实验五叶绿体的分离及离体叶绿体的还原活性
实验五叶绿体的分离与观察
实验五叶绿体的分离与观察引言：叶绿体是植物和一些藻类细胞中的一种重要细胞器，其内含有叶绿素，参与光合作用，并且能够进行自我复制。
叶绿体的分离与观察可以帮助我们更好地理解叶绿体的结构和功能。
本实验旨在通过破碎叶绿体细胞壁和最后沉淀纯化，获得高纯度的叶绿体样品，并观察其形态和颜色。
材料与方法：1.植物叶片（如菠菜等）2.磨砂棒3.0.5MEDTA（乙二胺四乙酸二钠，含有金属离子螯合剂，可帮助破环细胞壁）4.磷酸盐缓冲液（PH=7.2）5.叶绿体离心管6.离心机7.色谱柱8.吲哚素（荧光指示剂）9.显微镜实验步骤：1.将大约10g的菠菜叶片放入研钵中，加入足够的磷酸盐缓冲液，用磨砂棒研磨，直至叶片完全破碎。
2.将研磨的混合物过筛，将过筛的悬浊液取出置于离心管中。
3.加入适量的0.5MEDTA溶液，溶液中EDTA的浓度约为0.3M，为了破坏细胞壁脱落细胞质中的叶绿体。
4. 将离心管放入离心机中，离心10分钟，以3000 rpm离心速度。
5.将上清液倒入新的离心管中。
6. 用磷酸盐缓冲液把上出来的树珪胶稀释为1 ml，用来测定叶绿素a含量，以叶绿素a含量/体积的值判断叶绿体的提纯程度。
7. 用离心机再一下离心10分钟，以5000 rpm离心速度，取出离心管，倒出上清液。
8.取少量草绿后的混合悬浊液加入色谱柱中，过滤，用于进行吲哚素荧光指示剂的观察和检测。
结果与讨论：通过实验操作，我们成功将叶绿体从菠菜叶片中分离出来，并获得了纯化程度较高的叶绿体样品。
在观察纯化后的叶绿体样品时，我们可以看到其呈现出绿色或草绿色。
这是因为叶绿体内含有大量的叶绿素，而叶绿素能够吸收光线中的蓝光和红光，反射绿光，因此使得叶绿体呈现出绿色。
此外，利用吲哚素荧光指示剂对叶绿体样品进行观察和检测，可以进一步确认我们所提取的物质是否为叶绿体。
吲哚素是一种常用的荧光指示剂，当其与叶绿体内的一些化合物结合时，会发出绿色荧光。
因此，如果我们在观察过程中观察到绿色荧光的出现，就可以确认叶绿体的存在。
如何分离叶绿体和测定叶绿体的活力
如何分离叶绿体和测定叶绿体的活力？叶绿体活力的测定生物学实验能力考查的主要形式是操作考试和纸笔测试。
在纸笔测试中，以真实的实验情境为素材考查实验能力，是高中生物学学业成就测量的有效途径，试题具有一定的思维能力。
试题的来源有学生实验、教材演示实验、教材经典实验等，另外，也有相当一部分试题是来自于大学教材的学生实验。
高校教材的学生实验科学性强、操作规范，是良好的试题素材。
2019年6月学考的一道非选择题，选用了“利用希尔反应测定叶绿体活性”的实验素材，考查了对实验方案的理解能力，特别是对实验原理的理解和对实验变量的控制。
涉及的主要知识条目是光合作用过程和渗透作用。
试题：（2019年6月浙江学考题）希尔反应是测定叶绿体活力的常用方法。
希尔反应基本原理：光照下，叶绿体释放02，同时氧化型D C I P （2，6一二氯酚靛酚）被还原，颜色由蓝色变成无色。
D C l P颜色变化引起的吸光率变化可反映叶绿体活力。
研究小组利用菠菜叶进行了叶绿体活力的测定实验。
回答下列问题：（1）制备叶绿体悬液：选取10g新鲜的菠莱叶加入研钵，研磨前加入适量的0.35m o l/L N a C l溶液和p H7.8的酸碱缓冲液等；研磨成匀浆后，用纱布过滤，取滤液进行，分离得到叶绿体；将叶绿体置于溶液中，以保证叶绿体的正常形态，获得叶绿体悬液。
（2）测定叶绿体活力：分组如下，并按下表加入试剂；测定各组吸光率。
注：“－”表示不处理或不加入。
①希尔反应模拟了光合作用中阶段的部分变化，该阶段在叶绿体的中进行。
氧化型D C I P在希尔反应中的作用，相当于在该阶段中的作用。
②煮沸处理后，需向2号试管中加入一定量的，以保证各试管中液体的量相等。
③3号试管的作用是。
参考答案：（1）离心0.35m o l/L的N a C l（或等渗）（2）①光反应类囊体膜N A D P+②蒸馏水③测定该浓度叶绿体悬液自身的吸光率作为对照解析：（1）制备叶绿体悬液时，先选取10g新鲜的菠菜叶加入研钵，研磨前加入适量的0.35m o l/L N a C l溶液（维持叶绿体形态）和p H7.8的酸碱缓冲液（维持一定的p H）等；研磨成匀浆后，用纱布过滤，取滤液进行离心，分离得到叶绿体；将叶绿体置于0.35m o l/L N a C l（或等渗）溶液中，以保证叶绿体的正常形态，获得叶绿体悬液。
