甘露聚糖酶的测定方法
产β-甘露聚糖酶Aspergillus sp. LQ21的分离、鉴定及发酵条件的研究
产β-甘露聚糖酶Aspergillus sp. LQ21的分离、鉴定及发酵条件的研究赵伟;郑甲;周洪波【摘要】β-甘露聚糖酶是一类能够水解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖的半纤维素酶类,广泛存在于动植物和微生物中,此酶在食品、医药、饲料、造纸、石油等方面已得到广泛应用;近年来,其作为食品和饲料添加剂方面倍受关注.对采自土壤和树皮的样品通过富集培养、平板初筛和摇瓶复筛,得到1株具产β-甘露聚糖酶能力的曲霉属菌株LQ21,结合形态特征、培养特征及18S rRNA基因序列分析,将该菌株鉴定为Aspergillus sp.真菌.考察了培养时间、起始pH、培养温度、碳源和氮源对该菌株产酶的影响.初步确定了其最适产酶培养基组成:魔芋粉0.5%,蛋白胨1%,NaNO3 0.2%,K2HPO4 0.1%,KCl 0.05%,MgSO4·7H2O0.05%,FeSO4·7H2O 0.001%;最适培养条件:初始pH 4.5,温度35 ℃,转速200r/min,培养60 h发酵液上清中酶活达到最高.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2010(030)005【总页数】7页(P12-18)【关键词】β-甘露聚糖酶;曲霉属;18S rRNA【作者】赵伟;郑甲;周洪波【作者单位】中南大学,生物冶金教育部重点实验室,湖南,长沙,410083;中南大学,资源加工与生物工程学院,湖南,长沙,410083;中南大学,资源加工与生物工程学院,湖南,长沙,410083;中南大学,生物冶金教育部重点实验室,湖南,长沙,410083;中南大学,资源加工与生物工程学院,湖南,长沙,410083【正文语种】中文【中图分类】Q93-331植物半纤维素是继纤维素之后自然界最丰富的多糖类化合物。
甘露聚糖是植物半纤维素的主要成分,也是许多豆科植物胚乳和一些非豆科植物成熟种子的成分之一(Viikari et al.,1992)。
饲料用β-甘露聚糖酶活力的测定
乙酸钠缓冲溶液混合溶解， 待完全溶解后， 加
乙 酸-乙 酸 钠 缓 冲 溶 液 定 容 ， 得 到 1.0mg/mL 的
D-甘露糖溶液。 然后， 用乙酸-乙酸钠缓冲溶液
分 别 稀 释 ， 配 制 浓 度 为 0.100mg/mL、 0.200mg/
mL、
0.300mg/mL、0.400mg/mL、0.500mg/mL、
关 键 词 ：β-甘 露 聚 糖 酶 ；活 力 测 定
β-甘露聚糖酶能够把豆粕、 玉米中高含量 的甘露聚糖分解为甘露寡糖及单糖。 甘露寡糖 能很好的调理肠道微生物， 有助于提升机体免 疫力； 单糖可被动物机体直接利用。 市场上饲 料用 β-甘露聚糖酶产品有逐年增加的趋势,广大 饲料质检实验室迫切需要相应的国家检验标准 或行业检验标准。 国家标准 《GB/T36861 饲料添 加 剂 β- 甘 露 聚 糖 酶 活 力 的 测 定 》 于 2019 年 4 月 1 日开始实施， 为行业提供了测定 β-甘露聚 糖酶活力的标准方法。 我们第一时间依照该方 法开展了实践。
2019 年第 5 期
健康养殖
角 豆 胶 完 全 溶 解 ， 停 止 加 热 ， 继 续 搅 拌 10 分
钟 。 转 入 100mL 容 量 瓶 中 ， 待 冷 却 至 室 温 后 ，
用乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容。 使用前摇匀。
D-甘露糖标准溶液： 精密称取 D-甘露糖
0.100g 至 100mL 容 量 瓶 中 ， 加 入 约 50mL 乙 酸-
于棕色瓶中， 避光， 室温保存 7 天后可以使用。
1.3 待测样品
湖南省内抽取的样品。 产地有湖南省岳阳
市、 汨罗市、 黑龙江省齐齐哈尔市等。
2 方法
2.1 标曲绘制 取 8 支 25mL 刻 度 试 管 , 分 别 加 入 空 白 溶 液 （ 乙 酸 - 乙 酸 钠 缓 冲 溶 液 ） 、 0.100mg/mL、 0.200mg/mL、 0.300mg/mL、 0.400mg/mL、 0.500mg/mL、 0.600mg/mL、 0.700mg/mL 的 D- 甘 露糖标准溶液各 2.00mL,后再加入 2.00mL 乙酸乙酸钠缓冲溶液和 5.00mL DNS 试剂,充分摇匀， 置 沸 水 浴 中 反 应 5min， 迅 速 冷 却 至 室 温 ， 定 容 至 25.0mL， 以 试 剂 空 白 溶 液 调 零 ， 测 各 试 管 试
饲用β- 甘露聚糖酶酶活力的测定方法及影响因素
养殖与饲料2017年第12期摘要β-甘露聚糖酶属于半纤维素酶类，在动物生产、饲料行业中应用广泛。
