛋白质发生修饰后其电泳特性将发生改变这些技术可以直接测定蛋白质的含量并有助于发现蛋白质翻译后的修饰如糖基化和磷酸化等4。
结构蛋白质组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。
近年来酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用时常用的方法同时研究者也将此方法不断改进5。
有研究者最近发现在研究蛋白质相互作用时通过纯化蛋白复合物并用质谱进行识别是很有价值的4。
3蛋白质组学相关技术目前蛋白质组学研究在表达蛋白质组学方面的研究最为广泛其分析通常有三个步骤第一步运用蛋白质分离技术分离样品中的蛋白质第二步应用质谱技术或N末端测序鉴定分离到的蛋白质第三步应用生物信息学技术存储、处理、比较获得的数据。
3.1蛋白质分离技术这类技术主要是电泳其中应用最多的是双向电泳技术其他还有SDS-PAGE、毛细吸管电泳等。
除了电泳外还有液相色谱通常使用高效液相色谱HPLC和二维液相色谱2D-LC。
另外还有用于蛋白纯化、除杂的层析技术、超离技术等。
3.1.1双相凝胶电泳双相凝胶电泳two-dimensional gel elec—trophoresis2DE这是最经典、最成熟的蛋白质组分离技术产生于20世纪70年代中叶但主要的技术进步如实验的重复性、可操作性蛋白质的溶解性、特异性等是在近lO年取得的。
它根据蛋白质不同的特点分两相分离蛋白质。
第一相是等电聚焦IEF电泳根据蛋白质等电点的不同进行分离。
蛋白质是两性分子根据其周围环境pH可以带正电荷、负电荷或静电荷为零。
等电点pI是蛋白质所带静电荷为零时的pH周围pH小于其pI时蛋白质带正电荷大于其pI时蛋白质带负电荷。
IEF时蛋白质处于一个pH梯度中在电场的作用下蛋白质将移向其静电荷为零的点静电荷为正的蛋白将移向负极静电荷为负的将移向正极直到到达其等电点如果蛋白质在其等电点附近扩散那么它将带上电荷重新移回等电点。
这就是IEF的聚焦效应它可以在等电点附近浓集蛋白从而分离电荷差别极微的蛋白。
pH梯度的形成最初是在一个细的包含两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶管中进行。
在电流的作用下两性电解质可形成一个pH梯度。
但由于两性电解质形成的pH梯度不稳定、易漂移、重复性差80年代以后研究人员研制了固定pH梯度的胶条IPG。
此种胶条的形成需要一些能与丙烯酰胺单体结合的分子每个含有一种酸性或碱性缓冲基团。
制作时将一种含有不同酸性基团的此分子溶液和一种含有不同碱性基团的此分子溶液混合两种溶液中均含有丙烯酰胺单体和催化剂不同分子的浓度决定pH的范围。
聚合时丙烯酰胺成分与双丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。
第二相是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE根据蛋白质的分子量不同进行分离。
此相是在包含SDS的聚丙烯酰胺凝胶中进行。
SDS是一种阴离子去污剂它能缠绕在多肽骨架上使蛋白质带负电所带电荷与蛋白质的分子量成正比在SDS聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质分子量的对数与它在胶中移动的距离基本成线性关系。
SDS-PAGE装置有水平和垂直两种形式垂直装置可同时跑多块胶如Amersham pharmacia Biotech的Ettan DALT II系统可同时跑12块胶提高了操作的平行性。
经过2DE以后二维平面上每一个点一般代表了一种蛋白这样成千种不同的蛋白即可被分离有关蛋白质的等电点、分子量及每种蛋白的数量信息也可以得到。
蛋白质组学分析对2DE后的染色技术要求很高除了标准的敏感性要求外还要求染色技术的线性和均一性6。
目前有多种染色方法如考马斯亮蓝染色、银染色、及荧光染色等。
银染比考马斯亮蓝染色灵敏度高已有学者对这两种方法进行了比较如PhillipCash等在检测肺炎链球菌红霉素敏感株和抵抗株表达的蛋白时用考马斯亮蓝G-250染色发现了200多种蛋白PI4-7分子量15000-110000在相同的PI和分子量范围下用银染检测到360多种蛋白7。
但是银染的线性效果并不是很好并且对质谱分析干扰大。
考马斯亮蓝染色线性、均一性较高对质谱干扰较小但其敏感性较低。
较理想的是荧光染色Thierrry Rabilloud等比较了两种荧光剂RuBps和Sypro Ruby的效果发现其敏感性、线性都很好对质谱干扰小6但其成本较高。
实验时可以根据不同的目的选用不同的方法。
2DE图像所产生的大量蛋白质点是单纯用肉眼分析无法完成。
目前有多种图像分析软件可用于胶的图像分析如MelanieII BioRad PD Quest BioRad Phoretix2D Full又称2D Image Master Elite Amersham Pharmacia Biotech等这些软件可以完成蛋白质点的识别、匹配等具有很强的分析功能但其缺点是需要很多的图像手工校对一般分析一个图像需要8-10h。