叶绿体色素的提取分离及理化性质检测实验报告
实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质系别：机械工程系班级：机械11实验者：潘霖学号：2011010389同组姓名：肖鹤翀实验日期：2011.10.22Ⅰ提取与分离一、实验目的：1.学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。
2.了解叶绿素的组成、性质和测定叶绿素有助于理解光合作用的本质。
二、实验原理:叶绿体是进行光合作用的细胞器。
叶绿体中的叶绿素a，叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。
这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。
提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。
薄层层析色谱法是将吸附剂均匀地涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。
由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。
植物活性成分的分离常用薄层层析法和柱层析法，其中柱层析适用于大量制备。
本实验采用薄层层析色谱法，其中固定相用硅胶预制板。
三、实验材料与试剂:1.新鲜的菠菜叶片。
2.体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7:5:1，体积比）。
3.研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸。
四、实验步骤:（一）色素提取液的制备1.取新鲜叶片4~5片，洗净，擦干叶表面，去除中脉剪碎，放入研钵中。
2.向研钵中加入少量CaCO3粉末，再加2~3ml体积分数为95%的乙醇，充分研磨至糊状，再加10~15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤出，残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。
提取液应避光保存，因提取量较大，可用于其他相关实验（如后面的叶绿素理化性质的验证）。
（二）叶绿体色素的分离1.取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，保证划线细直。
叶绿体色素的提取分离和理化性质实验报告
叶绿体色素的提取分离和理化性质实验报告生物学导论实验报告叶绿体色素的提取分离和理化性质一、提取与分离1、实验目的学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。
2、实验原理提取：叶绿体色素为有机酯类化合物，根据相似相容原理，常用有机溶剂提取。
如酒精、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等。
分离：薄层层析法是将吸附剂均匀的涂抹在玻璃板上形成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待测分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。
流动相通过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组成分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱吸附、再吸附……的过程。
由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附能力强的物质相对移动慢一些，儿媳妇能力弱的物质相对移动快一些，从而使各组分有不同移动速度而彼此分开。
