植物组织培养中的褐变问题
解析植物组织培养中褐变现象的产生机理及克服方法
2019年第12期作者简介：薛棪（1996-），女，湖北恩施人，本科学历，研究方向：专业植物科学与技术。
收稿日期：2019年11月7日。
试验研究引言褐变现象对植物的生长具有极大危害，是植物组织培养实践中的重难点问题。
据此，为了提升植物组织培养的顺利运行，降低植物体因褐变现象而衰弱或死亡的情况发生，我们有必要对植物组织培养中褐变现象的产生机理与客服方法进行讨论解析。
1植物组织培养中褐变现象的产生机理植物组织的褐变现象可由产生机制的差异分为非酶促褐变与酶促褐变两种。
其中，所谓“非酶促褐变”，即没有酚类底物的干预，植物体本身由于缺水、衰老、寒冷等原因而发生的细胞死亡，如苹果因过度成熟而形成褐变、荔枝因失水pH 值持续上升而形成的褐变等。
所谓“酶促褐变”，即在酚类底物的干预之下，经过酶催化而引发的褐变，此类褐变现象在植物组织培养中出现的几率较高。
从产生机理来看，酶促褐变的出现与酶、酚类底物、氧气三个要素息息相关。
经业内长期的研究与实践发现，引起植物组织褐变现象的酶主要有多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶以及过氧化物酶三种，其中尤以多酚氧化酶最为常见。
引起植物组织褐变现象的酚类底物主要有苯基羧酸、苯丙烷衍生物以及黄烷衍生物三种。
若植物组织处在健康的生长状态时，即便其体内同时存在酶、酚类底物与氧气，通常也不会出现褐变现象。
究其原因，主要是酶与酚类底物分布区域不同，前者多处在细胞的液泡中，而酚类底物则处在细胞质及细胞间质中。
但植物组织健康的细胞结构被打破、细胞膜出现破损时，酶与酚类底物便保有了接触的条件，进而在氧气的催化作用下形成醌，导致细胞出现脱水、聚合等异常反应，最终生成黑褐色的病变物质，引发植物组织的褐变现象。
此外，经相关学者对金花梨、苍溪梨等植物的研究发现，褐变现象的出现几率、发生程度存在一定规律性，与酶的活性和酚类底物的含量相关[2]。
2植物组织培养中褐变现象产生的影响因素2.1植物本身的影响第一，植物的类别及品种的影响。
组织培养褐化原因以及防止措施
褐化原因及防止措施褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。
在组织培养中，褐变是普遍存在的，这种现象与菌类污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题。
而控制褐变比控制污染和玻璃化更加困难。
因此，能否有效地控制褐变是某些植物能否组培成功的关键。
(一)褐变的原因影响褐变的因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。
1.与基因型有关不同植物与品种之间褐变现象是不同的，有人把此归结为基因型的不同。
一般来说植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。
多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。
2.与取样外植体的年龄有关通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。
因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织(或带少量叶原基)接种更为理想。
3.与外植体取材时间有关一般在春夏季，尤其是春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体时褐化严重。
即分生部位接种后形成醌类物质少，而分化的部位则形成醌类物质较多。
4.与培养基有关过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化，低盐培养基，尤其是Mn2+和 Cu2+离子浓度较低时，外植体的褐化程度较轻。
例如油棕用MS无机盐培养容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，而且获得愈伤组织和胚状体。
植物生长调节物质使用不当时，材料也容易褐变，细胞分裂素BA有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。
培养基的PH值较低时常有利于减轻外植体的褐化。
植物组培过程中的褐化问题
组培过程中的褐化问题许多植物的组织培养中发现有褐变现象，尤以木本植物组织培养中褐变严重。
褐变主要发生在外植体、愈伤组织的继代、悬浮细胞培养、原生质体的分离与培养等。
褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。
[1] 褐变的机理正常细胞内，区域性分布使底物与PPO不能接触并不发生褐变，当细胞膜的结构发生变化和破坏时，酶和底物就结合在一块，在氧的作用下，生成醌，从而引起褐变。
引起褐变的条件：氧、引起褐变的酶、底物，缺一不可。
引起褐变的酶：多酚氧化酶（PPO是主要的）、过氧化物酶（POD）、、苯丙氨酸解氨酶等。
引起褐变的酶的底物：主要是酚类化合物，可分成3类：第一类是苯基羧酸，包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等；第二类是苯丙烷衍生物，包括肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等；第三类是黄烷衍生物，包括花青素、黄酮、芸香苷等。
