唾液淀粉酶的制备
唾液淀粉酶的纯化与活性测定实验研究
唾液淀粉酶的纯化与活性测定实验研究摘要：目的是利用基因工程将淀粉酶 (RSAA）转化为人类唾液，并利用它来代替唾液中的SAA来处理淀粉。
通过热休克法对大肠杆菌DH5进行改造，在含有卡那霉素的LB培养皿中筛选抗逆转录病毒，培养、提取、消化和质粒测序抗逆转录病毒。
重组质粒转化为大肠杆菌BL21。
用含有卡那霉素的LB培养皿筛选抗体b -ps1，培养bl-ps1。
细菌在pH值为6.8的磷酸酶缓冲液中被收集和重新激活。
顶部的浮油通过离心和超声离心来检测其淀粉的活性。
结果是，SAA cDNA的PS1原始细胞核表达载体已经建立。
RSAA可以在主BL21 (DE3）中溶解，RSAA可以有效地溶解淀粉。
结论用RSAA代替唾液中的SAA唾液淀粉是安全、方便和环保的。
关键词：唾液淀粉酶A;pET-28a质粒；淀粉ABSTRACT：The purpose is to use genetic engineering to convert amylase (RSAA) into human saliva and use it to replace SAA in saliva to treat starch. E. coli DH5 was modified by heat shock method. The antiretroviral was screened in LB culture dish containing kanamycin, and the antiretroviral was cultured, extracted, digested and plasmid sequenced. The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21. The antibody b-ps1 was screened by LB culture dish containing kanamycin and bl-ps1 was cultured. Bacteria were collected and reactivated in phosphatase buffer with pH 6.8. The activity of starch was detected by centrifugation and ultrasonic centrifugation. As a result, the PS1 prokaryotic expression vector of SAA cDNA has been established. RSAA can be dissolved in main BL21 (DE3), and RSAA can effectively dissolve starch. Conclusion it is safe, convenient and environmentally friendly to replace SAA salivary starch with RSAA..KEY WORDS：Salivary amylase a; PET-28a plasmid; starch影响酶反应的因素是一个重要的生物化学实验。
实验二、外界因素对唾液淀粉酶活性影响
唾液 现象 解释
1 2
3
2ml 2ml
2ml
1ml 0
0
0 1m l
0
0 0
1ml
1ml 1ml
1ml
2、将3支试管放入370C水浴中，并在白色 比色盘上用碘液检查第二管，待碘液不变 色时，向各管加碘液一滴，观察水解情况。
四、分析讨论
1 2 3
2ml 2ml 2ml
1ml 1ml 1ml
0 0C 370C
沸水浴
(3) 在比色盘上加 I2 液2滴于各孔中，每
隔一分钟，从第二管中取反映液1 滴与I2 液混合，观察颜色反应。 (4)待第二管中反应液遇I2，不发生颜色 变化，（即只呈碘的颜色），各管 中加入I2 液1滴，摇匀，观察并记录 各管颜色。
麦芽糖
加 碘
葡萄糖
变蓝
蓝、紫、褐、红
不变色
三、实验步骤
1、温度对酶活性的影响 （1）唾液淀粉酶制备：
每人用自来水漱口3次，然后取20ml 蒸馏水含于口中，半分钟后吐入烧杯 中，棉花过滤，取滤液供实验用 。 （2）取3支试管编号按表中数据加液，操 作按（表一）表一试管号源自0.5%淀唾液温度
现象
解释
粉
2.pH对酶活性的影响 表二
试管号
1
2 3
pH缓 0.5%淀 冲液 粉液 370 C PH5. 2ml 0 2ml 保 PH6. 82ml PH8. 0 2ml
唾液
现象
解释
2ml
2ml 2ml
2ml 2ml
温 3 分 钟
3.酶的激活剂及抑制剂对酶活性的影响 表三
