微生物遗传学
微生物遗传学的研究方法
微生物遗传学的研究方法微生物遗传学是指研究微生物的遗传现象和基因功能的学科，对于了解生命体系的分子生物学、基因工程等方面都有着重要的意义。
那么，微生物遗传学的研究方法主要有哪些呢？1. 基于重组DNA技术的分子克隆分子克隆是微生物遗传学的一个常用方法。
它通过重组DNA技术，将DNA片段插入到质粒、合成质粒等载体上，使其在宿主微生物中被产生、表达。
基于重组DNA技术的DNA克隆技术成为了现代分子生物学中的核心技术。
DNA克隆技术一般包括以下步骤：DNA片段的产生、切割、连接、转化、筛选等过程。
最终从中筛选出目标DNA片段。
2. 基因敲除技术基因敲除技术是指通过改变或部分剥夺某一基因的功能，以达到推测出基因功能的目的。
这种技术是微生物遗传学的另一种研究方法。
基因敲除技术还有以下两个局限：①染色体插入敲除后，不能确定是否将基因完全删除。
例如，有些穿插个体可能由于染色体重组而产生形态上看来像缺失的基因乘积。
如果是这种情况，有些重要的信息也可能被删除。
②除非某些非常有限的特殊条件下，不可以将插入染色体与目标基因以一个更高的产率区分开。
3. 基于RNA干扰技术的基因沉默RNA干扰技术又称基因沉默技术，是指使用RNA干扰的原理对目标基因进行有针对性地沉默，以分析其遗传功能的一种技术。
RNA干扰的机制是，RNA干扰分子特异性的结合到目标mRNA上，并使其特异性降解，从而达到沉默基因的目的。
4. 基于突变体筛选的遗传分析还有一种常用的微生物遗传学研究方法就是基于突变体筛选的遗传分析。
这种方法是指对生物个体的某些基因进行随机突变，通过之后的筛选过程选取出突变体，并进行功能分析来揭示该基因遗传信息及其相关的生物学过程。
总之，微生物遗传学作为现代分子生物学的一个重要分支，已经成为了科学家们探索生命奥秘的一个重要工具。
在微生物遗传学的研究中，各种机启发人们了对于微生物世界的认知，也让我们对于未来在生物科技、优化微生物工业等多个领域发展中有着更高更远的憧憬。
微生物遗传育种学
微生物遗传育种学一、名词解释（3*5）1、pcr:聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定dna片段的核酸合成技术。
2、操纵子：操纵子(operon)：原核生物能mRNA出来一条mrna的几个功能有关的结构基因及其上游的调控区域，称作一个操纵子（operon）。
3、启动子(promoter)：真核基因启动子是rna聚合酶结合点周围的一组转录控制元件，包括：至少一个转录起始点及一个以上的功能组件。
4、冈崎片段:冈崎片段就是由于解链方向与激活方向不一致，其中一股子链的激活，Gondrecourt母链求出足够多长度才已经开始分解成引物接着缩短。
这种不已连续的激活片段就是冈崎片段。
5、营养缺陷型：指某一菌株在诱变后丧失了合成某种营养成分（生长因子）的能力，使其在基本培养基上不能生长，必须加入相应物质才能生长的突变体。
6、准性生殖：就是一种类似有性生殖但比它更为完整的一种生殖方式。
可使同一种生物的两个相同来源（即为同种相同株）的体细胞经融合后，不通过有丝分裂而引致高频率的基因重组。
准性生殖常见于某些真菌，尤其就是半知菌中。
7、限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease):识别并切割特异的双链dna序列的一种内切核酸酶。
8、密码的自旋性：密码的自旋性就是多个密码子编码同一个氨基酸的现象。
9、转座子(transposons):转座子是可以从一个染色体位点转移至另一个位点的分散的重复序列。
转座子也包括含有两个反向重复序列的侧翼，内有转座酶基因，并含有抗生素耐药基因等其他基因。
10、微生物繁育：人为地使用物理、化学的因素，引致有机体产生遗传物质的突变，经选育成为新品种的途径。
