CCK8法检测细胞增殖预实验教学文稿
细胞表型检测-细胞增殖
表型检测：增殖
细胞增殖的定义：
Cell Counting Kit-8 （CCK-8）分析细胞增殖的原理：
CCK-8 测细胞增殖操作流程：
CCK-8 测细胞增殖实验分组设计：
数据处理与绘图：
Tips：
1. 第一次做实验时，先做几个孔摸索接种细胞数量和加入CCK- 8 试剂后的培养时
间。
2. 铺板要混匀：a）可以先往孔里加50ul 培养基，再接种50ul 细胞悬液；b)不时地混
匀细胞悬液，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下；c)铺完板后，还可以轻敲板底，帮助细胞分散均匀。
或者用振荡器摇板帮助细胞分散。
3. 培养板周围一圈孔容易蒸发，为了减少误差，培养板的四周只加无菌PBS，而不作
为指标检测孔。
4. 使用新鲜的完全培养基稀释cck8，完全混匀，把待测孔中旧的培养基吸掉，加入配
制好的含cck8 的培养基。
5. 加液时，枪尖贴着孔内壁慢慢加，避免出现气泡。
6. 每次测定都需要在同一块板上设置调零孔。
如果细胞培养时是含药物的，那么调零
孔里也要含有相应的药物。
7. 使用双波长检测，检测波长450nm-490nm，参比波长600-650nm。
450nm 最灵
敏。
CCK-8 法测细胞增殖适用范围：
⏹ 适用于检测贴壁细胞和悬浮细胞数量
⏹ 不能检测组织中的细胞数量
⏹ 不能确认细胞数量的变化是由细胞增殖增多还是细胞凋亡减少引起的，需要配合其
他实验结果进行综合判断
5。
cck8细胞增殖实验原理
cck8细胞增殖实验原理CCK-8细胞增殖实验原理引言：细胞增殖实验是生物学和医学研究中常用的一种实验方法，用于测定细胞的增殖能力。
CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一种常用的细胞增殖检测试剂，通过测量细胞中的还原型CCK-8转化为溶液中的发色体，从而间接反映细胞增殖的能力。
本文将介绍CCK-8细胞增殖实验的原理及其应用。
一、CCK-8细胞增殖实验原理：CCK-8细胞增殖实验原理基于细胞代谢产物对试剂的还原作用。
CCK-8试剂中含有一种能被还原的黄色酶，当细胞活力高时，细胞内的代谢产物会将CCK-8试剂还原为有色产物。
实验原理如下：1. 细胞培养：将待测细胞接种于培养皿中，培养至适当的细胞数和状态。
2. 细胞处理：根据实际需求，对待测细胞进行处理，例如给予药物处理、基因转染等。
3. CCK-8试剂处理：将CCK-8试剂加入培养皿中，与细胞共同孵育一段时间。
4. 反应终止：孵育一段时间后，加入一种酸性溶液终止反应，阻止进一步的细胞代谢反应。
5. 测量吸光度：将培养皿中的溶液转移到微孔板中，使用酶标仪或多功能酶标仪在450 nm波长下测量吸光度。
6. 数据分析：根据吸光度值，计算细胞增殖的相对程度，比较不同处理组的细胞增殖能力。
二、CCK-8细胞增殖实验的应用：CCK-8细胞增殖实验广泛应用于生物医学研究、药物筛选、细胞毒性评价等领域。
以下列举几个常见的应用场景：1. 药物筛选：CCK-8实验可用于评估药物对细胞增殖的影响。
将细胞分为不同处理组，给予不同浓度的药物处理，通过测量吸光度值，评估药物对细胞增殖的抑制或促进作用。
2. 细胞毒性评价：CCK-8实验可用于评估化合物、材料或环境因素对细胞生存能力的影响。
通过测量吸光度值，判断待测物质对细胞的毒性程度。
3. 细胞增殖动力学研究：CCK-8实验可用于研究细胞增殖的动力学过程。
通过连续测量不同时间点的吸光度值，得到细胞增殖曲线，进一步分析细胞增殖速率和生长特性。
CCK—8法在淋巴细胞增殖检测中最佳实验条件的筛选
CCK—8法在淋巴细胞增殖检测中最佳实验条件的筛选目的筛选CCK-8法在淋巴细胞增殖检测中的最佳实验条件。
方法采用正交实验设计，对初始细胞浓度、培养时间、LPS浓度、显色时间这4个主要因素各水平对人外周血单个核细胞（PBMC）和小鼠脾细胞增殖的影响进行试验研究，对各实验组合测得的刺激指数进行方差分析。
结果CCK-8检测人PBMC 增殖试验的最佳条件：初始细胞浓度为2.5×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h；检测小鼠脾细胞增殖试验的最佳条件：初始细胞浓度为5.0×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h。
结论CCK-8法便捷、灵敏、重复性好，可作为检测淋巴细胞增殖的稳定方法。
本研究建立的CCK-8最佳实验条件可为免疫调节作用的药物体外筛选和免疫药理学作用的研究提供依据。