3、实验材料与试剂（1）新鲜的菠菜叶；（2）体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末、展开剂（3）钵体、漏斗、三角瓶、剪刀、点样本、毛细管、层析缸、硅胶预制板、滤纸。
4、实验步骤（1）色素提取液的制备取叶4~5片新鲜叶片，洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入钵体中。
加入少量碳酸钙，加2~3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加入10ml乙醇，上清液过滤，残渣再用10ml乙醇冲洗过滤。
（2）叶绿体色素的分离取硅胶预制板一个，用点样毛细管取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，风干，重复操作3~4次；在干燥的层析缸中加入适量展开剂，高度0.5cm，将硅胶预制板带有色素一端放入，使其下端浸入展开剂中；当色素较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板的上端边缘时，取出，画线。
Rf=斑点中心到原点距离/溶剂前沿到原点距离5、实验结果与分析从上至下为胡萝卜素（橙色）：Rf=6.95/7.35=0.946叶绿素a（蓝绿色）：Rf=5.35/7.35=0.728叶绿素b（黄绿色）：Rf=4.95/7.35=0.673叶黄素（黄色）：Rf=4.10/7.350.558可知，胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素极性依次增大，与硅胶吸附能力依次增强。
分离叶绿体的实验报告
分离叶绿体的实验报告分离叶绿体的实验报告引言：叶绿体是植物细胞中重要的细胞器，它在光合作用中起着至关重要的作用。
为了更好地了解叶绿体的结构和功能，我们进行了一系列分离叶绿体的实验。
本实验报告将详细介绍实验的步骤、结果和讨论。
材料与方法：1. 实验材料：新鲜的绿叶组织、离心管、细胞裂解液、冷冻离心机、显微镜等。
2. 实验步骤：a. 将新鲜的绿叶组织用细胞裂解液均匀悬浮。
b. 将悬浮液放入离心管中，以适当的速度离心。
c. 将上清液转移到新的离心管中，离心。
d. 重复上述步骤，直到上清液透明无色。
e. 最后一次离心后，将上清液中的叶绿体沉淀用显微镜观察。
结果与讨论：经过一系列离心步骤，我们成功地分离出了叶绿体。
观察下来，我们发现叶绿体呈现出绿色的颗粒状结构，大小约为2-5微米。
这与已有的叶绿体结构描述相符合。
叶绿体的分离过程中，我们注意到一些关键的因素。
首先，细胞裂解液的浓度和pH值对分离结果有重要影响。
过高或过低的浓度可能导致叶绿体的破坏或无法完全分离。
适当调整细胞裂解液的浓度和pH值，可以提高叶绿体的纯度和分离效果。
其次，离心的速度和时间也对实验结果产生影响。
过高的离心速度可能使叶绿体沉淀不完全，而过低的速度则可能导致杂质的混入。
适当调整离心的参数，可以获得高纯度的叶绿体沉淀。
通过显微镜观察，我们进一步研究了分离得到的叶绿体的结构。
我们发现叶绿体内部存在着复杂的膜系统，包括内膜和外膜。
内膜上布满了许多著名的脊状结构，称为类囊体。
类囊体是光合作用的主要场所，其中的叶绿素分子能够吸收光能并转化为化学能。
另外，我们还观察到叶绿体内部存在着一种独特的糖体结构，称为油滴。
油滴是叶绿体中储存脂类物质的地方，这些脂类物质在光合作用过程中起到重要的能量储存和传递作用。
总结：通过本次实验，我们成功地分离出了叶绿体，并对其结构和功能进行了初步的观察和研究。
叶绿体作为植物细胞中的重要细胞器，在光合作用中起着至关重要的作用。
叶绿体分离的实验报告
一、实验目的1. 了解叶绿体的基本结构和功能。
2. 掌握叶绿体分离的方法和原理。
3. 通过实验观察叶绿体的形态和大小，分析其生理活性。
二、实验原理叶绿体是植物细胞中进行光合作用的重要细胞器，其主要功能是吸收光能，将光能转化为化学能，并储存于有机物中。
叶绿体呈椭球形或球形，具有双层膜结构，内部含有类囊体和基质。
本实验采用差速离心法分离叶绿体，通过调整离心速度和离心时间，使不同大小的叶绿体分别沉淀下来。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜菠菜叶片2. 仪器：高速离心机、研钵、移液器、显微镜、载玻片、盖玻片、滤纸、吸水纸、蒸馏水、无水乙醇、丙酮、碳酸钙、碘液四、实验步骤1. 叶绿体提取（1）取新鲜菠菜叶片，用蒸馏水洗净，晾干。
