微生物实验(6)
医学检验—微生物基础(六)
医学检验—微生物基础（六）培养基一、分类1.营养琼脂：标本及各类细菌的增菌培养。
【基础培养基】2.血平板：各类细菌检验标本的分离。
【营养培养基】3.巧克力平板：疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。
【营养培养基】4.中国蓝平板或伊红亚甲蓝平板：筛选革兰阴性细菌；鉴别发酵型革兰阴性杆菌菌种。
【弱选择培养基】5.麦康凯平板：筛选革兰阴性杆菌和非发酵菌。
【弱选择培养基】6.SS琼脂：筛选肠道致病菌，如志贺菌和沙门菌。
【强选择培养基】煌绿可以抑制大肠埃希菌7.碱性琼脂或TCBS琼脂：从粪便中分离霍乱弧菌及其他弧菌。
8. 真菌培养基：沙保弱培养基二、血琼脂上的溶血1.α溶血：又叫草绿色溶血，菌落周围血培养基变为绿色环状。
2.β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的环。
3.γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化；红细胞没有溶解或无缺损。
4.双环：双层溶血环，内层为β溶血，外层为α溶血。
如产气荚膜梭菌。
三、气味1.铜绿假单胞菌（生姜气味）2.变形杆菌（巧克力烧焦气味）3.厌氧梭菌（腐败的恶臭味）4.放线菌（泥土味）等。
四、细菌在液体培养基中的生长现象1.浑浊生长：大多数细菌。
2.沉淀生长：少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌。
3.菌膜生长（表面生长）：专性需氧菌如枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌。
五、细菌在半固体培养基中的生长现象1.有鞭毛在穿刺线的两侧均可见羽毛状或云雾状浑浊生长，为动力阳性。
2.无鞭毛的细菌只沿穿刺线呈明显的线状生长，为动力试验阴性。
六、细菌非培养检测方法1.细菌毒素检测内毒素：鲎试验常见于革兰阴性菌感染外毒素：体内及体外毒力实验常见于革兰阳性菌及部分阴性菌。
2.实验动物①无菌动物：就是指不能检出任何活的微生物和寄生虫的动物。
②悉生动物：给无菌动物引入5-17种正常肠道菌群培育而成的动物③无特殊病原动物:无特定的微生物或寄生虫的动物④清洁动物：不带有人畜共患病原或烈性传染病病原及常见传染病病原的动物⑤常规动物：在自然环境中饲养的带菌动物七、细菌的自动化检测1.自动血培养检测系统基本原理：检测细菌和真菌生长时所释放的二氧化碳（C02）来作为血液中有无微生物存在的指标。
实验6 微生物液体深层培养—发酵罐的使用
实验用品】 【实验用品】
1.材料:玉米粉,豆饼粉 1.材料:玉米粉, 材料 2.试剂: 2.试剂:K2HPO43H2O,MgSO47H20,红曲霉液体菌种 试剂 3H 7H 3.仪器: 3.仪器:小型通风发酵罐 仪器
College of Life Sciences, Hubei Normal University
Central Laboratory of Biology
方法步骤】 【方法步骤】
2. 空气过滤及空气管路的消毒 1)慢慢打开蒸汽阀门,排尽冷凝水. 慢慢打开蒸汽阀门,排尽冷凝水. 2)蒸汽通过空气过滤器进入发酵罐内. 蒸汽通过空气过滤器进入发酵罐内. 3)消毒时间一般为30分钟. 消毒时间一般为30分钟. 30分钟 4)吹干空气过滤器需20分钟左右. 吹干空气过滤器需20分钟左右. 20分钟左右 3. 空消 1)排尽夹套中的水. 排尽夹套中的水. 2)排尽蒸汽管中冷凝水,使蒸汽徐徐进入发酵罐. 排尽蒸汽管中冷凝水,使蒸汽徐徐进入发酵罐. 分钟. 3)空消时间一般为30～50分钟.排尽发酵罐内的冷凝水. 空消时间一般为30 50分钟 排尽发酵罐内的冷凝水.