[Abstract] Objective To optimize the experimental conditions of CCK-8 in lymphocyte proliferation assays. Methods An orthogonal test was designed to investigate the influence of four major factors （cell density，culture period，concentration of LPS and duration of incubation with CCK-8）on cell proliferation of human PBMC and mouse splenocyte. ANOV A was carried out to analyze the stimulation indices of all experimental condition combinations. Results The optimal conditions for CCK-8 was as follows：for PBMC，cell density was 2.5×106/mL，culture period was 48 h，concentration of LPS was 1 μg/mL，and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h；and for splenocyte，cell density was 5.0×106/mL，culture period was 48 h，concentration of LPS was 1 μg/mL，and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h. Conclusion The optimized CCK-8 protocol is a sensitive，convenient and stable quantitative method to evaluate lymphocyte proliferation. This result can provide evidence in screening of immunomodulating drugs and investigation of their immunopharmacology.[Key words] CCK-8；PBMC；Lymphocyte proliferation；Orthogonal test檢测淋巴细胞增殖的方法主要有形态学检查法、放射性核素标记法和四氮唑盐比色法等。
CCK8实验原理与步骤7页
CCK8实验原理与步骤7页CCK-8实验是一种细胞活力试验，用于研究化合物对细胞增殖和代谢的影响。
它采用一种水溶性琼脂乳胶法，简便、快速、灵敏，广泛应用于细胞生物学、药理学、毒理学等领域。
原理CCK-8实验基于细胞色素P450还原酶系统，在细胞内氧化还原反应所产生的NADPH提供还原力，将CCK-8溶液还原成从橙色到黄色的水溶液，吸光度与细胞代谢活性成正比。
CCK-8试剂的成分类似于MTT，唯一的区别是在MTT中氧化剂是过硫酸铵，而在CCK-8实验中是琼脂红(VS)。
步骤1.细胞处理在细胞进行试验之前，需进行培养、传代、分离等处理。
细胞分装于96孔板中，以达到需要的浓度。
K-8试剂添加将CCK-8试剂添加到细胞培养液上，混合均匀。
3.细胞孵育将接种细胞的96孔板，放置在孵育箱中，孵育固定时间。
4.光学密度测定用光谱计或酶标仪测定吸光度，获得样品的光学密度值。
5.分析数据处理所获得数据，如绘制生长曲线、IC50计算等。
6.控制组的添加添加阳性及阴性对照物质，用于检测实验的准确性。
7.重复实验重复实验，以验证实验的可重现性和可靠性。
优点K-8法对细胞数量、增殖速度的影响很敏感，可以更直观地了解药物对细胞活性的影响。
K-8试剂耗量低、操作简便，减少了工作时间和操作风险，提高了实验的效率。
K-8试剂无需使用有机溶剂，避免了染料的毒性和膜相溶性，缩短了处理时间，不会干扰药物的测定结果。
存在的问题1. CCK-8试剂需要保持在4℃以下，且使用前要摇匀，否则会对实验结果产生影响。
2. CCK-8试剂对CO2和PH值的依赖性很强，需要精确控制实验条件，否则会导致误差的发生。
3. 由于CCK-8法不能自动修正可能的干扰，因此需要注意加入对照试样，以便精确分析试验结果。
CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项