二、是非题（2*5）三、选择题（3*5）1、限制性内乌酶的种类、辨识位点、功能、区别根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统主要分成三大类。
ⅱ型酶所占到的比例最小，相对来说最简单，它们辨识回文等距序列，在回文序列内部或附近研磨dna。
《微生物遗传》课件
04
自然选育
利用自然变异选择有益的变异体，通过遗传稳定性和生产性状的鉴定，培育出新的菌种。
微生物遗传学应用
05
工业发酵是微生物遗传学应用的重要领域之一，通过利用微生物的遗传特性，实现大规模生产各类发酵产品，如酒精、醋酸、酵母、抗生素等。
工业发酵中，通过遗传育种和基因工程手段改良微生物菌种，提高发酵效率和产物质量，降低生产成本。
详细描述
总结词
介绍基因表达的概念、基因表达的调控机制以及基因表达的改变对微生物的影响。
详细描述
基因表达是DNA中的遗传信息转录为RNA并翻译为蛋白质的过程。基因表达受到多种因素的调控，包括DNA的甲基化、染色质构象以及转录和翻译水平的调控。基因表达的改变可能影响微生物的生长、代谢和致病性等方面。
微生物基因突变与重组
19世纪末期
遗传学奠基人摩尔根提出基因概念，为遗传学的发展奠定了基础。
20世纪初期
DNA双螺旋结构发现，开启了分子生物学时代。
20世纪50年代
人类基因组计划启动，推动了基因组学的发展。
20世纪70年代
微生物遗传物质基础
02
介绍DNA的基本结构，包括碱基、磷酸和脱氧核糖，以及DNA的双螺旋结构。
总结词
工业发酵的微生物菌种通常具有特殊生理功能和代谢途径，通过研究其遗传机制，有助于发现新的发酵产品和工艺。
生物制药是利用微生物或其代谢产物作为药物成分，治疗和预防人类疾病的领域。
通过遗传工程手段，可以改良微生物细胞工厂，高效表达具有药效的蛋白质或其他活性分子。
生物制药中，对微生物的遗传特性和表达调控机制的研究，有助于发现和开发新的药物候选分子。
生物环保是利用微生物的降解和转化能力，处理和治理环境污染的领域。
微生物的分子遗传学研究
微生物的分子遗传学研究微生物是指体积小，单细胞或多细胞的微小生物。
微生物通常指细菌、真菌、病毒和原核生物等。
微生物的分子遗传学主要涉及DNA、RNA和蛋白质等分子的遗传学研究，包括遗传信息的编码、复制、转录、翻译以及相关的调控机制等。
微生物的分子遗传学研究具有广泛的应用价值，可以应用于基因工程、生物技术、医学和环境保护等领域，为人类社会的发展做出了重要的贡献。
一、微生物的分子遗传学研究进展随着分子生物学技术的不断发展，微生物的分子遗传学研究日益深入。
主要包括基因组学、转录组学、蛋白组学、蛋白质互作网络和代谢组学等研究领域。
这些技术的集成为微生物分子遗传学研究提供了全面准确的遗传信息和相关的调控机制数据。
基因组学研究主要涉及微生物基因组或部分基因组的解读。
通过基因组研究可以发现微生物的基因数目、内含子和外显子的结构，以及基因在基因组中的位置和分布情况等。
转录组学研究主要涉及对微生物转录组内基因表达的调控机制进行分析。
转录组研究可以发现在不同生物学过程中微生物基因的表达水平变化，以及此过程的调控机制。
蛋白组学研究主要涉及微生物蛋白质的定量和鉴定。
通过蛋白质组学研究可以了解微生物蛋白质的种类、数量和分布情况等，为深入了解微生物功能提供重要的信息。
蛋白质互作网络研究主要涉及微生物蛋白质之间相互作用的网络关系。
通过蛋白质互作网络研究可以了解微生物中蛋白质之间的关联关系，这对于揭示微生物生命活动的调控机制和功能意义具有重要意义。
代谢组学研究主要涉及微生物代谢产物的定量和鉴定。
通过代谢组学研究可以了解微生物合成产物的种类、数量和分布情况等，为深入了解微生物代谢过程和功能提供有力支持。
二、微生物的分子遗传学应用微生物的分子遗传学研究为生物技术、医学和环境保护等领域提供了广泛的应用价值。
（一）基因工程微生物的基因工程是通过利用分子遗传学技术来改变微生物的代谢和生长特性，实现对微生物功能的调控。