2DE是目前唯一的一种能溶解大量蛋白质并进行定量的方法具有高通量、重复性好、敏感性较高等优点8。
它能同时分离和定量数千种甚至上万种蛋白8。
它的分辨率极高等电聚焦相可以区分PI相差0.1的蛋白质SDS-PAGE相可以区分分子量相差1kD的蛋白质9。
其缺点是由于蛋白表达水平的差异较大一些低丰度的蛋白不易检测810。
另外某些基因的表达产物在2D胶中呈多点或不同基因的表达产物共点使2D胶数据的比较、定量更加复杂8。
2DE 分离的蛋白数量受诸多因素影响疏水性的膜蛋白往往是药物设计最好的靶点很难用此法分离同时染色技术的灵敏度和线性范围不足以呈现所有分离的蛋白质。
目前人们采用多种方法来减少这些缺点如通过增加上样量分离低丰度蛋白应用窄范围固定pH梯度胶条、蛋白层析等技术提高分离的蛋白数目应用荧光染色提高检测灵敏度等。
3.1.2双向荧光差异电泳双向荧光差异电泳two—dimensional difference gel electrophoresis2D—DlGE2D—DIGE分析系统是在传统双向电泳技术的基础上结合了多重荧光分析的方法在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品并第一次引入了内标的概念极大地提高了结果的准确性、可靠性和重复性。
在DIGE技术中每个蛋白点都有它自己的内标且软件自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准这样可以很好地去除样品的假阳性差异点。
DIGE技术可检测到表达差异小于10的蛋白统计学可信度达到95以上。
利用Ettan DIGE技术还可以对微量少到5μg 样品进行蛋白质组学分析。
2D-DIGE的具体操作过程与常规2DE的步骤相似所不同的就是在样品制备时在每份样品中预先分别加入不同的荧光染料并且需要制作一个供其他样品比较的内参另外在电泳后的凝胶显色时需要在特殊的荧光检测仪中进行。
3.1.3液相色谱高效液相色谱因具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广等特点广泛应用于生产实践中。
高效液相色谱是利用高压输液泵驱使带有样品的流动相通过装填固定相的色谱柱利用固液相之间的分配机理对混合物样品溶液进行分离的方法。
例如对奶粉中三聚氰胺的检测11。
二维或多维液相色谱是将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统。
样品经过第一维的色谱柱进入接口中通过浓缩、捕集或切割后被切换进入第二维色谱柱及检测器。
二维液相色谱通常采用两种不同的分离机理分析样品即利用样品的不同特性把复杂混合物如肽分成单一组分这些特性包括分子尺寸、等电点、亲水性、电荷、特殊分子间作用亲和等。
在一维分离系统中不能完全分离的组分可能在二维系统中得到更好的分离分离能力、分辨率得到极大的提高。
完全正交的二维液相色谱峰容量是两种一维分离模式单独运行时峰容量的乘积。
3.2目的蛋白点的筛选对目的蛋白的筛选通常与双向电泳连用主要用来分析凝胶中分离出的蛋白质样品采用的主要技术手段通常是Western印迹和差异蛋白比较分析。
Western印迹主要是将双向电泳后的凝胶不经过染色而直接转印到固相支持物如NC膜、PVDF膜等上再在膜上进行免疫学反应从而筛选出与免疫功能相关的蛋白差异蛋白比较分析则是先对凝胶进行染色然后应用软件如Image Master、PDQuest等对存在差异的2组凝胶进行比较从而找出差异的蛋白。
在比较时通常要求每个被分析的样品重复3次然后先做组内比较再做组间比较。
3.3蛋白质鉴定技术对2DE所产生的上千个蛋白用传统的方法如Edman降解法等进行分析将是一个很艰巨的任务。
质谱技术的发展解决了这一难题。
3.3.1一级质谱质谱技术的高速发展目前可以快速、高效地对目的蛋白进行鉴定且样品用量少通常达到微克级。
除此之外质谱技术还可以对蛋白质翻译后修饰进行分析。
根据离子源的不同质谱主要包括基质辅助激光解析飞行时间质谱MALDITOFMS、电喷射离子井飞行时间质谱ESI—TOFMS。
常用的质谱分析仪除了飞行时间TOF外还有四级杆Q、离子井而在串联质谱中通常使用的是Q—TOF或TOF—TOF等。
2种离子源都可以使肽段、蛋白、药物的代谢产物、寡核苷酸等其他碳水化合物离子化进而被质谱仪分析。
通常的质谱仪一般由样品槽、离子源、分析仪和检测器组成。
由于单一地依靠蛋白质相对分子质量并不能对目的蛋白进行理想的鉴定因此须事先用蛋白酶如胰蛋白酶将检测样品酶解成不同长度的肽段。
在MALDI—TOF质谱中还需要向样品中加入基质以促使样品离子化离子化的确切基质目前还不清楚然后在离子源的作用激光激发下使样品变为气相离子。
这些被激发的气相离子进入质量分析仪根据其荷质比而把肽段进行区分。
质谱的整个过程都是在真空条件下进行的。
ESI 则不需要基质辅助而是使用具有一定能量的电子直接作用于样品分子使其电离。