09甘露聚糖酶的检测方法
饲用β- 甘露聚糖酶酶活力的测定方法及影响因素
养殖与饲料2017年第12期摘要β-甘露聚糖酶属于半纤维素酶类，在动物生产、饲料行业中应用广泛。
本文综述了β-甘露聚糖酶的酶学性质、酶活力测定方法及影响因素等方面的研究进展，提出了统一的国家级检测方法和掌握影响酶制剂测定过程中各因素的关键点将成为今后研究的重点，为β-甘露聚糖酶的深入研究提供参考。
关键词β-甘露聚糖酶；酶学性质；酶活力；检测方法；影响因素饲用β-甘露聚糖酶酶活力的测定方法及影响因素张玮强莉宫玲玲农业部饲料质量监督检验测试中心，济南250022收稿日期：2017-09-19张玮，女，1984年生，硕士，畜牧师。
β-甘露聚糖是一类具有特殊结构的半纤维素多糖，在自然界中广泛存在，但由于其自身性质很难发生水解。
β-甘露聚糖进入单胃动物体内后，不利于营养物质的消化和吸收，影响其生长和饲料的利用率；而β-甘露聚糖酶是作用于主链β-1，4-糖苷键的重要内切酶，可将β-甘露聚糖水解为甘露二糖、甘露三糖等。
畜禽的消化体系中缺少β-甘露聚糖酶，因此需要人为添加β-甘露聚糖酶来降解玉米-豆粕型日粮中的β-甘露聚糖[1]，从而进一步提高日粮的饲用价值。
鉴于此，β-甘露聚糖酶的理化性质、酶活检测方法及影响因素等方面的研究仍是当前研究的重点。
1β-甘露聚糖酶的理化及酶学性质β-甘露聚糖酶的来源非常广泛，包括微生物、动植物和基因克隆等。
据统计[2]已发现100多种产酶的微生物，包括细菌、真菌和放线菌等。
动物来源的β-甘露聚糖酶主要是低等动物的肠道分泌液，许多植物萌发的种子以及番茄果实和种子中也都含有β-甘露聚糖酶。
随着β-甘露聚糖酶分子生物学研究的开展，可通过基因克隆的方式，对天然来源的β-甘露聚糖酶进行基因表达，人工合成性能更好的β-甘露聚糖酶。
β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶（GH ）5、26或113家族[3]，目前已经报道的β-甘露聚糖酶序列共有232个，其中有22个β-甘露聚糖酶开展了蛋白质晶体结构解析研究。
甘露聚糖酶的酶学性质研究
甘露聚糖酶的酶学性质研究甘露聚糖酶是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解β-1，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等。
它不仅能够降解肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收，而且还可消除豆类中富含的β-甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饼粕尤其是豆粕的能量消化率；同时，添加了甘露聚糖酶后动物的抵抗力及整齐度都有提高。
甘露聚糖类物质作为半纤维素的第二大组分，广泛分布于自然界中。
它是所有豆科植物细胞壁的主要组成成分，在其他植物性饲料原料中含量也很高，如豆粕、小麦、菜籽粕、麸皮中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖的含量分别为22.7％，11.9％，19.6％和33.7％。
我国猪、鸡的主要日粮是玉米／豆粕型日粮，尽管猪、鸡等单胃动物对玉米的消化率较高，但对豆粕的能量利用率仅为50％～60％。
单胃动物对豆粕能量的利用率如此低的原因可能是豆粕中含有22.7％左右的半纤维素是不能被单胃动物消化的非淀粉多糖。
饲料中添加甘露聚糖酶可以降解甘露聚糖、降低消化道内容物黏度，破坏植物性饲料细胞壁结构，使营养物质能与消化酶充分接触，提高内源酶的活性，改善肠道微生物菌群和提高肠粘膜的完整性等功能。
本文旨在通过对康地恩甘露聚糖酶的酶学性质研究，掌握有关数据，为实际应用提供理论依据和指导。
1材料与方法1.1 材料与试剂康地恩甘露聚糖酶；甘露聚糖（Sigma公司）；3,5—二硝基水杨酸（DNS）；甘露糖（Sigma公司）。
1.2 主要实验仪器 722型分光光度计；电子分析天平；可调恒温水浴锅；精密pH计等。
1.3 酶活力测定1.3.1酶活测定方法。
采用还原糖法（DNS）测定。
1.3.2 酶活力单位定义。
在40℃、pH4.5的条件下，每分钟从甘露聚糖（Sigma G0753）溶液中降解释放1 μg还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
1.3.3甘露糖标准曲线的绘制。
配制10mg/mL的甘露糖溶液100mL，吸取上述溶液分别配制成浓度为0.10～0.70 mg/mL的甘露糖标准溶液。
甘露聚糖酶检测方法
甘露聚糖酶活力的测定1.甘露聚糖酶活力单位定义在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖（Sigma G0753）溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。
2.测定原理甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。
具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。
