胰蛋白酶最适PH及其稳定性
胰蛋白酶
工业应用
工业上用于皮革制造 生丝处理 食品加工
因为可将多肽链水解成寡肽和氨基酸，因此作 为食品加工助剂切割大分子蛋白。
谢谢大家！
使用条件 底物浓度10~25%，温度50~60℃，PH值 6.0~8.5，反应时间3~6小时（根据要求可长可 短）添加酶0.03~0.06%（以水解溶液重量计 ）保存：5℃保藏，保质期一年；25℃储存， 酶活保存期至少3个月以上
医学上应用
能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀， 易于引流排除，加速创面净化，促进肉 芽组织新生，此外还有抗炎症作用。
基本作用
在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏 是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。作为 胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的 限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶， 它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基 侧切断。
它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜 蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前 体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在 决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少 的工具。
识别序列
胰蛋白酶水解精氨酸或赖氨酸的羧基和 别的氨基酸形成的肽键
蛋白质水解酶，能选择地水解蛋白质中 由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链， 能消化溶解变性蛋质，对未变性的蛋白 质无作用
酶活力
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以BAEE为底 物反应液pH8.0，25℃，反应体积3.0ml，光径 1厘米的条件下，测定A253，每分钟使A253 增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE 单位。
适应条件
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞 离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样 。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有 关，在 pH 为 8.0 、温度为 37℃ 时，胰酶溶液的作用 能力最强。
酶
【摘要】：本文研究了酶和水解条件对乳清蛋白水解度和水解物DPPH自由基清除率的影响。采用胰蛋白酶,复合蛋白酶,风味蛋白酶,中性蛋白酶以及商业粗酶,碱性蛋白酶2709和中性蛋白酶AS 1398,在它们的最适水解pH和温度下水解乳清蛋白4h。所有酶水解得到的乳清蛋白水解物都具有抗氧化活性。风味蛋白酶和AS 1398中性酶得到的水解物的DPPH自由基清除率最高,2709碱性蛋白酶具有最高的水解度。和其他酶乳清蛋白水解物相比,胰蛋白酶水解物具有稳定的溶解性,所以被用于研究其他的水解条件的影响作用。研究表明：温度,pH值,底物浓度和酶浓度影响乳清蛋白胰蛋白酶水解物的水解度和DPPH自由基清除能力。 采用胰蛋白酶水解底物浓度40 mg／mL的乳清蛋白1h,采用响应面回归分析得到最佳水解工艺为：温度40.12℃、酶底物比6%(w/w)、pH7.02。采用二次和线性模型方程分析水解度和DPPH自由基清除率,结果表明：温度和pH值对水解度和DPPH自由基清除率具有显著影响,pH值的影响尤为显著。在最佳酶解条件下得到的乳清蛋白胰蛋白酶水解物的水解度为22.90±0.12％。DPPH自由基,超氧阴离子自由基和羟基自由基清除率的IC50分别为4.1,3.7,2.5 mg／mL,水解物的浓度为10.00 mg／mL时,还原力为0.886±0.010。乳清蛋白胰蛋白酶水解物主要由分子量小于1000 Da的短肽和氨基酸组成。与肽的抗氧化性质相关的疏水性氨基酸含量为水解物氨基酸总含量的39.01%。 采用10 kDa的超滤切向流的酶膜反应器,流速的范围为10-60 mL／min,初始水通量和截留再循环流速的范围为55-160mL／min,采用渗透总量,产物的抗氧化活性,平均膜通量和最终压力来评价酶膜反应器的稳定性。在低水通量10mLs/min时,较高的再循环流速会有高的平均膜通量,值为52%,而较低的再循环流速下,膜平均通量为29%.,当初始水通量升高至60 mL／min时,降低再循环流速,平均膜通量从13.07%降到11.33%。渗透总量随着再循环速率的提高而增加,再循环流速为160 mLs／min时,渗透总量为579 mLs,但是此时的DPPH自由基清除率为64.02±0.19%,低于130mLs/min时的65.40±0.38%。在高再循环流速下,截留组分的DPPH自由基清除率高于透过组分。