方法步骤】 【方法步骤】
1. 准备工作 1)培养基的配制:玉米粉5%,豆饼粉2%,K2HPO43H2O 0.5%, 培养基的配制:玉米粉5%,豆饼粉2%, 5% 2% 3H 0.5%, MgSO47H20 0.1%,pH自然. 7H 0.1%,pH自然. 自然 2)检查本系统各单件设备,确保各设备能正常运行时方可开机. 检查本系统各单件设备,确保各设备能正常运行时方可开机. 3)温度,pH,转速,消泡设定值的调节 温度,pH,转速,
工业微生物 实验6 化学药剂对微生物生长的影响
实验六化学药剂对微生物生长的影响一、实验目的1、了解化学药剂的杀菌和消毒作用。
2、掌握常用消毒剂的浓度和使用方法。
二、基本原理一些化学药剂对微生物的生长有抑制或杀死作用。
因此，在实验室内和生产上常利用某些化学药剂进行杀菌或消毒。
不同的药剂或同一药剂对不同微生物的杀菌能力不同。
此外，药剂浓度、作用时间及环境条件不同，其效果也不一样。
使用前需进行试验，灵活选择。
三、器材1、菌种：培养24～48h的大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。
2、培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，75%酒精，新洁而灭，50%来苏儿，3、仪器与其他用具：恒温培养箱，无菌平皿，无菌水，无菌吸管(1mL)，镊子，直径0.6cm的无菌圆形滤纸片。
四、实验方法1.制平板：取无菌平皿三套，将已熔化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按无菌操作法倒入平皿中，使冷凝成平板。
2.制备菌悬液：取无菌水3支，用接种环分别取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌1～2环接入无菌水中，充分混匀，制成菌悬液。
3.接种：用无菌吸管分别吸取已制好的菌悬液0.1mL接种于平板上，用无菌玻璃涂布棒涂匀。
注意做好标记。
4.浸药：将灭菌滤纸片分别浸入四种供试药剂中。
5.加药剂：用无菌镊子夹取浸药滤纸片(注意把药液沥干)，分别平铺于同一含菌平板上，注意药剂之间勿互相沾染。
并在平皿背面做好标记。
6.培养：将平皿置于28℃下培养48～72h后观察结果。
五、实验结果取出培养平皿，观察滤纸片周围有无抑菌圈产生，并测量抑菌圈的大小，将测量结果填入表中。
不同化学药剂对细菌的抑制效果（抑菌圈直径cm）化学药剂抑菌圈直径（cm）大肠杆菌金黄色葡萄球菌75%酒精新洁而灭50%来苏儿链霉素空白对照思考：哪种化学药剂对微生物的生长影响较大。
微生物实验@实验6 霉菌的形态观察
手术刀取菌丝，在50%乙醇中浸泡一下，然 后置于染液中，用手术刀和回形针小心将菌 丝分开，去掉培养基，盖上盖玻片，用低倍 镜和高倍镜镜检。
透明胶带法
载玻片培养观察法
搭片法培养霉菌
霉菌的有些结构在制片过程中易被破坏，影响
观察，可采用载片培养法。此法便于直接在显 微镜下观察，尤其适用于根霉的假根、曲霉的 足细胞及分生孢子链等结构的着生和生长情况 的观察。并且还可以在同一标本上观察到微生 物发育的不同阶段的形态。
观察黑根霉
菌丝情况和 子囊孢子情 况（着重辨 认孢子囊、 包囊梗、假 根）：
观察黑曲霉菌丝
分隔情况和分生 孢子着生情况 （着重辨认分生 孢子梗、足细胞 和分生孢子）：
观察青霉菌
丝和分生孢 子着生情况：
1.单轮生青霉群；2.对称二轮 生青霉群；3.多轮生青霉群； 4.不对称生青霉群
五、实验结果
实验三
霉菌的形态观察
一、实； 了解常见霉菌（根霉、毛霉、曲霉、青 霉）的基本形态特征；
学习掌握霉菌染色的基本方法。
二、实验原理
霉菌菌丝比较粗大（菌丝和孢子的直径达到
3~10μm），通常是细菌菌体宽度的几倍至 几十倍，因而可用低倍、高倍镜观察。霉菌 菌丝细胞容易收缩变形，孢子容易飞扬，在 制备霉菌标本时，常用乳酸石炭酸溶液作为 介质，具有不使细胞变形，可杀菌防腐，不 易干燥，能保持较长时间等优点。若加入棉 蓝，又具有一定的染色效果。
六、问题与讨论
1.为何要用乳酸石炭酸棉兰染液对 霉菌进行染色?