反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。
3.试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。
3.1甘露糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/ml：称取无水D-甘露糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。
3.2乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。
加水溶解，定容至100ml。
3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L：称取三水乙酸钠1.36g。
加水溶解，定容至100ml。
3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L：称取氫氧化鈉20.0g。
加水溶解，定容至100ml。
3.5乙酸——乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）为0.1mol/L，pH值为5.5：称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。
再加水溶解，定容至2000ml。
测定溶液的pH值。
如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5。
3.6甘露聚糖溶液：0.6%（w/v）称取甘露聚糖（Sigma G0753）0.60g，加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.5）。
磁力搅拌，同时缓慢加热，直至甘露聚糖完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。
）。
然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.5）定容至100ml。
甘露聚糖酶的测定方法
甘露聚糖酶活性测定方法一．原理样品中的甘露聚糖酶对底物－半乳甘露聚糖进行水解，用DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）分光光度法测定水解所产生的还原糖量。
二．定义一个甘露聚糖酶活性单位（MNU）被定义为：在测定条件下，1秒钟内从甘露聚糖中产生1 nmoL相应还原糖－甘露糖所需的酶量（1 MNU=1 nkat）。
三．适用范围与安全性本方法适用于来源于木霉属（Trichoderma）的甘露聚糖酶样品的测定。
当检测其它来源的酶活时，本测定方法的直线性需要校正。
本测定方法中的DNS试剂在吸入后，接触皮肤和眼睛，或被误服后，对人体有害。
四．试剂与仪器所有试剂溶液均用去离子水配制。
1. 柠檬酸缓冲液（0.05M,pH5.3）溶解10.5 g柠檬酸（C6H8O7·H2O）于800mL水中，并用1M氢氧化钠调节pH至5.3（消耗约110mL），再用水定容至1000mL。
2. 底物－0.3%称取0.6 g刺槐豆胶（Sigma G-0753），溶于约80℃的柠檬酸缓冲液中，磁力搅拌，加热至沸腾，继续搅拌冷却至室温，加盖缓慢搅拌过夜。
将不溶的沉淀物离心（1000rpm离心10min），并用柠檬酸缓冲液定容至200mL。
将此底物溶液在-20℃下冰冻保存。
临用前，将底物溶液在沸水浴中缓慢溶解至80℃左右后使用。
3. DNS试剂溶解50.0 g3,5-二硝基水杨酸（Sigma D-0550）于4000mL水中，不断磁力搅拌，缓缓加入80.0 g氢氧化钠，使之完全溶解，再继续磁力搅拌，分数次少量加入1500 g四水合酒石酸钾钠，并小心加热，溶液最高温度不超过45℃。
冷却至室温后定容至5000mL。
如果溶液不澄清，用Wheatman 1号滤纸过滤，然后室温保存于棕色瓶中。
4．仪器恒温水浴锅50℃恒温水浴锅100℃试管旋涡磁力搅拌器分光光度计五．测定条件底物半乳甘露聚糖pH 5.3温度50℃ 0.5℃保温时间5min六．样品处理用柠檬酸缓冲液稀释被检样品。
_甘露聚糖酶产生菌的分离_鉴定及产_甘露聚糖酶最适条件的研究
enzyme ac tiv ity of 50. 37 U /m lwas obta ined a fter the enzyme activ ity assay . T he stra in was identified as P seudo m onas sp. by m orpho log ica l and physio log ica l character istics ana lysis and 16S r DNA BLAST. T he opti m a l conditions fo r producing the ac tiv ity of h ighest acid ic m annanase w as up to 185. 37 U /m , l 3. 68 ti m es as before . The stra in which rapid ly produced stra in we re deter m ined 1 g / l00 m lm a izena , 2 g /100 m l kon jak powder , pH 6 . 0 and the opti m a l temperature w as 32 mannanase activ ity after cu lturing fo r 12 h. T he study of the enzyma tic character of the