不考虑初始水通量,在低再循环流速下,渗透组分的DPPH自由基清除率达到71.37±0.98%,高于高再循环流速下得到的渗透组分的DPPH自由基清除率59.64±0.71。比较最终压力,结果表明,初始水通量不变时,高再循环速率导致高的操作压力1.5 bars。 采用box-behnken因子设计优化酶膜反应的条件,该设计中包含影响酶膜反应的因素的三个水平。分别是水解初始的温度(40,45,和50℃),酶浓度(1,2,和3%)和初始水流通(15,20,和25 mLs／min)。指标包括总含量(g),蛋白转化率,透过组分的抗氧化活性,以及最终的操作压力(bar)和平均膜通量。控制底物浓度为40 mg／mL,pH 7.0,水解时间为2h。采用10 kDa(聚醚砜)的膜。涉及到六个变量的优化模型的分析研究表明：当最终压力为0.75 bars时,DPPH自由基清除率和总量达到最大,此时,Ti 50℃,,ES 2％, Ji15。DPPH自由基清除率,冻干后水解物的总量和最终的压力值分别为62.56±0.40%,14.78±1.07 g和0.91±0.01 bars。其他的结果为：渗透部分的蛋白含量为83.93±0.27%,透过部分的浓度为22.30±1.20mg/mL。平均膜通量为36.79±0.88%,水解度为18.06±0.15%。 采用二级超滤浓缩分离从酶膜反应(10 kDa)得到的酶解物。采用3 kDa和1 kDa的切向流膜分离酶解物以期减小颗粒粒径。收集冻干10-3 kDa组分(3 kDa截留组分),3-1 kDa组分(1 kDa截留组分),和1 kDa(1 kDa透过组分)。酶解物的相对分子量分布范围在130 Da～10000 Da。所有的组分都具有抗氧化活性并且有浓度依赖性。酶膜反应中得到的水解物的IC50值分别为：DPPH·,7.85；O2-·,3.25；·OH2.50mg／mL,10-3 kDa组分的IC50值分别为DPPH·,6.49；O2-·,3.60；·OH3.64mg／mL。酶膜反应得到的水解物和10-3 kDa组分富含必需氨基酸和高组分的疏水性氨基酸。二级超滤分离降低了浓缩物的必需氨基酸和疏水性氨基酸的含量。酶膜反应器和二级超滤分离联用是制备具有抗氧化活性的乳清蛋白肽的有效方法。分别研究分批反应,酶膜反应以及酶膜反应与超滤浓缩联用得到的水解物的对热,pH和贮藏稳定性。结果表明它们以冻干的状态在环境温度下都具有好的贮藏稳定性,并且在酸性条件(pH 6.3)下具有高的抗氧化活性,耐高温(63℃下30 min)。它们在中性条件下具有好的溶解性。
胰蛋白酶的制备及活力的测定
目的要求（1）学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的大体方式。
（2）了解酶的活性与比活性的概念。
实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生必然改变后转变成有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为，最适～，在pH=3时最稳固，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳固作用。
重金属离子，有机磷化合物和反映物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发此刻一些植物的块基（如马铃薯、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，关于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
另外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的灵敏性顺序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前经常使用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方式而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一样是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提掏出来，然后再依照等电点沉淀的原理，调剂pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白和非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白和非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
酶的新进展
所谓酶（Enzyme），在希腊语里，就是存在于酵母（zyme）中的意思。
也就是，在酵母中各样各样进行着生命活动的物质被发现，然后被这样命名。
此时，“酵母”始终是活着的生命体=微生物、“酶”是活着的物质 = 制造出生命活动的不可思议的物质（按影象来说叫存活物质可能更好）。
但是酶不等于酵母：只可以说酵母是自然界所有生物体重单位体积内含酶种类及酶最丰富的！尤其是啤酒酵母！酵母是单细胞微生物，内含有许多酶，酵母具备细胞组织，而酶则是蛋白质，通常一个酵母菌里有数千种蛋白质，所以说酵母含有酶，但酶不等於酵母。
酶的发现1783年，意大利科学家斯帕兰扎尼（L.Spallanzani，1729—1799）设计了一个巧妙的实验：将肉块放入小巧的金属笼中，然后让鹰吞下去。
过一段时间他将小笼取出，发现肉块消失了。