基因工程可以制备具有特定功能的微生物代谢产物，解决工业生产中的问题，如合成抗生素、生产化学品等。
微生物遗传学的研究与应用
微生物遗传学的研究与应用微生物遗传学是研究微生物性状遗传和分子机制的学科，是生物学、生物技术和微生物学的交叉学科。
微生物遗传学的发展，对于解决医学、工业、环境以及农业等重要问题，具有极其重要的意义。
本文将探讨微生物遗传学的研究与应用。
一、微生物基因组研究微生物是非常重要的遗传材料来源之一，研究微生物基因组，可以揭示微生物的基本生理和代谢过程，预测微生物在环境中的作用，以及为微生物的应用提供重要的遗传资源。
目前，科学家们已经完成了许多微生物的基因组测序，例如大肠杆菌、链球菌、酵母菌等。
这些研究为微生物的病原性、代谢过程、生长环境、适应性等方面提供了深入理解的理论依据。
二、微生物生物合成的研究许多有用的生物产品是由微生物生物合成的，例如人类胰岛素、生长激素、抗生素等。
微生物遗传学的研究可以帮助科学家们深入了解这些产品的生物合成过程，进而提高生产效率和产品质量。
研究人员可以利用基因转移技术，将某些微生物愈合基因引入新的生产细胞中，从而提高生产质和效率。
此外，研究还可以揭示生长条件和生产方法之间的相互作用，进一步优化微生物的生产条件。
三、微生物基因工程技术微生物基因工程技术是微生物遗传学的一个重要分支，目的是通过基因的改变，改变微生物特性，以达到工业、医疗等领域的应用。
例如，利用基因工程技术改变细菌的代谢途径，可以生产出新的化学品；利用基因编辑技术改变病原微生物的生长特性，可以治疗疾病。
四、微生物的环境修复微生物在环境修复中有着重要的应用价值。
在生物肥料、臭氧层保护、土地重金属污染控制和水污染处理等方面，微生物都发挥了重要作用。
例如，通过利用基因工程技术改变微生物能力，使其分解环境中的不良物质，可以实现效果更佳的污染治理。
五、微生物工业的应用微生物可以用于制备食品、化工产品、药品等各种产品，其生物合成技术的高效性、低成本和环保性，使得微生物被广泛应用于工业生产中。
除此之外，微生物也在工业废水处理，环境污染控制、新能源发展等领域起到了重要的促进作用。
第八章 微生物遗传学笔记
杂交育种的优点：①由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，故在方向性和自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。②利用杂交育种可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象
杂交育种的缺点：杂交育种的方法较复杂，目前还没有得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。
2.转导：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传形状的现象。获得新遗传形状的受体细胞称为转导子（transductant）
3.接合（conjugation）：供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链DNA给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象。获得新性状的受体细胞称为接合子。
移码突变（frame-shift mutation）指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。
染色体畸变（chromosomal aberration）某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤——染色体畸变，包括以下两个方面：染色体结构上的缺失、重复、易位和倒位染色体数目的变化。