CCK8佥测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理Cell Counting Kit-8 （简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-（2-甲氧基 4 硝基苯基）-3-（4- 硝基苯基）-5-（2,4- 二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS 的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验CCK8的优点：・使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；* CCK-8法能快速检测；* CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；* CCK-8法的重复性优于MTT法；・CCK-8法对细胞毒性小；・CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
CCK8的缺点：•与MTT法相比，CCK8和XTT的价格比较贵。
* CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。
与以往的增殖/毒性测定试剂相比较:现配现用即开即用即开即用使用方法配成溶液后使用二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法实验一：细胞增殖分析1、 制备细胞悬液：细胞计数2、 接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul 细胞悬液， 同样的样本可做3个重复。
3、 37C 培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果 不需要贴壁，这步可以省去。
4、 加入10ul CCK8 :由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在 孔壁上而带来误差，建议 在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
或 者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。
CCK-8法测定细胞的增殖能力
（1）制备细胞悬液：生长情况良好的细胞汇合率约80%的P3代HUVECs，胰酶消化方法制成细胞悬液。
（2）细胞接种：将常规培养的HUVECs细胞以2.0×103/孔，接种于96孔板中。
（3）测定A值并统计：每24小时，每组细胞任取8个孔，每孔中均加入标准制式的CCK-8液10μL。
继续放入培养箱放置2小时，取出后尽快酶联免疫检测仪上测定吸光度A值（λ=450nm）。
连续7天，检测结果绘制两组细胞的增殖曲线，所测得A值用均数±标准差表示，统计学分析每天三组所测值是否有统计学意义。
（4）注意事项：每孔细胞数量必须适量，需经过预实验，确定接种细胞数量；接种时细胞悬液需混匀；96孔板最外围一圈培养液易挥发，因此外围的孔加入PBS溶液，不作为实验检测孔；每孔加入CCK-8试剂液体量为10μL，为培养液体积1/10；加CCK-8溶液时枪头斜贴96孔板壁加入，以免产生气泡，加入试剂后轻摇96孔板，试剂与培养液应充分混匀。
CCK8实验原理与步骤
CCK8实验原理与步骤CCK-8是一种常见的细胞活力检测方法，常用于评估细胞增殖和细胞毒性等生物学活性。
实验原理：CCK-8试剂是一种黄色噻唑-二苯基甲烷盐的溶液，它能够在有活细胞存在时被细胞内的酶还原成橙色水溶性的产物。
这种产物可以通过光度计测量，从而得到细胞的活力信息。
细胞活力高时，细胞内有较多的酶可以将CCK-8还原成产物，产生较高的吸光度；细胞活力低时，细胞内酶的活性降低，无法完全还原CCK-8，产生较低的吸光度。
实验步骤：1.细胞培养：将待测细胞株接种到含有适宜培养基的培养皿或孔板中，并在恒温、湿润、含有5%CO2的培养箱中孵育。
2.实验前处理：根据实验设计的需要，可进行细胞预处理，如给药、感染等。
预处理时间根据需要确定。
K-8试剂准备：将CCK-8试剂按照用户手册的要求溶解成适合实验设计的浓度。
注：部分实验可能需要调整试剂的浓度，应根据实验要求进行调整。
K-8试剂加样：对不同组的培养皿或孔板分别加入适量的CCK-8试剂，使其与培养基均匀混合。
一般情况下，加入的CCK-8试剂量为培养基总量的10%。
5.孵育CCK-8与细胞的反应：将含有CCK-8试剂的培养皿或孔板放回恒温、湿润、含有5%CO2的培养箱中继续孵育。
孵育时间根据实验需要确定，一般为1-4小时。
6. 吸光度测定：使用酶标仪或光度计测定吸光度（OD）值，一般在450nm波长下测定。
同时，记录对照组（如细胞温育组）的OD值作为参照。
7.数据处理与分析：根据实验设计，采用合适的统计学方法，比较各组的细胞活力差异，并将数据结果进行图表展示。