于是，他推断胃液中一定含有消化肉块的物质。
但是什么，他不清楚。
1836年，德国科学家施旺（T.Schwann，1810—1882）从胃液中提取出了消化蛋白质的物质。
解开胃的消化之谜。
1926年，美国科学家萨姆钠（J.B.Sumner，1887—1955）从刀豆种子中提取出脲酶的结晶，并通过化学实验证实脲酶是一种蛋白质。
20世纪30年代，科学家们相继提取出多种酶的蛋白质结晶，并指出酶是一类具有生物催化作用的蛋白质。
20世纪80年代，美国科学家切赫（T.R.Cech，1947—）和奥特曼（S.Altman，1939—）发现少数RNA也具有生物催化作用。
酶的分类根据酶所催化的反应性质的不同，将酶分成六大类：氧化还原酶类（oxidoreductase）促进底物的氧化或还原。
转移酶类（transferases）促进不同物质分子间某种化学基团的交换或转移。
水解酶类（hydrolases ）促进水解反应。
裂合酶类（lyases）催化从底物分子双键上加基团或脱基团反应，即促进一种化合物分裂为两种化合物，或由两种化合物合成一种化合物。
胰蛋白酶活性测定
胰蛋白酶活性测定在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。
在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链 N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。
胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。
pH＜3时，胰蛋白酶易变性。
PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。
胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。
重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。
胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。
[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。
此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。
因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。
本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物.N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。
在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物 BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。
实验：猪胰蛋白酶的分离纯 化
猪胰蛋白酶的分离纯化 与检测
主要内容
实验内容 实验目的 实验原理 实验方法 实验结果 实验报告格式
实验内容
一、猪胰蛋白酶的分离纯化 二、蛋源自质含量的测定 三、酶活力的测定 四、纯化效果检测
——SDS-PAGE电泳检测
实验目的
1、掌握盐析沉淀法、透析法及离子交换层析 的原理和操作过程；
在4℃下对0.001 mol/L HCl溶液透析3小时左右（每小时换 液1次 ！）
而后改用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液透析（至少换 液3次，第一次1小时后换液，第二次是2小时后换液，第 三次是3小时后换液，然后过夜透析 ！）
（记录样品体积，收集约1.5 mL，作为留样3，测蛋白含量，及时 SDS化）
3. 离子交换层析法
同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合。 蛋白质在其等电点以下（pH<pI），带正电荷，可被阳离子交换树
脂所吸附；而蛋白质在其等电点以上（pH>pI），带负电荷，可被 阴离子交换树脂所吸附。 本实验中的猪胰蛋白酶等电点为pI=10.8，在pH=5.0的缓冲液中猪胰 蛋白酶带正电荷，可被阳离子交换树脂所吸附（本实验采用CM-纤 维素离子交换树脂）；而带负电荷的杂蛋白不被吸附而除去，带正 电荷的杂蛋白也被吸附，但不同蛋白与树脂的吸附能力不同，通过 增加缓冲液中的离子强度及提高pH，可将蛋白从树脂上洗脱下来。 在不同的离子强度下，可将不同的蛋白分别洗脱（结合力弱的蛋
时SDS化 )
⑤硫酸铵盐析沉淀（75%饱和度） ——计算硫酸铵用量时需扣除形成硫酸钙的 量。 （于4℃静置过夜）
⑥离心（离心10000 rpm，15 min）——取沉淀（为粗胰蛋白酶 ）
实验方法
62蛋白酶
大豆肽已广泛使用于饮料、点心、及各种食品中。 推荐摄取量是每日4000mg。
1.大豆多肽的理化性质
(1) 溶解性
2） 黏度
大豆蛋白质的黏度是随着浓度的增加而增加，而大豆肽即使在很 高的浓度状态下，仍可以保持较低的黏度。
中性蛋白酶
生产菌种
枯草杆菌、耐热解蛋白芽孢杆菌、灰色链霉菌、寄生曲霉、米曲 霉
性质
（1）大多数微生物中性蛋白酶是金属酶，一部分酶蛋白总含有一 个锌离子，相对分子质量3500～40000，等电点在pH8～9 ，是微 生物蛋白酶中最不稳定的酶，很易自溶，即使在低温冰冻干燥的条 件下，也会造成相对分子质量的明显减少。