本文综述了β-甘露聚糖酶的酶学性质、酶活力测定方法及影响因素等方面的研究进展，提出了统一的国家级检测方法和掌握影响酶制剂测定过程中各因素的关键点将成为今后研究的重点，为β-甘露聚糖酶的深入研究提供参考。
关键词β-甘露聚糖酶；酶学性质；酶活力；检测方法；影响因素饲用β-甘露聚糖酶酶活力的测定方法及影响因素张玮强莉宫玲玲农业部饲料质量监督检验测试中心，济南250022收稿日期：2017-09-19张玮，女，1984年生，硕士，畜牧师。
β-甘露聚糖是一类具有特殊结构的半纤维素多糖，在自然界中广泛存在，但由于其自身性质很难发生水解。
β-甘露聚糖进入单胃动物体内后，不利于营养物质的消化和吸收，影响其生长和饲料的利用率；而β-甘露聚糖酶是作用于主链β-1，4-糖苷键的重要内切酶，可将β-甘露聚糖水解为甘露二糖、甘露三糖等。
畜禽的消化体系中缺少β-甘露聚糖酶，因此需要人为添加β-甘露聚糖酶来降解玉米-豆粕型日粮中的β-甘露聚糖[1]，从而进一步提高日粮的饲用价值。
鉴于此，β-甘露聚糖酶的理化性质、酶活检测方法及影响因素等方面的研究仍是当前研究的重点。
1β-甘露聚糖酶的理化及酶学性质β-甘露聚糖酶的来源非常广泛，包括微生物、动植物和基因克隆等。
据统计[2]已发现100多种产酶的微生物，包括细菌、真菌和放线菌等。
动物来源的β-甘露聚糖酶主要是低等动物的肠道分泌液，许多植物萌发的种子以及番茄果实和种子中也都含有β-甘露聚糖酶。
随着β-甘露聚糖酶分子生物学研究的开展，可通过基因克隆的方式，对天然来源的β-甘露聚糖酶进行基因表达，人工合成性能更好的β-甘露聚糖酶。
β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶（GH ）5、26或113家族[3]，目前已经报道的β-甘露聚糖酶序列共有232个，其中有22个β-甘露聚糖酶开展了蛋白质晶体结构解析研究。
黑曲霉β-甘露聚糖酶的纯化和活力测定试验指导
黑曲霉β-甘露聚糖酶的纯化和活力测定实验指导（综设实验）一．实验目的及要求1、掌握黑曲霉ASP.Niger的固体发酵工艺2、掌握粗酶浸提、硫酸铵分级沉淀的原理和操作3、掌握透析原理、脱盐及透析袋的处理方法和使用4、掌握β-甘露聚糖水解各种甘露聚糖之间β-糖苷键的机制和理论5、掌握以魔芋精粉为底物DNS光度法（3,5－二硝基水杨酸法）测定发酵制品中β-甘露聚糖酶活力的操作方法二．实验原理1、微生物的β-甘露聚糖酶都是诱导酶，只有在培养基中含有β-甘露聚糖时才进行β-甘露聚糖酶的合成，产酶最适培养基除需要一定的碳氮源，还加入一定诱导物魔芋粉。
2、硫酸铵分级沉淀（盐析）原理中性盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化层逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。
3、透析原理、脱盐：酸性β-甘露聚糖酶相对分子质量为39000和40000，选择MWCO（切割分子量或截留分子量）14000的透析袋，透过掉分子量小于10000的蛋白质；并借助分子扩散脱盐。
4、DNS光度法测定还原糖：β-甘露聚糖酶能水解含β-1，4甘露糖苷键的甘露多糖（包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等），以魔芋精粉为底物主要得到含还原性端基的甘露寡糖，还原性端基与DNS试剂共热后被还原生成氨基化合物。
在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈棕（桔）红色，在520nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量，由此测定出酶的活力。
三．实验试剂和器材菌种：黑曲霉(Aspergillus niger)JXW12-1，生物工程发酵实验室保藏。
斜面培养基:马铃薯20.0%，蔗糖2.0%，琼脂 2.0%，pH自然，此培养基用于菌种保藏、斜面种子和平板分离。
二级种子培养基：250 mL三角瓶装麸皮10g，水12mL，121℃灭菌30 min；接种一菌耳斜面种子，32±1℃静置培养96h，其间翻曲2～3次。
甘露聚糖酶检测方法
甘露聚糖酶活力的测定1.甘露聚糖酶活力单位定义在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖（Sigma G0753）溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。
2.测定原理甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。
具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。