（2）将叶片剪碎，放入研钵中，加入少量碳酸钙粉末和适量蒸馏水。
（3）研磨叶片，直至叶片完全破碎。
（4）用纱布过滤提取液，收集滤液。
2. 叶绿体分离（1）将滤液转移至离心管中，用无水乙醇和丙酮混合液（体积比1:1）调整滤液pH值至7.0。
（2）将离心管置于高速离心机中，以3000r/min离心10分钟，收集上清液。
（3）将上清液转移至另一离心管中，以5000r/min离心15分钟，收集沉淀。
（4）将沉淀用少量蒸馏水重悬，再次以5000r/min离心15分钟，收集沉淀。
3. 叶绿体观察（1）将收集到的叶绿体沉淀用载玻片覆盖，滴加碘液，轻轻压平。
（2）用显微镜观察叶绿体的形态和大小。
五、实验结果与分析1. 叶绿体形态和大小通过显微镜观察，发现分离得到的叶绿体呈椭球形或球形，大小不一，直径约2-5微米。
2. 叶绿体生理活性通过观察叶绿体在碘液中的颜色变化，发现叶绿体呈绿色，说明其具有光合作用的相关生理活性。
六、实验讨论1. 本实验中，叶绿体分离过程中可能会受到细胞碎片和杂质的影响，影响实验结果的准确性。
因此，在实验过程中应尽量减少细胞碎片和杂质的产生。
2. 叶绿体分离过程中，离心速度和离心时间的选择对实验结果有一定影响。
叶绿素的提取和分离实验报告
陕西师范大学远程教育学院生物学实验报告报告题目叶绿素的提取和分离姓名刘伟学号专业生物科学批次/层次指导教师学习中心叶绿素的提取和分离一、实验目的1. 学习叶绿体色素的提取、分离方法。
2. 通过叶绿体色素提取、分离方法的学习了解叶绿体色素的相关理化性质。
3. 为进一步研究各叶绿体色素性质、功能等奠定基础。
二、原理叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。
它们与类囊体膜蛋白相结合成为色素蛋白复合体。
它们的化学结构不同，所以它们的物化性质（如极性、吸收光谱）和在光合作用中的地位和作用也不一样。
这两类色素是酯类化合物，都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙醇等有机溶剂提取。
提取液可用色谱分析的原理加以分离。
因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
三、材料、仪器设备和试剂1. 绿色植物如菠菜等的叶片。
2. 研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、滴管、康维皿、圆形滤纸（直径11cm）。
3. 试剂：95%乙醇，石英砂，碳酸钙粉，推动剂:按石油醚:丙酮:苯=10:2:1比例配制（v/v）四、试验步骤1. 叶绿体色素的提取（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4-5片（4g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。
（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2-3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml95%乙醇，然后以漏斗过滤之，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。
2. 叶绿体色素的分离(1)将11cm的滤纸的一端剪去二侧，中间留一长约1.5cm、宽约0.5cm窄条。
(2)用毛细管取叶绿体色素浓溶液点于窄条上端，用电吹风吹干，如一次点样量不足可反复在色点处点样数次，使色点上有较多的叶绿体色素。
(3)在大试管中加入四氯化碳3-5ml及少许无水硫酸钠。
叶绿体色素的提取实验报告
叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定生命科学学院09生科基朱文杰实验目的：掌握提取和分离叶绿体色素的方法；掌握测定叶绿体色素含量的方法；熟悉叶绿体色素的理化性质及吸光特性；了解植物叶绿体色素组成及其与生境的相关性。