三、实验材料
• 菌种：根霉（Rhizopus sp.）、毛霉（Mucor sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）、青霉 （Penicillium sp.）的平板培养物，
实验六 微生物细胞大小的测定
实验六微生物细胞大小的测定一、目的要求1.学会测微尺的使用和计算方法。
2.掌握酵母菌细胞大小测定的方法。
二、基本原理微生物细胞大小, 是微生物的形态特征之一,也是分类鉴定的依据之一。
由于菌体很小, 只能在显微镜下测量。
用来测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片。
一般将1mm等分为100格（或2mm等分为200格）,每格长度等于0．01mm（即106μm）。
是专用于校正目镜测微尺每格长度的。
目镜测微尺是一块可放在接目镜内的隔板上的圆形小玻片, 其中央刻有精确的刻度, 有等分50小格或100小格两种, 每5小格间有一长线相隔。
由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同, 目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同, 因此,目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小, 在使用前必须用镜台测微尺进行校正, 以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值, 然后才可用来测量微生物的大小。
三、器材枯草芽孢杆菌染色玻片标本, 目镜测微尺, 镜台测微尺, 显微镜, 擦镜纸, 香柏油等。
四、操作步骤1. 目镜测微尺的标定(1)放置目镜测微尺取出接目镜, 旋开接目镜透镜, 将目镜测微尺的刻度朝下放在接目镜筒内的隔板上（图Ⅳ-4, B）, 然后旋上接目透镜, 最后将此接目镜插入镜筒内（图Ⅳ-4, C）。
(2)放置镜台测微尺将镜台测微尺置于显微镜的载物台上, 使刻度面朝上。
(3)校正目镜测微尺先用低倍镜观察, 对准焦距, 当看清镜台测微尺后, 转动接目镜, 使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行, 移动推动器, 使目镜测微尺和镜台测微尺的某一区间的两对刻度线完全重合, 然后计数出两对重合线之间各自所占的格数（图Ⅳ-6）。
根据计数得到的目镜测微尺和镜台测微尺重合线之间各自所占的格数, 通过如下公式换算出目镜测微尺每小格所代表的实际长度。
目镜测微尺每小格长度（μm）=同法校正在高倍镜和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。
实验六 环境因素对微生物的影响和紫外诱变效应
环境因素对微生物的影响和紫外诱变效应生05 边晔 2010030026周四班同组成员：徐竞实验时间 2012年11月22日一、实验目的1.了解物理因素、化学因素及生物因素抑制或杀死微生物的作用及其试验方法。
2.了解紫外线诱变原理，并初步掌握紫外线诱变育种的方法。
3.练习单菌落划线分离微生物。
二、实验原理在自然界中，微生物分布极其广泛，几乎无处不在，微生物的生长发育受着环境因素的影响。
而不同的微生物及微生物不同的生理状态受环境因素影响的程度也不同，有的环境因素是微生物生长繁殖所必需的条件，有的表现为抑制作用，有的表现为杀菌作用。