6.降解性（代谢）质粒
如假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名。
7.隐秘质粒：不显示任何表型效应，只能通过物理的方法检测的质粒。如酵母菌的2um质粒。
二.转座因子
插入（IS）序列、转座子(Tn)、特殊病毒（Mu噬菌体）
微生物遗传学的研究进展与应用
微生物遗传学的研究进展与应用微生物遗传学是一门研究微生物遗传的学科，随着分子生物学等技术的不断发展，微生物遗传学的研究不断取得新的进展和突破。
本文就微生物遗传学的研究现状和应用领域进行探讨。
一、微生物遗传学的主要研究对象微生物是指形态小、复杂度低的单细胞或多细胞有机体的总称。
微生物种类众多，包括细菌、古菌和真菌等。
在微生物中，细菌是最为常见的一类。
细菌是一种典型的单细胞生物，其体积很小，但与其他生物一样具有基因表达、蛋白质合成等生物特性。
因此，细菌是微生物遗传学的主要研究对象之一。
二、微生物遗传学的主要研究内容微生物遗传学的主要研究内容包括基因转移、基因表达、突变和基因组的进化等方面。
1.基因转移基因转移指DNA在不同细胞之间的传递。
微生物中普遍存在基因转移现象，主要是通过基因传递介体（如质粒、细菌噬菌体、转座子等）来实现的。
不同于有机体的遗传，微生物的基因转移具有重要的科学及应用价值。
通过对基因转移的研究可以促进疾病的治疗，增强微生物代谢效率等。
2.基因表达基因表达是指基因转录和翻译的过程。
在细菌细胞中，基因表达过程的速度和效率非常快，这与细菌体积小和基因组简单有关。
通过研究细菌基因表达机制，可以深入了解细菌的生命活动过程，特别是对于蛋白质表达的研究有着广泛的应用前景。
3.突变突变是指基因组中发生的变异现象。
细菌的基因组相对较小，且具有高度可变性。
在细菌的繁殖过程中，它们会不断发生基因突变，并且可以在短时间内积累足够多的突变，形成不同的基因型和表型。
由于其基因组的简洁性，细菌基因突变或变化所产生的影响更加明显，其研究和应用前景十分广泛。
4.基因组的进化基因组进化指基因组中有关分子生物学方面的各种事件，包括基因重排、重复、基因家族扩张和重读、可移动元件的插入和删除等。
微生物基因组进化研究可以为微生物进化的机理和规律提供重要的理论依据。
三、微生物遗传学的应用领域微生物遗传学在各个领域中都有进一步的发展和应用。
微生物遗传学的研究现状与趋势
微生物遗传学的研究现状与趋势微生物遗传学研究现状与趋势微生物遗传学是指研究微生物的遗传基础和遗传机制的学科。
随着科技的发展，微生物遗传学也在不断地发展和深入。
在微生物遗传学研究中，很多人都会想知道微生物的遗传特点以及它们在生命系统中所扮演的角色。
那么，微生物遗传学的研究现状与趋势是什么呢？微生物遗传学的研究现状微生物遗传学的研究在解决一系列实际问题方面发挥重要作用。
一方面，可以通过微生物遗传学探讨细菌的抗药性、传染性等问题；另一方面，也可以通过研究微生物基因来调节产业菌株的生长与发育，以达到产量、质量的优化。
微生物遗传学研究的过程中，分子遗传学是必不可少的领域。
通过分子遗传学的研究，可以探讨细菌膜、抗菌素等方面的问题。
同时，还需要进一步研究微生物受到细胞自我保护机制、环境的影响，以及更为复杂的宿主感染等特性。
另外，近年来研究发现，细菌的基因组含有许多的非编码RNA，这些非编码RNA为研究细菌生命周期、病原机制以及抗药制备等方向提供了重要的参考依据。
因此，基于非编码RNA的研究成为了微生物遗传学的重要研究方向。
微生物遗传学的研究趋势随着技术的发展，微生物遗传学的研究方向也在不断的拓展和丰富。
未来微生物遗传学的发展趋势主要体现在以下几个方面：1. 基因组测序现在，微生物基因组测序技术越来越成熟，这种高通量的方法可以快速地获取微生物的基因信息。
因此，在微生物遗传学中使用基因组测序来研究微生物的功能、病原性、代谢、生理和与其他生命体的相互作用等方面将成为未来的重点方向。