实验原理：叶绿体色素是吸收光能的重要物质，包括叶绿素和类胡萝卜。
利用不同色素的极性不同可以用色谱分离法将其分离。
不同的色素对光的吸收范围不同，因此我们也可以测量不同色素在不同波长光下的吸光值，即可用公式计算出其中各色素的含量。
光对叶绿体色素有破坏作用，将叶绿体色素暴露于强光下，可以发现叶绿素被破坏，溶液颜色变化。
叶绿体色素分子吸收光后变为激发态，如能量不被光合作用利用，激发态变回到基态，放出波长较长的红光。
叶绿素分子中卟啉环上的Mg处于不稳定的状态，可被H、Cu、Zn离子取代。
叶绿素不溶于水，能溶于有机溶剂，且各色素的脂溶性不同，故可利用乙醇或丙酮提取，用不同的有机溶剂萃取或用色谱法进行分离。
实验步骤：分别选取2g左右新鲜菠菜和0.2g左右玉米幼株的叶片剪碎放入研钵中。
在研钵中加入5ml丙酮以及少量的石英砂和氯化钙，充分研磨至无纤维装组织。
过滤并转移动至量筒中，再用3ml丙酮冲洗研钵，最后加入丙酮定容至10ml 作为备用提取液。
实验一：吸光值测定：取0.1 ml色素提取液，用80％丙酮稀释到3 ml ，测定663、645 nm 处的吸光值，根据公式计算叶绿素a、叶绿素b的含量。
Chla（μg /ml）=12.7 OD663－2.69OD645，Chlb（μg /ml）=22.9 OD645－4.68 OD663。
实验二：光破坏：取少量色素提取液并稀释3到5倍，分为2份，一份至于暗处，一份正对观察透射光，反身观察反射光，最后放在培养箱中的强光下放置2H。
实验三：铜带反应：取少量色素提取液少许于试管中，一滴一滴加浓盐酸，直至溶液颜色出现褐绿色。
然后加醋酸铜晶体少许，慢慢用水浴加热溶液，则又产生鲜亮的绿色。
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三、实验材料
菠菜叶片
四、设备与试剂
➢分光光度计，离心机，照光装置，试管， 移液管，烧杯，纱布，研钵等。
➢NaCl、Tris缓冲液、2.6-二氯吲哚叮酚
五、实验步骤
1. 提取叶绿体：
➢ 称鲜菠菜叶5g，加10 ml 0.35M NaCl、1ml Tris缓冲液、 石英砂，研磨。
➢ 匀浆用脱脂棉过滤。
实验二 叶绿体的分离及离体叶
绿体的还原活性
一、实验目的
➢学习制备具有活性的离体叶绿体和测定 离体叶绿体还原活性的方法。
➢通过学习分离制备叶绿体的技术方法， 加深对希尔反应的理解及对光反应的认 识。
二、实验原理
1、叶绿体的分离: ➢采用离心分级分离。 ➢即利用叶绿体的直径和沉降系数与其他细
胞器不同的特点，先用低速离心除去细胞ml
煮沸
—— 5min ——
2.6-二氯吲哚叮酚 0.5ml 0.5ml ——
➢ 将三支试管中的溶液倒入对应的比色杯中，以3号试 管调零，620nm处比色。
➢将比色杯置于光源60cm处照光。 ➢每隔1分钟快速读下光密度的变化，连
续进行5~6次读数。
六、实验结果
1
一二三四五 1 2
2
A
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
1
2
3
4
5
6 时间（min）
3
请对结果 作出解释
七、注意事项
➢2.6-二氯吲哚叮酚 必须在煮沸加热后 滴加。
➢溶液加入比色杯就开始计时。 ➢每次测光时都应调零和百分比。
八、思考题
1. 试管中蓝色褪去的原因是什么? 与光 照有什么关系? 2．煮沸对叶绿体有何影响？
2、希尔反应（Hill reaction）
2H2O +2A 光
叶绿体
2AH2+O2
➢ 离体的完整叶绿体，在合适的氧化剂（ 2.6-二氯吲哚 叮酚 ，一种蓝色染料） 存在下，当被照光时，可以使 水光解释放氧气，接受电子和 H+后被还原成无色。
➢ 实验中可以直接观察颜色的变化，也可用分光光度计对 还原量进行精确测定，该变化在4~5min内呈线性关系。
1
2
4
5
3
➢ 用天平将各组滤液调平。 ➢ 1000转/分离心5分钟，取上清液； ➢ 3000转/分离心5分钟，去除上清液，保留沉淀。
➢在沉淀中加入5ml NaCl，搅匀，得到叶 绿体悬浮液。
2.希尔反应测定
管号 0.1MTris缓冲液 叶绿体
1
9.3ml
0.2ml
2
9.3ml
0.2ml
3
9.8ml