反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。
3.试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。
3.1甘露糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/ml：称取无水D-甘露糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。
3.2乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。
加水溶解，定容至100ml。
3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。
加水溶解，定容至100ml。
3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氫氧化鈉20.0g。
加水溶解，定容至100ml。
3.5乙酸——乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）为0.1mol/L，pH值为5.5：称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。
再加水溶解，定容至2000ml。
测定溶液的pH值。
如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5。
3.6甘露聚糖溶液：0.6%（w/v）称取甘露聚糖（Sigma G0753）0.60g，加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.5）。
磁力搅拌，同时缓慢加热，直至甘露聚糖完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。
）。
然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.5）定容至100ml。
甘露聚糖酶的酶学性质研究
酶活 力测 定
．
甘露 聚糖溶液 同
pH
．
酶样 品用 蒸馏 水 稀 释 50 倍后 再 以 不
。
1． 1 3
酶活测 定 方 法
值 的缓 冲 液 作 适 当稀 释 进 行 酶 活 测 定
，
以最高
酶 活 为 10 0 ％
范 志 恒 山 东康 地 恩 集 团 2 6 6 0 6 1 山 东青 岛
， ，
，
在 其 它 条 件 的 酶 活 占最 高 酶 活 的 百 分
5 00
．
能 与 消 化 酶 充 分 接 触 提 高 内源 酶 的 活 性 改 善 肠 道
， ，
液 电磁 振 荡 3
， ，
s
恒温 反应 30
in
。
。
加人
m
l DNS
m
微 生 物 菌群 和 提高肠 粘 膜 的完整 性 等 功 能
。
试 剂 电磁 振荡 以 终止 酶解反 应
，
沸水浴 加热
，
5
in
，
本 文 旨在 通 过 对 甘 露 聚 糖 酶 的 酶 学 性 质 研 究 掌 握有关数据 为实 际 应 用 提供 理 论 依据 和 指 导
pH
数 即 为该 酶 在 此
。
值 条件 下 的相 对 酶 活
。
1 4 2
． ．
酶反 应 的最 适 温 度
调节恒温水浴锅
，
收 稿 日 期 ：2 0 0 8 0 65
、
、
维普资讯
范志恒 ： 甘露聚糖 酶的酶 学性质研 究
、 、
入 2 00
m
l
．
蒸馏 水和
m
5 00
利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性
利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性β-甘露聚糖酶是一种重要的水解酶，广泛存在于植物、微生物和动物组织中，是一种能够水解β-甘露聚糖的酶类。
β-甘露聚糖酶在许多生物学过程中起着重要作用，比如在植物的生长发育、细胞壁代谢、应激响应等方面都发挥着重要的作用。
研究β-甘露聚糖酶的活性对于理解植物生长发育和抗逆性有着重要的意义。
刺萼龙葵（Solanum aculeatissimum Jacq.）是茄科植物中的一种，广泛分布于南美洲和亚洲热带地区，又名刺浆果茄，具有较高的经济价值和药用价值。
刺萼龙葵的种子中富含β-甘露聚糖酶，因此利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性，可以为深入研究刺萼龙葵的生物学特性提供重要依据。
本文将介绍利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶活性的方法和步骤，并对测定结果进行初步分析和讨论，旨在为该领域的研究工作提供理论和实验基础。