试管号 0.5%淀 1%CuSO4 0.5 蒸馏水 %Na 粉液 Cl
唾液淀粉酶
唾液淀粉酶是一类具有催化作用，可以将淀粉催化水解成麦芽糖、葡萄糖、糊精的酶。
人体的唾液淀粉酶主要由下颌腺、舌下腺、腮腺等唾液腺分泌，混合在唾液中。
当米饭、馒头等淀粉含量较高的食物进入口腔咀嚼时，口腔分泌的唾液淀粉酶，能够与食物中的淀粉混合作用并发生水解，可生成麦芽糖、葡萄糖等物质，帮助更好地进行消化吸收，也可在进食时使味蕾感受到甜味。
唾液淀粉酶分为α-淀粉酶和β-淀粉酶，α-淀粉酶主要分布在动、植物以及微生物中，β-淀粉酶主要分布在大麦、土豆等高等植物中。
唾液淀粉酶的催化作用具有专一性，仅对淀粉有效，而对蔗糖、葡萄糖等无效。
需要注意的是，当唾液淀粉酶进入胃肠道后，可被胃液等破坏分解，随之失效，故进食时应仔细咀嚼，使唾液淀粉酶与食物中的淀粉充分混合，有利于营养代谢吸收。
3_唾液淀粉酶活性的观察
11
四、操作步骤
3. 酶反应的特异性 取2支试管，按下表编号后进行实验。
试剂
1
0.5% 淀粉
2
0.5% 蔗糖
—
稀释唾液
1
单位：mL
2 — 2 1
12
将各管摇匀后，一起放入37℃水浴中保温10min。 取出试管，分别加入斑氏试剂 1 mL，混匀。 将各管置于沸水浴中煮沸2-5 min。观察并解释结果。
酶活性的测定方法：1）定底物 2）定时间
影响酶活性的因素是多方面的，如温度、pH, 激活剂和抑制剂 等都会影响 酶的催化活性。
3
二、实验原理
pH值的影响: 能使酶活性达到最高时的pH值，称为该酶的最适
pH。
温度的影响: 在一定温度范围内，随着温度的升高，酶促反应速
度增加，直至达到最大值。在一定条件下，能使酶活性达到最高
淀粉酶
淀粉酶
淀粉——————→糊精—————→ 麦芽糖+少量葡萄糖
加碘后；（兰色） （紫红色、暗褐色或红色等） （棕黄色，碘本身颜色）
5
实验原理
影响酶活性的因素
1）温度 2）pH 3）激活剂和抑制剂
酶的特性（专一性）
还原糖和斑氏（Benedict）试剂的反应原理
C6H12O6 + 2Cu(OH)2
值日：5-6组
麦芽糖分子结构（葡萄糖α-1,4-葡萄糖苷）
三、试剂及器材
1. 试剂
• （1）0.5% (w/v) 淀粉溶液 • （2）稀碘溶液 • （3）不同pH缓冲液 (pH5.0 、6.8、8.0) • （4）1% (w/v) NaCl溶液 • （5）1% (w/v) CuSO4溶液
唾液淀粉酶活性的观察实验报告
唾液淀粉酶活性的观察实验报告摘要：唾液淀粉酶是一种能够水解淀粉质的酶，其活性可以被观察到并测量。
本实验对不同浓度淀粉溶液和唾液的淀粉酶活性进行了观察和测量，并将结果图表化。
实验结果表明，唾液对于淀粉的消化具有一定的浓度依赖性。
本实验为淀粉酶活性的研究提供了一定的参考价值。
实验目的：1.观察唾液淀粉酶的活性2.测量不同浓度淀粉溶液中唾液淀粉酶的活性实验原理：唾液中含有淀粉酶，可以将淀粉水解为葡萄糖。
水解反应需要一定的时间，根据反应物的浓度和酶的活性来决定反应的速率。
当反应物浓度大时，酶的饱和度高，反应速率也会增加。
实验步骤：1.准备不同浓度的淀粉溶液，如0.1%，0.5%和1%的淀粉溶液。
2.将淀粉溶液加入至离心管中,注入相应的唾液分别混合，并在室温下保存10分钟。
3.加入2ml的止血液，并室温下放置5分钟后停止反应。
4.将反应液室温下放置1小时，直到淀粉水解反应结束。
5.分别加入2ml的卡球蓝液，并室温下抖动管子，使卡球蓝充分混合后，观察颜色变化。
6.将各离心管中的反应液，吸取至比色皿中，并读取各样品的OD值。
实验结果：样品编号淀粉溶液浓度（%）OD值1 0.1% 0.1272 0.1% 0.1303 0.5% 0.1904 0.5% 0.1925 1% 0.2406 1% 0.241实验分析：通过实验结果可以看出，淀粉溶液浓度越高，唾液淀粉酶的活性也越高，这与理论原理相吻合。
同时，样品1和2以及样品3和4的数据相近，表明了实验具有一定的重复性。
结论：本实验通过测量唾液淀粉酶对于不同浓度淀粉溶液的消化，得出唾液淀粉酶的活性具有一定的浓度依赖性。
这为淀粉酶活性研究提供了参考价值。
自主实验——唾液淀粉酶活力的测定
五、实验操作：
1、取4个50ml的三角瓶，按下表操作： 、取4 50ml的三角瓶，按下表操作：
2、结果计算：
单位定义：1ml唾液中的淀粉酶，在37° 单位定义：1ml唾液中的淀粉酶，在37°、 30min水解淀粉10mg为 30min水解淀粉10mg为1个淀粉酶活力单位 淀粉酶活力（Ｕ）= （空白管吸光度淀粉酶活力（Ｕ）=【（空白管吸光度-测定 管吸光度）*240】 管吸光度）*240】/空白管吸光度
三、试剂：