2. 单细胞技术运用单细胞技术，可以通过分析单个微生物细胞的DNA、RNA及代谢产物等，以探究微生物群体内个体间的差异、基因转录水平的变化、细胞代谢和功能等方面，可以为微生物遗传学研究带来一个全新的视野和机会。
3. 宏基因组学宏基因组学主要用于研究微生物群体中的所有生物，这是通过分析DNA序列和群体基因组中基因功能的技术手段。
通过宏基因组学的研究方法，可以探究微生物群体之间的生态相互作用，发现微生物生态系统中隐藏的种群、功能、代谢物质和生物学随机性的可能性，并探讨微生物群体的转录调控和代谢特征等，是微生物遗传学中的一个重要的方向。
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—TALE核酸酶介导的基因组编辑技术 TALENs的研究进展及应用
生物工程 汇报人：张瑶
简介
• TALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶， TALENs是一种可靶向特异DNA序列的酶，它借助于 TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别 特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结 合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核 酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结 合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的 遗传物质。
• 江苏省医药动物实验基地转基因中心基于 TALENS和锌酯酶ZNF技术建立了快速体细胞 基因重组和小鼠敲除技术，可在3个月内获 得基因敲出小鼠或是体细胞重组克隆
基因组编辑技术转染至细胞的方法
• 虽然基因组编辑技术可以实现靶位点的基因突变，但是这项技术仍然受 到将这些酶有效转染进入相关细胞的限制。例如，核酸酶编码基因可通 过质粒DNA，病毒载体或体外转录的mＲNA 形式进入相关细胞。这些转 染方法可以根据细胞类型或应用性进行修改。但是，病毒和非病毒基因 的基因转染系统限制基因组编辑技术的可能应用。尤其是，质粒DNA 或m ＲNA 的电转染或脂质体转染对于某些细胞是有毒性且限制性。病毒载体 也具有一定的限制性，因为它们是复杂的，产量低，潜在的免疫原性和 调节阻碍。尽管有以上缺点，基于腺病毒介导ZFNs基因转染至T 细胞的临 床实验正在开展，但是未来,科研工作者将努力改善转染方法。 整合酶缺陷慢病毒是一种将锌指核酶转染至难转染细胞类型的有效替代 方式。但是，这一方法似乎不适用于高度重复性TALENs 序列［44］。尽 管与ZFNs 相比，TALENs 的合成较简单，但是其较难转染至细胞。腺病毒 载体的转染是ZFNs 的有效转染方式，并可以增加ZFNs 介导HDＲ 效率和增 强体内ZFNs 介导的基因校正［45-47］。腺相关病毒有效包装只适用于长 度小于4． 2 kb 的片段。虽然这只适用于ZFNs 单体和编辑供体结构，但是 单一带有小启动子的TALENs 单体可以插入这一载体。
注: TALENs 为转录激活因子样效应物核酸酶; Left TALENs 为识别突变位 点3'上游DNA 序列TALENs 质粒;Right TALENs 为识别突变位点5' 下游DNA 序列TALENs 质粒;NHEJ为非同源末端连接; HR为同源重组 图2 细胞通过同源重组的方式修复示意图
TALENs 的构建方法研究
TALENs技术路线图
TALEs 结构与TALENs