[2] 影响褐变的因素因子是复杂的，随植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等的不同，褐变的程度也有所不同。
A.植物种类及基因型红豆杉愈伤组织的诱导及继代培养过程中，常常发生培养细胞褐变现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重者导致细胞死亡。
豆科植物和芸苔属植物原生质体培养中容易褐化也是一个普遍的问题，橡胶的花药培养中，海垦2号花药的褐变较少，因而愈伤组织的诱导容易；而有些品系花药容易褐变，因而愈伤组织的诱导困难。
在组织培养中，有些品种、品系难以成功，而有些则容易成功。
油菜叶原生质体品种373褐化比品种94591、95386严重B.外植体部位及生理状态荔枝茎的愈伤组织中度褐变，而根的愈伤组织全部褐变。
欧洲栗幼年型的材料培养时含醌类物质少，成年型材料培养时含醌类物质多，后者比前者褐变严重。
油棕幼嫩外植体（如胚）培养较少褐变，高度分化的叶片接种后则容易褐变。
C.培养基成分及培养条件硬紫草从长期继代培养且次生代谢物含量高引起培养物的褐变。
组织培养褐化原因以及防止措施
褐化原因及防止措施褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。
在组织培养中，褐变是普遍存在的，这种现象与菌类污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题。
而控制褐变比控制污染和玻璃化更加困难。
因此，能否有效地控制褐变是某些植物能否组培成功的关键。
(一)褐变的原因影响褐变的因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。
1.与基因型有关不同植物与品种之间褐变现象是不同的，有人把此归结为基因型的不同。
一般来说植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。
多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。
2.与取样外植体的年龄有关通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。
因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织(或带少量叶原基)接种更为理想。
3.与外植体取材时间有关一般在春夏季，尤其是春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体时褐化严重。
即分生部位接种后形成醌类物质少，而分化的部位则形成醌类物质较多。
4.与培养基有关过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化，低盐培养基，尤其是Mn2+和 Cu2+离子浓度较低时，外植体的褐化程度较轻。
例如油棕用MS无机盐培养容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，而且获得愈伤组织和胚状体。
植物生长调节物质使用不当时，材料也容易褐变，细胞分裂素BA有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。
培养基的PH值较低时常有利于减轻外植体的褐化。
植物组织培养中的褐变现象及其防止措施
植物组织培养中的褐变现象及其防止措施摘要：细胞受损后，由于细胞区隔作用被破坏，毒性酚类或其氧化物醌类物质毒害细胞，导致组织褐变，植物组织培养过程中培养低效或失败。
目前认为组织培养中褐变程度主要受外植体材料的基因型、生理状态、种类、大小、预处理、培养条件、培养基及培养方式的影响。
在目前的研究中控制褐变的有效方法主要有低温培养、暗培养、勤转种、添加抗氧化剂、增效剂或吸附剂于培养基中等。
关键词:植物;组织培养;褐变;防治方法褐变是植物组织培养中一种普遍存在的现象，是由于组织中多酚氧化酶被激活，使细胞酚类物质被氧化而产生棕褐色醌类物质，这种褐变现象又被称为酚污染。
多酚类物质及其氧化物醌类物质会抑制其它酶的活性，从而毒害整个外植体，严重影响外植体的脱分化、再分化和生长。
褐变这种现象与菌类污染和过度含水化(即玻璃化)并称植物组织培养的3大难题。
目前褐变已成为植物组织培养发展的一大障碍[1]。
1褐变现象的原因1.1 非酶促褐变非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。
诸多不利条件都可以造成细胞的程序化死亡，但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生。
1.2 酶促褐变多数认为，植物组织培养中的褐化现象主要是由酶促褐变引起的，即由多酚氧化酶( P PO，Polyphenol Oxidase)作用于天然底物酚类物质而引起的。
在正常条件下,细胞中的酚和醌之间保持一种动态平衡,醌类物质水平较低;而酚氧化酶及其底物分布在正常组织的不同部位，酚类物质分布在细胞的液泡内，酶则分布在各种质体或细胞质内，这种区域性分布致使底物与酶被质膜分隔开来；但当外植体或培养材料处于机械损伤等逆境，或细胞受伤或衰老时，细胞膜结构或细胞中物质区域化分布的破坏会导致酚氧化酶释放或合成，如果此时在合适的pH和温度等条件下，酚氧化酶、酚类(底物)和氧发生酶促氧化反应，形成有毒的棕褐色醌类物质,从而使组织发生褐变。
组培苗褐化现象最有可能的原因和防止措施