0.16%淀粉溶液（在1000ml烧杯加入800ml的蒸 0.16%淀粉溶液（在1000ml烧杯加入800ml的蒸 馏水，加热到沸腾备用。准确称取1.6g淀粉在 馏水，加热到沸腾备用。准确称取1.6g淀粉在 50ml烧杯中，加入20ml蒸馏水调匀，转入沸水中， 50ml烧杯中，加入20ml蒸馏水调匀，转入沸水中， 一分钟后冷却，定容至1000ml。） 一分钟后冷却，定容至1000ml。） 碘液（0.1N碘贮存液：精确称取1.785g碘酸钾， 碘液（0.1N碘贮存液：精确称取1.785g碘酸钾， 碘化钾22.5g,共至于500ml烧杯中，加入蒸馏水 碘化钾22.5g,共至于500ml烧杯中，加入蒸馏水 350ml，并加入HCL4.5ml溶解候混匀，定容 350ml，并加入HCL4.5ml溶解候混匀，定容 500ml，保存在棕色瓶子中以备用。 500ml，保存在棕色瓶子中以备用。 0.1%氯化汞溶液：称取0.1g氯化汞溶于100ml水 0.1%氯化汞溶液：称取0.1g氯化汞溶于100ml水 中即可。
唾液淀粉酶活力的定量测 定
一、实验目的：
掌握定量测定唾液淀粉酶活力的方法
二、实验原理：
实验六 淀粉酶的专一性和温度pH激动剂抑制剂对酶活性的影响
实验六淀粉酶的专一性和温度、pH、激活剂及抑制剂对酶活性的影响实验类型：验证型目的和要求1.通过本实验观察、验证酶的专一性和温度、pH、激动剂及抑制剂对酶活性的影响。
2.熟悉淀粉及其酶解产物的特殊显色方法；电热恒温水浴的使用。
3.了解唾液淀粉酶的收集与预处理。
原理酶具有高度专一性，一种酶只能催化一种或一类底物发生反应，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。
当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时，能使班氏试剂的Cu2+还原成Cu1+，生成砖红色Cu2O沉淀。
淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。
不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。
通过上述特征性反应，并以蔗糖等作对照，便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。
操作方法一、唾液淀粉酶的收集与处理1.制备唾液实验者先将痰咳尽，用自来水漱口，以清除口腔内食物残渣，再在口腔内含蒸馏水约15ml，并作咀嚼咕漱运动，3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内，过滤于小烧杯中备用，为与下面稀释唾液相区别，此称制备唾液。
2.煮沸唾液取上述唾液约2ml，盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。
3.稀释唾液调整唾液淀粉酶活性，使之在pH6.8、37℃和既无激动剂又无抑制剂条件下，作用5min，水解淀粉至红色糊精为宜。
具体做法是取12凹白瓷反应板一块，按下列步骤操作：①第1排每凹各加1滴制备唾液，12、13、14凹分别加生理盐水1、2、3滴，用滴管采用抽吸法，由稀到浓（14→12）小心混匀各凹，勿使溅入相邻凹中。
每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中，剩余稀释唾液应全部放回原凹中。
②在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中，均加入4滴缓冲液（pH6.8），2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水，用①混匀法充分混匀，置37℃下5min。
③在第2排各凹中加I液一滴，混匀，观察比较各凹颜色，以浅棕-红色对应的稀释倍数，用生理盐水稀释3ml制备唾液备用。
唾液淀粉酶的催化作用实验改进
唾液淀粉酶的催化作用
一、实验目的
1、尝试收集唾液 2、学会淀粉的检验方法 3、观察唾液淀粉酶作用的效果
二、实验原理
1、淀粉特性反应：遇碘液呈蓝色 2、酶具有催化作用。例如唾液淀粉酶催化
淀粉，使淀粉水解形成麦芽糖和葡萄糖。
1、收集唾液。
用清水漱口，然后用舌尖抵住上颌或下颌齿根后， 微低头，将试管口紧靠嘴下唇，让唾液流入试管中， 备用。
水温，将温度调到37℃左右。 (5)取出淀粉纸纸条。
5-10 分钟，将纸条拿出，用镊子将试管中的两个纸 条夹出来，冷却。 (6)滴加碘液，观察实验的反应现象。
向冷却后的这两个淀粉纸条上，各滴上1滴碘液，这 时可以看到： 1号纸条变成了蓝色；2号纸条没有变成 蓝色。
3. 改进后的实验优点
安全、省时、省物、省水