温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞结构来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。
微生物群体生长、繁殖最快的温度为其最适生长温度，但它并不等于积累某一代谢产物的最适温度。
粘质沙雷氏菌能产生红色或紫红色色素，菌落表面颜色随着色素量的增加呈现出由橙黄到深红色逐渐加深的变化趋势。
常用的化学消毒剂主要包括重金属及其盐类、有机溶剂(酚、醇、醛等)、卤族元素及其化合物和表面活性剂等。
根据是杀死还是抑制微生物，可分为致死剂和抑制剂。
常用的3个指标：最低抑制浓度（MIC）、半致死剂量和最低致死剂量。
许多微生物在其生命活动过程中能产生某种特殊代谢产物如抗生素，具有选择性地抑制或杀死其他微生物的作用。
不同抗生素的抗菌谱是不同的，某些抗生素只对少数细菌有抗菌作用。
产黄青霉分泌青霉素抑制细菌细胞壁的合成。
青霉素主要抗G＋细菌。
链霉素作用于核糖核酸30S亚基，所以链霉素只作用原核生物。
链霉素以抗G－细菌为主。
紫外线具有杀菌作用主要是因为它诱导形成胸腺嘧啶二聚体来破坏DNA的结构，使其不能正常行使功能。
另外，空气在紫外线照射下产生臭氧(O3)，也有一定杀菌作用。
紫外线杀菌力最强的波长是226-256nm部分。
紫外线透过物质能力很差，所以只适用于空气及物体表面的灭菌，它距离照射物以不超过1.2米为宜。
实验6细菌菌落特征观察
特征描述：形状、大小、颜色、光泽、表面状 况、边缘、隆起度、透光性、质地以及是否分 泌色素等等
形状 大小 （直径 mm） 边缘
表面
颜色 干/湿 透明度
其它 培养基 培养温度 培养时间
几种细菌菌落特征的比较
大肠杆菌 圆/点
枯草杆菌 不规则
金黄色 葡萄球菌
圆形
霉状杆菌 根状
1--2
4--6
2--3
鱼腥蓝菌属 念珠蓝菌属
简孢蓝菌属 眉蓝菌属
颤蓝菌属 林氏蓝菌属
费氏蓝菌属
二、实验方法
用吸管取一小滴菌液至一张干净载 玻片，加盖玻片，注意避免产生气泡， 低倍镜观察，绘图。
实验8 放线菌形态及其菌落特征的观察
一、实验目的： 学习观察记录放线菌培养特征的方法。 用插片法观察放线菌菌丝。
二、实验原理
三、实验材料
灰色链霉菌菌落及其插片
四、方法
1. 放线菌菌丝的观察 从放线菌菌苔平板上取插片，置于载玻
片上，低倍镜、高倍镜观察，绘图。 2. 放线菌菌落特征的观察 观察放线菌菌落特征，记载：大小、形
状、边缘、表面、颜色（正、反面）、 气味、干湿等特征。
五、实验报告
P 5-7 下次实验；9-10
微生物学实验6 细菌染色法
南京大学生物技术系实验报告题目细菌染色法姓名年04 月12 日【一、实验目的】1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的染色法。
2、初步认识细菌的形态特征。
3、巩固显微镜(油镜)的使用方法和无菌操作技术。
【二、实验原理】1、革兰氏染色是广泛使用的细菌鉴别染色法，可将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖层厚，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小、孔径降低、结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈紫色。
革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解、细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细胞被脱色，再经番红复染后细胞呈红色。