• TALEs 具有特殊的结构特征，包括N 端分泌信号、中央的DNA 结合域、1 个核定位信号 和C 端的激活域( Fig． 1A) ． 通过对目前发现的所有TALEs蛋白分析发现，TALEs 蛋白中 DNA 结合域有1 个共同的特点，不同的TALEs 蛋白的DNA 结合域是由数目不同的( 12 ～ 30 ) 、高度保守的重复单元组成，每个重复单元含有33 ～ 35 个氨基酸． 这些重复单元 的氨基酸组成相当保守，除了第12 和13 位氨基酸可变外，其它氨基酸都是相同的，这 两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基( repeatvariable di-residues，RVD) ( Fig． 1B ) ． TALEs 识别DNA 的机制在于每个重复序列的2 个RVD 可以特异识别DNA 的4 个碱基中的1 个，目前发现的RVD 共有5 种． 统计分析发现，HD( 氨基酸名称) 特异识 别C 碱基，NI ( 氨基酸名称) 识别A 碱基，NN( 氨基酸名称) 识别G 或A 碱基，NG( 氨基酸 名称)识别T 碱基，NS( 氨基酸名称) 可以识别A、T、G、C中的任一种( Fig． 1C) ． 通过 对天然TALE 的研究发现，TALEs 蛋白框架固定识别1 个T 碱基，所以靶序列总是以T 碱基 开始。 自然界中，不同TALEs 的DNA 结合域的氨基酸重复序列数目不同，因此，其结合靶DNA 的碱基数目也不同． TALEs 蛋白的这一特点可以用来设计基因组修饰的操作工具，理论 上可以根据实验目的对DNA 结合域的重复序列进行设计，得到特异识别任意序列靶位 点的TALEs，因而通过对TALEs 重复序列进行人工设计并将其与一些功能域融合产生的 dTALEs ( designer TALE-type transcription factors) 和TALENs( TALE nucleases ) 引起了人们极 大的兴趣［5，6］． 这些功能域包括激活子、抑制子、核酸酶、甲基化酶和整合酶等 ［7-9］． TALEs 的DNA 结合域与FokI 核酸内切酶的切割域融合，就产生了能够在特定 位点产生双链断裂( double strand break，DSB) 的嵌合酶———TALENs．
我们实验室经 过反复尝试，并 结合已经报道的 方法，总结了一 套可以特异结合 靶位点、实现基 因组定点修饰、 比较简单实用的 TALENs 的构建方 案( Fig． 4)
Fig． 4 Construction of designed TALENs The main steps to construct a designed TALEN were present． The steps surrounded by broken lines are Golden gate cloning strategy
原理
• TALENs充分利用植物病原菌黄单胞菌 (Xanthomonas)自然分泌的蛋白---即激活因子样 效应物(TAL effectors, TALEs)---的功能：该蛋白 能够识别特异性DNA碱基对。人们可以设计一 串合适的TALEs来识别和结合到任何特定序列， 如果再附加一个在特定位点切断DNA双链的核 酸酶，就可以构建出TALEN，利用这种TALEN就 可以在细胞基因组中引入新的遗传物质。相对 锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言， TALEN能够靶向更长的基因序列，而且也更容 易构建。
基因组编辑技术在模式动物中的应用
• 基因组编辑技术作为靶向修饰方式已经成功应用到生物学研究的模式 动物中，包括斑马鱼，大鼠，小鼠，果蝇，秀丽线虫和多种其他物种， 包括蝴蝶，青蛙和牛。TALSNs 也已被应用于研究比较相关物种的基因 功能。这一应用为研究较近物种的相似性和不同点，以及可能的同源 性基因对的分析提供了巨大便利 • 研究者通过微注射TALENs mＲNA 和单链DNA寡链核苷酸或带有延长 ( ＞ 800 bp) 同源臂的供体质粒至单细胞胚胎［39-40］，最终实现斑 马鱼中loxP 染色体整合，为此模式动物的传统基因激活提供了可能性。 除了有价值的动物模型，TALENs 已经应用于改造植物表型，包括拟南 芥和若干种类玉米，最终将像耐病和耐旱特性整合入植物［41-43］。 这些基因组编辑技术修饰的生物将毫无疑问的生长，进一步扩大基础 研究和基因组生物学的内容