（1）取材容易，操作方便； （2）节约时间，整个过程只要 5~6 分钟； （3）不用温度计、试管等仪器； （4）现象明显，效果很好。 （5）本实验改进后，可作为学生的家庭小实验，
可操作性强； （6）本实验改进后，若作为教师表演实验可放在
投影仪上放大。
影响酶催化作用的因素
1、取3支洁净的试管，编上号，分别加入2毫升1%淀粉 溶液。 2、将3支试管分别放入60℃、10℃和37℃左右的热水 中约5分钟。 3、在3支试管中各注入1毫升新鲜的淀粉酶溶液，摇匀 后，再分别放入60℃、10℃和37℃左右的热水中5分钟。 4、在3支试管中各滴入1滴碘液，然后摇匀。 5、观察并记录这3支试管中溶液颜色的变化情况。
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（2）光密度计法 （3）用本法定量，正常人数值为： 白蛋白 54.0 % ~ 73.0 % 540 ~ 730 g/L α1球蛋白 2.8 % ~ 5.1 % 28 ~ 51 g/L α2球蛋白 6.3% ~ 10.6 % 63 ~ 106 g/L β球蛋白 5.2 % ~11.0 % 52 ~ 110 g/L γ球蛋白 12.5 % ~ 20.0 % 125 ~ 200 g/L
实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 【实验目的】
1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。 2.了解氨基酸的特征性颜色反应。 3.学会分析未知样品的氨基酸成分。
பைடு நூலகம்
【实验原理】
纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性 支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖 类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所 用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近
代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科 研和生产分析工作中。 纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂； 水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶 剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤 纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机 溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相， 有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两 相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配 较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分 配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。 一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的Rf
DNA(或RNA)即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白 质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液 中加入适 量乙醇，DNA即析出。 为了防止DNA(或RNA)酶解，提取时加入EDTA(乙二 胺四乙酸）。
【实验试剂与器材】
1．5mol/LNaCl溶液：将292.3g NaCl溶于水，稀释至 1000ml。 2． 0.14mol／ＬNaCl-0.15mol／ＬEDTA-Na溶液： 溶 8.18gNaCl及37.2gEDTA－Na于蒸馏水，稀释至 1000ml。
实验六
实验七 实验八
血清中总胆固醇的测定 (操作性) 4学时
唾液淀粉酶活性的观察 (综合性) 4学时 维生素C的定量测定 (操作性) 4学时
实验九
脂肪酸的β-氧化 (操作性) 4学时
实验十
琼脂糖胶电泳法分离乳酸脱氢同工酶 (操作性) 4学时
实验十一 酪蛋白的制备 (操作性) 4学时 实验十二 肝脏谷丙转氨酶活力测定 (综合性) 3学时