2、芽孢具有不易渗透的厚壁，着色及脱色均较困难，因此在做芽孢染色时先用着色力强的染料使芽孢与菌体都染上颜色，再用脱色液将菌体脱色，并用不同颜色的复染液复染，使芽孢与菌体染成不同的颜色。
3、在某些细菌细胞壁外形成一层较厚且固定的黏性物质称为荚膜(荚膜的厚薄，可因环境的不同而改变)。
荚膜与染料亲和力低，所以观察荚膜时，常使菌体与背景着色，把无色的荚膜衬托出来。
4、苏云金芽孢杆菌的晶体是特殊的细胞内含物，晶体的存在与否，是作为苏云金芽孢杆菌类生物的检验项目之一。
利用区别染色，可以达到区别晶体、芽孢和菌体细胞三者的目的。
【三、实验材料、主要仪器和试剂】1、材料：枯草芽孢杆菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E. coli)、苏云金芽孢杆菌2、试剂：蒸馏水、草酸铵结晶紫染液、鲁古氏碘液、95%乙醇、0.5%蕃红水溶液、5%孔雀绿水溶液、黑墨素液、甲醇、苏丹黑、二甲苯3、仪器：接种环(×1)、酒精灯(×1)、载玻片(×5)、光学显微镜(×1)【四、操作步骤】1、革兰氏染色：涂片→固定→结晶紫→水洗→碘液→水洗→95%酒精→水洗→蕃红→水洗→干燥→镜检2、芽孢染色：涂片→固定→孔雀绿染色5min→水洗→蕃红→水洗→干燥→镜检3、荚膜染色法(选做)：涂片→干燥→石炭酸复红→水红→吸干→黑墨素→镜检4、伴胞晶体染色(选做)：涂片→固定→10%石炭酸复红→水洗→风干→镜检5、类脂染色(选做)：涂片→固定→苏丹黑染色10min→水洗→吸干→二甲苯冲洗→蕃红→水洗→晾干→镜检6、清理器皿、实验桌面。
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河南大学医学院 娄强
qiang_lou@
目的要求
• 掌握肠道杆菌的主要生物学性状
• 熟悉肠道杆菌有关的鉴定方法
脓血便、肛拭子 标本 SS平板,中国兰,EMB平板 选择/鉴别培基
克氏双糖铁培养基, 动力-靛基质-尿素 半固体琼脂培养基
血清学鉴定
生化反应
玻片凝 集试验
（一）肠道杆菌的形态、染色 及在选择培养基上的生长情况
• 3. 方法
弃去
TO
TH PA PB
1
2
3
4
5
6
7
1.倍比稀释血清 0.5mlNS+0.5ml 血清 2.加四种菌液 （顺序：从后往 前） 3. 37℃18-24h 观察结果
• 效价判断：以出现++的血清最高稀释度为抗体效价。 • 肥达氏反应诊断意义:
O效价
升高 不高 不高 升高
H效价
升高 不高 升高 不高
SS或EMB培养基生长现象观察
EMB菌落的 形态特征 大肠杆菌
SS菌落的 形态特征
痢疾杆菌
（二）肠道杆菌生化反应及动力试验
• [材料] • 1、菌种：大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、 培养物 • 2、培养基：克氏双糖斜面培养基、生化反 应管、半固体培养基 • 3、其他：接种环、接种针、酒精灯等。
克氏双糖斜面培养基生化反应原理
[方法]
• 1、分离培养、观察菌落特征：分别取大肠、 痢疾杆菌培养物，用分离划线方法接种SS 平板或EMB培养基37℃培养18-24h以后观察 结果（记录）。
• 2、革兰染色、观察形态学特征：取各菌培 养物少许涂片，革兰染色、镜检（画图）。
(1) SS平板
• (2) EMB 平板
大肠杆菌
致病菌