其他基因组编辑技术-转座酶、重组酶和转录因子
• 近年来，人们对基因组编辑技术认识不断加深，应用日渐扩展，已经 应用于细胞和生物体的基因修饰。但是，靶向核酸酶的若干限制性 ( 如，基因组编辑技术的脱靶效应对于细胞的毒性的预测和检测的复 杂) 正在促进基因组编辑技术的程序酶的替代研究发展。此外，因为 靶向核酸酶依赖NHEJ 和HDＲ诱导基因突变，在特殊的细胞类型中可 能限制了DNA 修复机制的实现。为解决这一问题，锌指蛋白和TALEs 与酶切结构域结合，其中包括位点特异性重组酶，转座酶,从而催化 DNA 整合、缺失和插入。因为这些酶自动实现DNA 切割和再连接，所 以潜在的有毒性DNA 的双链断裂不会在基因组中聚集。此外，在应用 方面，人们往往希望可以靶向插入基因，重组酶和转座酶活性是以供 体DNA 插入至基因组为标志，因此脱靶效应可以直接检测。再者，转 座酶和重组酶的机制不依赖细胞DNA 修复途径。因此，这些方法几乎 适用于所有细胞和细胞生长阶段。这些过程的有效性也可以直接进化 改善，但是，重组酶和转座酶若要具有基因组编辑技术的功能，它们 需要改善其灵活性和效率，尤其，在重组酶催化结构域保持其识别序 列特异性，从而保证与靶位点特异结合，减少细胞毒性方面; 同样， 虽然转座酶融合证明在其靶位点具有高活性，这些合成蛋白也有显著 的脱靶危险。
•
Fig． 1 Structure and base sequence recognition of TALEN
注: NLS 为核定位信号; AD 为转录激活结构域; ＲVD 为重复可变双残基
图1 将转录激活样效应因子蛋白构建成转录激活样效应因子蛋白核酸酶示 意图
TALENs 基因敲除原理
• TALENs 的DNA 结合域与靶序列结合后，FokI形 成二聚体特异性切割DNA 序列，导致细胞中发 生的DNA 双链断裂。NHEJ 途径和同源重组 ( homologous recombination，HＲ) 途径在理论 上都可以用于对感兴趣的目的基因进行遗传改 造。NHEJ是一种较为简单的修复方式，但是保 真度不高，很容易造成DNA 断裂处的序列发生 改变，产生DNA的小片段插入和/或缺失 ( indel) ，进而造成基因突变。在存在同源序列 的情况下，细胞还可以通过HＲ 的方式进行修 复，不过效率相对较低( 见图2) 。
基因组编辑技术的临床应用
• 基因组编辑技术在疾病治疗中的应用代表基因治疗的巨大进步。 与传统治疗不同，ZFNs 和TALENs可以通过精确的基因修饰，彻 底治愈疾病的病因。目前，ZFN-诱导的同源定向修复已应用于X 连锁严重联合免疫缺陷症，B 型血友病，镰刀细胞病和α1-抗胰 蛋白酶缺乏的基因缺陷校正。在体外实验中，ZFNs可以纠正帕 金森病患者iPS 细胞SNCA 基因突变。经ZFN-诱导NHEJ 介导修复 是攻克HIV/AIDs 的重要策略。ZNFs 可通过破坏原代T 细胞和造 血干细胞/祖细胞的CCＲ5 基因实现HIV-1 的抗性HIV 并已经进入 临床实验阶段( NCT01252641，NCT00842634 和NCT01044654) 。 基因组编辑技术可以安全地插入治疗性转基因至人类基因组的 特异性安全位点。虽然基因组编辑技术的应用限制在体细胞， 但是在包括诱导多能干细胞( inducible pluripotent stem cells， iPSCs) 的干细胞研究中也取得了一定进展。这终将为包括自体 干细胞移植的基因治疗奠定重要基础.