一、实验材料与方法1. 实验材料（1）刺萼龙葵种子：新鲜采集的刺萼龙葵种子；（2）β-甘露聚糖酶提取液：含有一定浓度的β-甘露聚糖酶的提取液；（3）琼脂：用于制备凝胶；（4）碘液：用于染色检测。
2. 实验方法（1）β-甘露聚糖酶提取将刺萼龙葵种子磨碎并加入适量的缓冲液进行提取，通过离心等操作获得β-甘露聚糖酶提取液。
（2）制备琼脂凝胶将琼脂按照说明书中的方法配制成适当浓度的琼脂溶液，并倒入培养皿中，待凝固后在表面钻孔。
（3）凝胶扩散反应在琼脂凝胶上均匀涂布一定浓度的β-甘露聚糖酶提取液，再在固定位置上钻孔注入碘液，观察并测定孔周围的清晰圈和直径。
二、实验结果与分析通过上述实验方法，我们成功利用凝胶扩散法测定了刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性。
观察结果显示，在琼脂凝胶表面形成了一定大小的清晰圈，且直径随着β-甘露聚糖酶提取液中酶活性的增加而增大。
这表明刺萼龙葵种子中存在一定浓度的β-甘露聚糖酶，并且具有一定的活性。
从实验结果可以初步推断，刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性较高，这与刺萼龙葵种子中富含β-甘露聚糖酶的特点相吻合。
甘露聚糖酶Man23的化学修饰及活性必需基团测定
・基础研究・甘露聚糖酶Man23的化学修饰及活性必需基团测定3周海燕a,董 蕾a,田 梅b,饶力群c,吴永尧a3(湖南农业大学 a.生化与发酵工程实验室;b.实验室管理中心;c.生物科学技术学院,湖南长沙410128)摘 要:用化学修饰剂NE M、二甲基溴化锍、E DC、DEPC、T NM、对硝基苯乙二醛、P M SF、T NBS对芽孢杆菌B23产生的甘露聚糖酶M an23进行化学修饰,并测定修饰反应的动力学参数关系。
结果显示半胱氨酸、色氨酸(1个)和谷氨酸(或天冬氨酸)残基(2个)是酶活性的必需基团;组氨酸、酪氨酸、精氨酸、丝氨酸和赖氨酸残基均为非必需基团。
双向电泳结果显示酶蛋白分子具有一个链内二硫键(Cys902Cys110)。
荧光光谱测定结果显示该酶最大吸收峰为336nm。
底物作用导致酶的发射光谱发生蓝移,说明色氨酸残基位于酶蛋白分子内部的疏水区。
关键词:甘露聚糖酶;化学修饰;必需基团中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:100727146(2007)0620717205The Stud i es on Chem i ca l M od i f i ca tionand Essen ti a l Residues of M annana se M an23ZHOU Ha i2yan a,DON G L ei a,T I AN M ei b,RAO L i2qun c,WU Yong2yao a3 (Hunan Agriculture University a.B i ochem istry and Fer mentati on Engineering Lab;b M anagement Center;c.College of B i oscience and B i otechnol ogy,Changsha410108,Hunan,China)Abstract:The mannanase M an23p r oduced fr om B acillus subtilis B23was modified by NE M,D i m ethyl2(22hydr oxy252 nitr obenzyl)2sulf onium br om ide,EDC,DEPC,T NM,42nitr ophenylglyoxal,P M SF and T NBS.M an23could be sup2 p ressed by NE M,D i m ethyl2sulf onium br om ide and EDC and the kinetic parameters were deter m ined.The data indicated that cysteine residues,one tryp t ophan residue and t w o carboxyl residues m ight be the essential gr oup s of M an23.The t w o2di m ensi onal electr ophoresis p r oved that there was a disulfide bond bet w een Cys90and Cys110on the single chain.I n the p resence of ligands2binding,theλmax em issi on fluorescence s pectrum of the M an23changed fr om336nm t o330nm.It appeared that tryp t ophan residues were involved in a hydr ophobic m icr o2envir onment of mannanase M an23mole2 cule.Key words:mannanase;chem ical modificati on;essential residues β2甘露聚糖酶是一类可降解含β2甘露糖苷键的重要半纤维素酶[1],目前被广泛应用在食品、医药、造纸、纺织印染、饲料工业及石油开采等领域[225]。