收稿日期 : 2008 12 26 基金项目 : 重庆市科技计划项目 ( 2007AC 1060 ), 重庆大学重点实验室对本科生开放创新基金 作者简介 : 黄俊丽 ( 1974 ) , 女 , 副教授 , 主要从事微生物分子学研究 ; E m ai: l huang_ jun l@ i 126 . com, Te: l 023 65120497
黑曲霉β-甘露聚糖酶的纯化和活力测定试验指导
黑曲霉β-甘露聚糖酶的纯化和活力测定实验指导（综设实验）一．实验目的及要求1、掌握黑曲霉ASP.Niger的固体发酵工艺2、掌握粗酶浸提、硫酸铵分级沉淀的原理和操作3、掌握透析原理、脱盐及透析袋的处理方法和使用4、掌握β-甘露聚糖水解各种甘露聚糖之间β-糖苷键的机制和理论5、掌握以魔芋精粉为底物DNS光度法（3,5－二硝基水杨酸法）测定发酵制品中β-甘露聚糖酶活力的操作方法二．实验原理1、微生物的β-甘露聚糖酶都是诱导酶，只有在培养基中含有β-甘露聚糖时才进行β-甘露聚糖酶的合成，产酶最适培养基除需要一定的碳氮源，还加入一定诱导物魔芋粉。
2、硫酸铵分级沉淀（盐析）原理中性盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化层逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。
3、透析原理、脱盐：酸性β-甘露聚糖酶相对分子质量为39000和40000，选择MWCO（切割分子量或截留分子量）14000的透析袋，透过掉分子量小于10000的蛋白质；并借助分子扩散脱盐。
4、DNS光度法测定还原糖：β-甘露聚糖酶能水解含β-1，4甘露糖苷键的甘露多糖（包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等），以魔芋精粉为底物主要得到含还原性端基的甘露寡糖，还原性端基与DNS试剂共热后被还原生成氨基化合物。
在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈棕（桔）红色，在520nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量，由此测定出酶的活力。
三．实验试剂和器材菌种：黑曲霉(Aspergillus niger)JXW12-1，生物工程发酵实验室保藏。
斜面培养基:马铃薯20.0%，蔗糖2.0%，琼脂 2.0%，pH自然，此培养基用于菌种保藏、斜面种子和平板分离。
二级种子培养基：250 mL三角瓶装麸皮10g，水12mL，121℃灭菌30 min；接种一菌耳斜面种子，32±1℃静置培养96h，其间翻曲2～3次。
甘露聚糖酶的酶学性质研究
酶活 力测 定
．
甘露 聚糖溶液 同
pH
．
酶样 品用 蒸馏 水 稀 释 50 倍后 再 以 不
。
1． 1 3
酶活测 定 方 法
值 的缓 冲 液 作 适 当稀 释 进 行 酶 活 测 定
，
以最高
酶 活 为 10 0 ％
范 志 恒 山 东康 地 恩 集 团 2 6 6 0 6 1 山 东青 岛
， ，
，
在 其 它 条 件 的 酶 活 占最 高 酶 活 的 百 分
5 00
．
能 与 消 化 酶 充 分 接 触 提 高 内源 酶 的 活 性 改 善 肠 道
， ，
液 电磁 振 荡 3
， ，
s
恒温 反应 30
in
。
。
加人
m
l DNS
m
微 生 物 菌群 和 提高肠 粘 膜 的完整 性 等 功 能
。
试 剂 电磁 振荡 以 终止 酶解反 应
，
沸水浴 加热
，
5
in
，
本 文 旨在 通 过 对 甘 露 聚 糖 酶 的 酶 学 性 质 研 究 掌 握有关数据 为实 际 应 用 提供 理 论 依据 和 指 导
pH
数 即 为该 酶 在 此
。
值 条件 下 的相 对 酶 活
。
1 4 2
． ．
酶反 应 的最 适 温 度
调节恒温水浴锅
，
收 稿 日 期 ：2 0 0 8 0 65
、
、
维普资讯
范志恒 ： 甘露聚糖 酶的酶 学性质研 究
、 、
入 2 00
m
l
．
蒸馏 水和
m
5 00
利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性
利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性β-甘露聚糖酶是一种重要的水解酶，广泛存在于植物、微生物和动物组织中，是一种能够水解β-甘露聚糖的酶类。
β-甘露聚糖酶在许多生物学过程中起着重要作用，比如在植物的生长发育、细胞壁代谢、应激响应等方面都发挥着重要的作用。