蛋白质与染料结合速度很快，2min就可以反应完全， 并可以稳定1h，蛋白质-染料复合物有很大的消光系数， 使得测定蛋白质浓度是灵敏度很高。测定范围为10-100μg 蛋白质，微量测定时达到1-10μg蛋白质。此反应反复性好 精度高，线性关系好。
【实验试剂与器材】
1、标准蛋白液（0.1mg/ml）0.2g结晶牛血清白蛋白用 0.9%NaCl 稀释到2000ml。 2、0.9%NaCl 3、考马斯亮蓝试剂：100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 5%乙醇中，加100ml85%磷酸，蒸馏水稀释 1000ml，滤纸过滤。 4、待测蛋白：人血清，用前用0.9%NaCl稀释200倍。
【实验步骤】
1．薄膜准备 2．点样
3．电泳
4．染色和漂洗
+
白蛋白(A)
α2 α1
β
γ
5．薄膜和透明 6．定量 （1）洗脱法
每种蛋白占总蛋白量的 百分数（ %） 该种蛋白管光密度读数 100% 各管光密度读数之和
注意！白蛋白因加入NaOH的量比其他管多，其光密度值 应乘以稀释倍数，得到数值再代入上式中计算。
HCL 9.55 ml，补加蒸馏水至 1000 ml，测试其 pH应 为 8.6。 2 、染色液：取氨基黑 10B 1.0 g，磺基水杨酸 10 g，加冰 醋酸20ml，蒸馏水 400ml，摇匀溶解。 3、漂洗液：2.5％醋酸 4、洗脱液：0.02 mol/L NaOH溶液 5、透明液：无水乙醇7份，冰醋酸3份混合即成。
3．25％SDS溶液：溶25g十二烷基硫酸钠于100ml 45％乙醇。 ４．0.015mol/LNaCl-0.0015mol／Ｌ柠檬酸三钠溶液,氯化 钠0.828g及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水,稀释至 1,000ml。 5 ．氯仿-异戊醇混合液:氯仿:异戊醇=24:1(V/V)。 6 ． 1.5mol/LNaCl-0．15mol／Ｌ柠檬酸三钠溶液: 氯化 钠82.8g及柠檬酸三钠34.1g溶于蒸馏水,稀释至 1,000ml。 7 ． 3mol/L乙酸钠-0.001mol／ＬEDTA-Na溶液：称取 乙 酸钠408g、EDTA-Na0.372g溶于蒸馏水,稀释至 1,000ml。 8 ． 70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇。
实验四 动物肝肝脏DNA的分离与鉴定 【实验目的】
学习常用的DNA分离方法 。
【实验原理】
在浓氯化钠(1-2mol/L)溶液中，脱氧核糖蛋白的溶 解度很大，核糖蛋白的溶解很小。在稀氯化钠 (0.14mol/L)溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核 糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化 钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白 从样品中分别 抽提出来。 将抽提的核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理，
目 录
实验一
实验二 实验三 实验四 实验五
氨基酸的分离鉴定——纸层析法 (操作性) 4学时
考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 (操作性) 3学时 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 (验证性) 5学时 动物肝肝脏DNA的分离与鉴定 (操作性) 3学时 血液中葡萄糖的测定 (操作性) 3学时
【实验试剂与器材】
（一）仪器 1、电泳仪； 2、电泳槽； 3、恒温水浴箱； 4、721型分光光度计 （二）材料 1、人血清或鸡血清 2、醋酸纤维素薄膜 （三）试剂 1、0.05 mol/L巴比妥钠-HCL缓冲液（pH8.6）：取巴 比妥钠10.3 g，加蒸馏水约800 ml溶解后，加入lmol/L
二、未知样液的测定 另取一干净试管，加入样品1.0ml及考马斯亮蓝染液 4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读 取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。
【注意事项】
1、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入5-20min内测 定吸光度，在这段时间内样色很稳定。 2、测定中，蛋白质-染料复合物会吸附在比色皿上，实验 证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。