• 此培养基是强选择性培养基，柠檬酸钠和煌绿对大肠杆菌 的生长，对菌体蛋白质的合成起强的抑制作用，而对肠道 致病菌则无抑制作用。柠檬酸钠能缓和胆酸盐对肠道致病 菌的有害作用，并能中和煌绿和中性红等染料的毒性。中 性红为指示剂，酸性时呈现红色，碱性时呈淡黄色。 大肠杆菌分解乳糖产酸，通过中性红显色，菌落大而混浊， 呈现红色． • 志贺氏菌属和沙门氏菌属的细菌不分解乳糖，而分解蛋白 质产生碱性物质，菌落形态为光滑微黄透明，园形、中等 大小，边缘整齐的菌落。 • 由于宋内氏痢疾杆菌有分解胆盐中的某些物质和发酵乳糖 (产酸)较慢等特点，而使菌落呈淡红或红色、较大或边缘 不整齐的扁平菌落。某些沙门氏菌属及变形杆菌因 产生硫 化氢，使菌落呈现黑色中心。
诊断意义
感染可能性大 感染可能性小 预防接种或回忆反应 早期反应或交叉反应
• • • • [材料] 菌种：大肠杆菌、痢疾杆菌培养物 培养基：SS平板、EMB 标本片：大肠杆菌、痢疾杆菌
SS琼脂平板
（1）营养物质：牛肉膏、蛋白胨 （2）抑制剂：胆盐、枸椽酸盐、煌绿等，抑 制非致病菌的生长；但胆盐能同时促进病 原菌的生长。 （3）鉴别用糖：乳糖 （4）指示剂：中性红
SS琼脂培养基选择培养原理
结果观察
克氏双糖铁
生化反应管
乳糖
葡萄糖 硫化氢 黄 色 黄 色 黄 色 黄 色
尿素
葡萄糖
乳糖
动 力
大肠杆菌 伤寒杆菌 痢疾杆菌 变形杆菌
黄 色 红 色 红 色 黄 色
-
-
+ + + +
+ -
+ + +
+ +
+
肥达氏反应
• 原理 用已知伤寒杆菌O/H抗原（TO/TH）和 甲乙型副伤寒杆菌H抗原（PA/PB）与患者 血清做定量凝集实验，以测定患者血清中 有无相应抗体，根据抗体含量多少及增长 情况可辅助诊断伤寒及副伤寒。 • 2.材料 待检患者血清，TO/TH/PA/PB菌液， 生理盐水，试管，1ml吸管等。
该培养基含葡萄糖与乳糖的比例为1:10，并含硫酸亚铁和指 示剂酚红。 • 大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，所以培养基呈黄色， 直立段有气泡存在． • 肠道病原菌不能发酵乳糖，只能发酵葡萄糖，分解葡萄糖 产酸，使PH下降，斜面部分先呈现黄色，由于葡萄糖含量 少，所生之酸接触空气而氧化，又因细菌的生长利用含氮 物质生成碱性化合物，所以斜面部分后来又变成红色．由 于直立段(底层)呈厌氧状态，细菌发酵葡萄糖所生的酸不 被氧化，所以一直呈黄色。大肠杆菌产气，有动力(沿穿 刺线向周围扩散生长)伤寒杆菌有动力，而痢疾杆菌则没 有动力． • 某些细菌如变形杆菌，乙型副伤寒杆菌能分解培养基中含 硫氨基酸（如胱氨酸）产生硫化氢、硫化氢与硫酸亚铁中 的亚铁离子结合形成黑色的硫化铁，而痢疾杆菌不产生硫 化铁．
伊红美兰琼脂培养基(EMB)选择培养原理
• 此培养基为弱选择性培养基。以伊红美兰作指示 剂． • （１）大肠杆菌分解乳糖产酸时染上伊红，因为 伊红和美兰结合所以菌落不是红色而呈现紫黑色， 且有金属光泽(大肠杆菌)或棕色(产气杆菌)，扁 平混浊、边缘色淡的菌落。 • （２）致病菌的菌落为无色半透明、园形，中等 大小，边缘整齐的菌落，在靠近大肠杆菌的可疑 菌落往往呈现淡兰色。
[方法]
• 1、克氏双糖铁斜面培养基：分别取大肠杆菌、变形杆菌 的培养物，用穿刺加斜面划线接种方法接种于2支克氏双 糖斜面培养基，37℃培养18-24h以后观察结果。
• 2、生化反应管：取葡萄糖、乳糖等反应管，每种反应管 分别穿刺接种大肠杆菌、痢疾杆菌，37℃培养18-24h以后 观察结果。
• 3、动力试验：分别取大肠杆菌、痢疾杆菌的培养物，用 穿刺接种方法接种于2支半固体培养培养基，37℃培养1824h以后观察结果。