研究β-甘露聚糖酶的活性对于理解植物生长发育和抗逆性有着重要的意义。
刺萼龙葵（Solanum aculeatissimum Jacq.）是茄科植物中的一种，广泛分布于南美洲和亚洲热带地区，又名刺浆果茄，具有较高的经济价值和药用价值。
刺萼龙葵的种子中富含β-甘露聚糖酶，因此利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性，可以为深入研究刺萼龙葵的生物学特性提供重要依据。
本文将介绍利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶活性的方法和步骤，并对测定结果进行初步分析和讨论，旨在为该领域的研究工作提供理论和实验基础。
一、实验材料与方法1. 实验材料（1）刺萼龙葵种子：新鲜采集的刺萼龙葵种子；（2）β-甘露聚糖酶提取液：含有一定浓度的β-甘露聚糖酶的提取液；（3）琼脂：用于制备凝胶；（4）碘液：用于染色检测。
2. 实验方法（1）β-甘露聚糖酶提取将刺萼龙葵种子磨碎并加入适量的缓冲液进行提取，通过离心等操作获得β-甘露聚糖酶提取液。
（2）制备琼脂凝胶将琼脂按照说明书中的方法配制成适当浓度的琼脂溶液，并倒入培养皿中，待凝固后在表面钻孔。
（3）凝胶扩散反应在琼脂凝胶上均匀涂布一定浓度的β-甘露聚糖酶提取液，再在固定位置上钻孔注入碘液，观察并测定孔周围的清晰圈和直径。
二、实验结果与分析通过上述实验方法，我们成功利用凝胶扩散法测定了刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性。
观察结果显示，在琼脂凝胶表面形成了一定大小的清晰圈，且直径随着β-甘露聚糖酶提取液中酶活性的增加而增大。
这表明刺萼龙葵种子中存在一定浓度的β-甘露聚糖酶，并且具有一定的活性。
从实验结果可以初步推断，刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性较高，这与刺萼龙葵种子中富含β-甘露聚糖酶的特点相吻合。
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甘露聚糖酶 酶活力的检测方法
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1. 目的
建立甘露聚糖酶酶活力的测定方法，为各部门人员测定甘露聚糖酶活力提供依据。
2. 适用范围
适用于饲料添加剂的饲料酶产品，也适用于添加甘露聚糖酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料。
3. 方法原理
β-甘露聚糖酶可以将槐豆胶中的β-甘露聚糖水解成甘露糖及其它还原性碳水化合物，这些物质可以同DNS试剂发生显色反应，可用分光光度计测定其色度，计算其酶活力。
4. 定义
在55℃、PH4.8～PH5.0条件下，1min分解槐豆胶中的β-甘露聚糖产生具有还原能力相当于1μmol 甘露糖所需的酶量，规定为1个酶活单位（实为国际单位IU），以μmol /min表示。
5. 试剂和溶液
5.1 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（PH4.8-5.0）
称取醋酸钠16.06g，醋酸4.92g，用蒸馏水溶解定容至1000mL，配好后用PH计校正。
5.2 DNS试剂
取酒石酸钾钠182g，溶于500mL蒸馏水中加热，于热溶液中依次加入3.5—二硝基水杨酸6.3g，NaOH 2lg，苯酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色试剂瓶中，室温下放置15天以后使用，使用有效期一个半月。
5.3 0.5%槐豆胶溶液
用PH4.8～ PH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制, 槐豆胶为SIGMA试剂。
5.4 7 %甘露糖标准溶液
精确称取经105℃烘至恒重的甘露糖1.0000 g,用蒸馏水定容至100mL容量瓶中制成1%甘露糖标准溶液。
6. 仪器与设备
6.1 恒温水浴锅60±2℃ 6.2 紫外分光光度计UV1601 6.3 电子天平(0.001g) 6.4 漩涡混合器
7. 测定步骤
7.1 甘露糖标准曲线的绘制
分别吸取1%甘露糖标准溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 mL于50mL容量瓶中，用蒸馏水制成每mL 分别含甘露糖200，400，600，800，1000，1200μg的标准液。
各取不同浓度标准液0.5mL于试管中，加2mL Ph4.8-5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液,加2.5 mL DNS试剂煮沸5分钟。
冷后加水5 ml，摇匀，520nm 处测定光密度，以0.5 mL水代替标准液来作空白。
以所得的光密度值为横坐标，以对应的标准甘露糖
批准 日期
审核
日期
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日期
生效日期：
生效日期：。