组培苗褐化现象最有可能的原因和防止措施褐变又称褐化，是指培养材料向培养基释放褐色物质，致使培养基逐渐褐变，培养材料也随之变褐甚至死亡的现象。
其机理是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞内的酚类化合物聚合成暗黑色的大分子物质。
培养材料褐化所产生的醌类物质当扩散到培养基后，会抑制其他酶的活性，导致代谢功能紊乱，从而影响离体材料的培养。
引起褐变的条件是：O2、酶、底物，缺一不可。
酶主要是多酚氧化酶，底物主要是醌类化合物.1 引起褐变的原因1。
1 植物的种类和基因型不同植物、同种的不同类型、同种的不同品种的植物发生褐变的程度,都具有很大的差异,这取决于植物体内含有的酚类物质多少以及酚氧化酶活性的强弱.1。
2 外植体的类型和生理状态由于植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶活性在不同季节不相同，一般在生长季节含有较多的酚类化合物，所以一般在早春或秋季取材.通俗的说长的久又老的部位含酚类物质要多，所以一般选取幼龄嫩茎部位作为外植体。
1.3 外植体的大小和消毒时间部分实验证明,外植体材料越小越容易发生褐变，同样各种化学消毒剂消毒时间过长也会加重褐变现象，特别是酒精，时间不宜过长。
还有外植体的切口大小也会影响褐变,切口宜小不宜大。
1.4 光照和温度光照会提高多酚氧化酶的活性,从而促使培养物的褐变.故在初代培养中，对外植体进行暗光培养，对抑制褐变发生有一定的效果。
同时，高温能促进酚类物质的氧化；低温能抑制酚类物质的合成，降低多酚氧化酶的活性，从而减轻褐变。
所以，如有褐变情况的发生，可适当降低培养温度，以及遮光或暗光培养一段时间。
1.5 培养基成分无机盐以及细胞分裂素浓度过高也会影响褐变。
2 克服褐变现象的措施2。
1有产生褐变的原因可知，选择适宜的外植体以及最佳培养条件,可从根本上减少褐变的概率。
2。
2连续转移。
对于容易褐变的材料可间隔2—24小时培养后，再转瓶，这样联系处理7-10天后,褐变现象会得到控制或大为减轻。
植物组织培养中的褐变现象及其防止措施
04
褐变现象的研究进展
褐变与基因表达的关系
总结词
褐变与基因表达之间存在密切关系，一些关 键基因在褐变过程中被激活或抑制，影响植 物组织的褐变程度。
详细描述
在植物组织培养过程中，褐变通常与某些基 因的表达水平有关。这些基因可能涉及到酚 类物质的合成、代谢和运输等过程。通过深 入研究这些基因的表达模式，可以更好地理 解褐变现象的分子机制，并寻找有效的防止 措施。
添加抗氧化剂
总结词
在培养基中添加抗氧化剂可以有效防止褐变。
详细描述
抗氧化剂可以抑制酚类物质氧化，从而减少褐变的发生。常用的抗氧化剂包括 抗坏血酸、柠檬酸、硫代硫酸钠等。在培养基中加入适量的抗氧化剂，可以有 效降低酚类物质的氧化程度，从而防止褐变。
调节光照和温度
总结词
调节光照和温度也是防止褐变的措施之一。
详细描述
光照和温度对植物组织培养中的褐变也有影响。适当降低光照强度或缩短光照时间可以减少酚类物质 的氧化，从而降低褐变发生率。同时，保持恒定的培养温度也有助于防止褐变的发生。
优化培养条件
总结词
优化培养条件是防止褐变的综合性措施 。
VS
详细描述
除了选择适当的培养基和外植体、添加抗 氧化剂、调节光照和温度等措施外，优化 培养条件也是防止褐变的重要措施。这包 括控制培养室的湿度、定期更换新鲜的培 养基、及时转移生长过快或过慢的植株等 措施。通过综合运用这些措施，可以有效 降低植物组织培养中的褐变发生率。
05
结论与展望
研究成果总结
褐变现象的机制
植物组织培养中的褐变现象是由多种因素引起的，包括酚类物质氧化、酶促反应和非酶 促反应等。这些反应导致培养基颜色变深，影响植物的正常生长和发育。
植物组织培养中外植体发生褐变的原因及防止措施
１ 褐 变 原 因及 其危 害
褐 变是 指植 物 组织 培养 诱 导脱 分化 或 再分 化
化物 质． 当温 度升 高或 继 代保 存 时 间过长 ， 会发 也 生此类 现象 ． 但这种 褐变若采 取适 当措施或 者愈伤
组织 适应 了胁迫环境 就不再 发生 了．
２ ２ 酶促褐 变 ．
的过程 中 ， 外植体 组织从 表面 向培养基 释放褐 色物
４ １ 合理取 材 ．
植 株采 收 的外植 体 ， 于含 酚类 物 质较 多 ， 由 因此 褐
变较为严 重． 以 ， 所 幼嫩 的组 织 在接 种 后褐 变 程 度 并 不 明显 ， 而老 熟 的组 织在 接种后 褐变程 度较 为严
重．
在适 当的 时间 ， 选择 幼 年植 株 ， 在植 株 的一 并
外 植体 的大 小对 褐 变 的发生 及褐 变 程 度有 一 定影 响 ¨ Ｂ ｎａ 为 外 植 体越 小 ， 面 与体 积 的 ． ｏｇ 认 切 比率越 大 ， 伤害及 褐 化 的程 度 就越 大 ； 对 大 的材 相
料褐变 的程度 较轻 ¨ 除 了机 械 伤害外 ， 种 时各 ． 接
・
刘玲 玲
（ 西师 范高等专科学校 ， 定 甘肃 定西 ７ ３０ ） ４ ００ 摘 要： 通过对植物组织培养 中外植体 发生 褐变的情况 ， 分析 了发生褐变 的可能原 因 ， 并提 出 了相应 的防止措
施．
关键词 ： 植物组织培养 ； 褐变 Ｉ 夕 植体 ； 防止措施 中图分类号 ：９ ４ ６ Ｑ ４ ． 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ：０６４ ２ ２ １ ） ３０４ － １０ －３ ＸＩ０ １ ０ －０ ４０ ３
４ ６・
喀什 师范学院学报