—CHR′—COO- + +NH3—CHR″—
C. 氨基的滴定 +NH3—CHR″— + OH-
NH2—CHR″— + H2O
蛋白质水解度测定原理
当肽键被水解裂开后，紧接着在羧基和α–氨基之间产生 质子交换作用。当蛋白质酶解过程在pH6.5以上进行时， 质子化的氨基酸将离解。
如果要保持反应体系pH不变，就必须加入碱液。
加蛋白酶 水解 氨基酸产品
氨基
• 前处理
一般采用热处理的方法，也可采取生化分离技术将 蛋白质先提取出来，再进行酶解。
2、明胶的生产
原料 动物的皮或骨 生产方法
酸法或碱法，也可用蛋白酶水解法生产。 酶法生产明胶的工艺流程如下：
原料 切割、捣碎 水洗 加酶水解 除酶 炭处理 过滤 干燥 明胶产品
溶解性、乳化性、起泡性、粘度、风味等 应用广泛
2021届北京市朝阳区高三上学期期中考试生物试题(解析版)
朝阳区2021届高三第一学期期中考试生物试卷一、选择题1. 下列物质中，不具有．．．单体的是（）A. 淀粉B. RNAC. 脂肪D. 蛋白质【答案】C【解析】【分析】1、生物大分子：指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子．常见的生物大分子包括：蛋白质、核酸、糖类。
2、单体与多聚体（生物小分子与生物大分子）的关系：小分子脱水缩合生成大分子，如：氨基酸脱水缩合形成蛋白质，以肽键相连；葡萄糖脱水缩合形成多糖，以糖苷键相连；核苷酸脱水缩合形成核酸，以磷酸二酯键相连。
【详解】A、淀粉的单体是葡萄糖，A正确；B、RNA的单体是核糖核苷酸，B正确；C、脂肪是由脂肪酸与甘油脱水缩合而成的，不具有单体，C错误；D、蛋白质的单体是氨基酸，D正确。
故选C。
2. 溶酶体是含有多种酸性水解酶的细胞器。
下列叙述错误．．的是（）A. 溶酶体是由脂双层构成的内、外两层膜包被的小泡B. 溶酶体中的水解酶可以分解衰老、损伤的细胞器C. 吞噬细胞吞入细菌可被溶酶体中的多种水解酶降解D. 若有大量碱性物质进入溶酶体，则可使其中的酶的活性发生改变【答案】A【解析】【分析】溶酶体内含有许多种水解酶，能够分解很多种物质以及衰老、损伤的细胞器，被比喻为细胞内的“酶仓库”“消化系统”。
【详解】A、溶酶体是由单层膜包被的小泡，A错误B、溶酶体中的水解酶可以分解衰老、损伤的细胞器，B正确；C、吞噬细胞吞入的细菌可被溶酶体内的多种水解酶分解，C正确；D、酶的活性需要适宜的条件，溶酶体中的液体pH在5左右，是溶酶体内的水解酶的最适pH，则大量碱性物质进入溶酶体可使溶酶体中酶的活性发生改变，D正确。
故选A。
3. 某种酶可用于水解机体坏死组织、变性蛋白等，能够有效预防创面、切口感染，提高引流排脓效果，该酶是（）A. 胃蛋白酶B. 肠淀粉酶C. 胰脂肪酶D. 胰蛋白酶【答案】D【解析】【分析】酶的特性：（1）高效性：酶的催化效率大约是无机催化剂的107～1013倍。
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重组胰蛋白酶最适pH和pH稳定性
样品：重组胰蛋白酶（RPT），比活4500USP units/mg pro.（上海雅心生物技术有限公司），纯度如图1所示，BAEE（Sigma）.
图1.重组胰蛋白酶的纯度的SDS-PAGE鉴定
1.最适pH的研究
准备pH为3.0~12.0的底物BAEE（0.25mM），分别测定RPT纯酶液的活性，最后结果表示为测定数值占最高酶活的百分比。
缓冲液成分依次为25mM NaAc-HAc(pH3.0~6.0)，25mM Tris-HCl(pH7.0~8.0)，25mM Gly-NaOH(pH9.0~12.0)，所有缓冲液均为25℃下配制。
底物在25℃温浴10分钟后，开始测活。
2.pH稳定性的研究
取浓度为10mg/ml纯酶液，分别在pH3.0~12.0缓冲液中稀释10倍，在25℃下温浴2h，取样品测定酶活，以水浴前酶液初始活性作为100%，计算残余活性。
缓冲液依次为25mM NaAc-HAc (pH3.0~6.0)，25mM Tris-HCl(pH7.0~8.0)，25mM Gly-NaOH(pH9.0~12.0)，所有缓冲液均为25℃下配制。
图2.a,RPT最适pH曲线；b,RPT的pH稳定性
分别在pH3.0~12.0不同的pH条件下，测定RPT活性。
结果见上图2a，最适pH范围是7.0~11.0，而pH为9.0时测得RPT活性为最大值，这与天然提取的猪胰酶不同（天然胰酶最适pH为7.6-9.0），几乎接近极值，确定该值为测活最适条件，但是底物在碱性条件易降解，所以底物尽量要现用现配。
分析不同pH环境对RPT活性的影响，如图2b所示，RPT在pH3.0NaAc-HAc缓冲液里最为稳定。
随着pH的升高，RPT酶活的损失程度也随之提高。
在测定RPT最适pH值时发现，pH≤5.0底物条件下，RPT蛋白几乎无活性，如图2a所示。
而图1b所示，在pH≤5.0的缓冲液中，2小时后依然保持较高的活性。
说明在pH≤5.0，RPT稳定，自降解的速率大大降低，酶分子处于相对稳定的状态。
此时把酶液转入到pH7.6的测活体系中，此时酶分子的构象瞬间发生变化，重新暴露出活性位点，于是又恢复了活性。
此外，RPT对碱性环境有一定时间的耐受性，在pH<9.0环境中，2小时后依然有80%以上的酶活残余，从这一点讲，RPT扩大了胰酶的应用pH范围，有很大的意义。
但是pH>10.0环境中，活性损失非常快。