图2.层析谱 1．原点；2．层析点；3．溶剂前沿
5 ．计算 用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿 距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的Rf值。
【注意事项】
(1)在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指 上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。 (2)在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。 (3)展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。 (4) 点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm），防止氨 基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。 (5)根据目的、要求，选择合适溶剂系统。
《生物化学实验》
课程简介
生物化学课程是一门与生物技术相关的专业基础必修课， 本实验课程是附属于该课程的一个教学环节，开设操作性、验证 性、综合性等实验项目，实验内容主要进行生物分子（蛋白质、 核酸、糖、维生素）的定性、定量测定和分离提取制备，学习酶 活性和维生素的测定方法等实验，涉及了生物化学的基本实验技 术及典型仪器设备。通过实验有助于学生加深对生物化学的基本 知识和基本理论的理解，掌握生物化学的主要方法与技术，包括 经典的、常规的、以及现代的方法与技术。
掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理和操作过程。
【实验原理】
血清中各种蛋白质的等电点不同，在pH8.6的巴比 妥缓冲液中，各种蛋白质所带的净电荷量不相等，加上 蛋白质分子大小不相同，在电场中移动的速度就不等， 例如，白蛋白等电点比其他蛋白质低，在pH8.6时带的负 电荷比其他蛋白质多，加上白蛋白的分子较小，因此在 电场中比其他蛋白质移动速度快。这样，血清蛋白质在 醋酸纤维素薄膜上就可以形成区带，用以分离和分析蛋 白质。
5、漩涡混合器 6、移液管0.5ml（×2），1.0ml（×2），5ml（×1） 7、分光光度计 8、试管1.5cm×15cm (×8) 9、量筒100ml(×1) 10、电子分析天平 11、试管架(×1)
【实验步骤】
一、标准曲线线的绘制 取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。以 A595为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制标准 曲线。
（2）酸相溶剂：正丁醇:80%甲酸:水＝15:3:2（体积比） 2、显色贮备液：0.1%水合茚三酮丙酮溶液 3、V（0.1%硫酸铜）:V（75%乙醇）=2:38溶液。 4、混合氨基酸溶液6mg/ml。 5、滤纸。 6、烧杯10ml（×1）。 7、剪刀。 8、层析缸（×2）。 9、微量注射器10μl （×1）或毛细管。 10、电吹风（×1）。 11、722型（或7220型）分光光度计。
实验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 【实验目的】
学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法。
【实验原理】
考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质--染料结合 法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G-250存在着两种不同样色形式，红色-棕 黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有红色-棕黑色和蓝色 形式，最大光吸收由465nm变成595nm，测定595 nm吸光 的增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。
试管号 试剂 1mg/ml标准 蛋白液/ml 0.15mol/L NaCl/ml 考马斯亮蓝 染液/ml
1 0.1
2 0.2
3 0.3
4 0.4
5 0.5
6 0.6
1
4.0
0.9