注意事项：K-8试剂对皮肤、眼睛、呼吸道等有刺激性，请注意安全操作；2.实验前需进行细胞的适宜密度的培养，以保证其在实验过程中的稳定生长状态；3.在实验中注意培养条件的一致性，如温度、湿度、CO2浓度等；4.参照组的选择要慎重，需要与实验对象具有相同的培养条件；5.准备稀释CCK-8试剂时，避免过长时间暴露于光线和空气中，以免降低其效力。
（完整版）CCK8细胞增殖实验
（完整版）CCK8细胞增殖实验
CCK8细胞增殖实验
1.首先保证细胞消化下来后吹打成单细胞悬液，然后计数准确，接受每个孔前都将细胞悬液充分混匀。
接种完成后，整个96孔板按十字形来回充分晃动，保证细胞接种后在每个孔中都平均分布，否则测定OD值时重复孔会出现大幅度波动，影响结果。
2. 消化细胞前先用PBS或者生理盐水清洗细胞1-2遍，再加入胰酶，晃动培养瓶/皿使胰酶充分覆盖细胞，然后去除全部的胰酶，将细胞放入培养箱孵育3-5min。
待细胞边缘收缩至单个细胞后加入培养液吹打即可，很好吹打成单细胞悬液的。
3. 我试着回答下你的问题，CCK-8读值我想是独立于你条件培养之外的，意思就是你按照你的实验设计完成压力培养，比如你要培养48小时，那么你就等48小时结束后再加入CCK-8，那么CCK-8培养就不需要在压力条件下了，普通条件下就可以，贴壁细胞是要1－4小时，在这个时间段内你选择你认为最好的时间点测量，CCK-8公司技术专员建议CCK-8加入后培养液变黄，颜色变的最深的时间测量！
我的做法是：加入CCK-8后1－4个小时内每隔半小时测下OD 值，对比下不同时间的颜色，数值，大概估计下最佳时间点，再做的时候应该就方便了！。
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C C K8法检测细胞增殖
预实验
SRT-1720, EX527一定要应用在白血病细胞株起作用的浓度方可比较对293T细胞和白血病细胞株的不同影响，请重复实验。
实验日期：2015/08/22-2015/08/27
实验项目：CCK8法检测细胞增殖
实验地点：广西医科大学药基楼14楼生物靶向中心
实验人员：高宗燕、宁海萍、李登峰
实验目的：检测SRT-1720/EX527刺激293T细胞后对细胞增殖的影响
主要试剂：SRT-1720,EX527,CCK8试剂盒
主要仪器：酶标仪
实验步骤：
一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时）
1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞至96孔板。
2、设置4个细胞浓度梯度：0，2000，4000，8000，每组4个复孔。
3、接种后培养24小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养4小时后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。
根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间。
）
图一、标准曲线
二、细胞增殖检测
1、在96孔板中配置100μL的细胞悬液。
将培养板在培养箱预培养24小时（在37℃，5% CO2的条件下）。
2、向培养板加入10μL SRT-1720（终浓度3um）,EX527（终浓度100um）。
3、将培养板在培养箱孵育约24h
4、每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。
5、将培养板在培养箱内孵育2小时。
6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
图二、3um SRT1720刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。
该曲线呈S形，符合细胞正常生长情况。
图三、100um EX527刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。
该曲线前部分呈S形，符合细胞正常生长情况，但在进入对数期之后曲线有下滑，之后进入平台期。
分析：
SRT1720为SIRT1特异性活化剂，在前期实验中对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，此次实验中SRT1720对正常细胞（293T）的生长无明显抑制作用。
暗示SIRT1的活化对正常细胞的生长可能无明显影响。
小剂量EX527为SIRT1特异性抑制剂，在前期实验中大剂量EX527对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，而小剂量EX527无此效应，此次实验中大剂量EX527对正常细胞
（293T）的生长可能有轻度抑制作用。
但不能以一次实验结果做出肯定的结论，该实验还需重复。