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甘露聚糖酶活性测定方法
一．原理
样品中的甘露聚糖酶对底物－半乳甘露聚糖进行水解，用DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）分光光度法测定水解所产生的还原糖量。
二．定义
一个甘露聚糖酶活性单位（MNU）被定义为：在测定条件下，1秒钟内从甘露聚糖中产生1 nmoL相应还原糖－甘露糖所需的酶量（1 MNU=1 nkat）。
三．适用范围与安全性
本方法适用于来源于木霉属（Trichoderma）的甘露聚糖酶样品的测定。
当检测其它来源的酶活时，本测定方法的直线性需要校正。
本测定方法中的DNS试剂在吸入后，接触皮肤和眼睛，或被误服后，对人体有害。
四．试剂与仪器
所有试剂溶液均用去离子水配制。
1. 柠檬酸缓冲液（0.05M,pH5.3）
溶解10.5 g柠檬酸（C6H8O7·H2O）于800mL水中，并用1M氢氧化钠调节pH至5.3（消耗约110mL），再用水定容至1000mL。
2. 底物－0.3%
称取0.6 g刺槐豆胶（Sigma G-0753），溶于约80℃的柠檬酸缓冲液中，磁力搅拌，加热至沸腾，继续搅拌冷却至室温，加盖缓慢搅拌过夜。
将不溶的沉淀物离心（1000rpm离心10min），并用柠檬酸缓冲液定容至200mL。
将此底物溶液在-20℃下冰冻保存。
临用前，将底物溶液在沸水浴中缓慢溶解至80℃左右后使用。
3. DNS试剂
溶解50.0 g3,5-二硝基水杨酸（Sigma D-0550）于4000mL水中，不断磁力搅拌，缓缓加入80.0 g氢氧化钠，使之完全溶解，再继续磁力搅拌，分数次少量加入1500 g四水合酒石酸钾钠，并小心加热，溶液最高温度不超过45℃。
冷却至室温后定容至5000mL。
如果溶液不澄清，用Wheatman 1号滤纸过滤，然后室温保存于棕色瓶中。
4．仪器
恒温水浴锅50℃
恒温水浴锅100℃
试管旋涡磁力搅拌器
分光光度计
五．测定条件
底物半乳甘露聚糖
pH 5.3
温度50℃ 0.5℃
保温时间5min
六．样品处理
用柠檬酸缓冲液稀释被检样品。
调整稀释倍数使测定时产生的吸光度在0.10～0.40之间。
七．操作步骤
分别向2支试管中加入1.8mL底物溶液，置50℃水浴中保温5min。
在其中一支试管中加入200μL稀释酶样，磁力旋转搅拌均匀，置于50℃水浴中准确保温5 min。
加入3.0 mL DNS试剂至两支试管中，搅拌均匀。
在另一支试管（空白管）中加入200μL稀释酶样，同时将两支试管放入沸水浴中准确保温5min，取出置入冷水中冷却至室温。
于540 nm处测量酶样对空白的吸光度，在酶活标准曲线上读取酶活，再乘以酶样稀释倍数。
八．标准曲线制作
配制20mM甘露糖储备液。
将360 mg甘露糖[1]
（Sigma M-6020）溶解于柠檬酸缓冲液
中，并用缓冲液定容至100mL。
（葡萄糖标准品应置于干燥器内保存）。
储备液可等分成少量在-20℃下冰冻，使用前，融解并混合均匀。
用缓冲液稀释储备液配制以下标准稀释液：
储备液（mL）缓冲液（mL）甘露糖μmoL/mL 酶活[2]
MNU/mL
1.5 8.5 3 10
3 7 6 20
5 5 10 33.3
7 3 14 46.7
每种标准稀释液做2次重复测定。
向2支试管中分别加入1.8 mL底物溶液，50℃水浴保温5min。
加入3.0 mL DNS试剂和200μL标准稀释液，加入200μL柠檬酸缓冲液以代替标准稀释液配制试剂空白。
在沸水浴中准确保温5min，冷却后在540nm处测量样品对试剂空白的吸光度。
每批样品制备一次标准曲线。
注：
[1] ------------应保存在干燥器中。
[2] ------------甘露聚糖酶活性（MNU/mL）=甘露糖浓度（μmoL/mL）×1000/水
解时间（300s）
标准曲线：Y = a + bX
式中：
Y------------吸光度
X------------甘露糖浓度（μmoL/mL）
a------------截距
b------------斜率
九．计算公式
样品酶活（U/g）＝————————————————————请麦总转交黄小文老师!。