southern印记杂交
Southern&northern&western杂交原理
Southern杂交Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。
一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。
Northern 印记杂交Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot 的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
Western杂交原理：是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。
其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。
先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。
四种分子杂交的原理及方法
Southern杂交基本概念及原理：Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。
一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA 片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。
Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。
其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。
但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。
有关这类数据资料可应用Southern 印迹杂交技术获得。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。
早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。
印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。
利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。
southern印迹杂交名词解释
southern印迹杂交名词解释Southern印迹杂交是生物学中一个重要的术语，它来源于美国生物学家Edwin Southern所发明的南方杂交技术。
这种技术通常用于DNA分子的检测与分析，在生命科学研究领域具有重要的应用价值。
1.什么是Southern印迹？Southern印迹，又称Southern blot，是一种通过琼脂糖凝胶电泳和酶解技术，将筛选出的DNA样本在膜上进行定向转移，并与特定探针杂交的技术，可以用于检测和分析目标DNA序列。
2.什么是杂交？杂交是指在DNA的两条链之间发生的配对作用。
它是生物学中基本的遗传现象，决定了每个个体的基因型和表型。
3.什么是南方杂交技术？南方杂交技术是一种高效的分子生物学技术，广泛用于分析DNA序列、检测特定基因等方面。
它利用核酸探针与目标DNA的互补配对关系，识别目标DNA序列。
在使用Southern blot技术时，DNA样品首先通过电泳将不同长度的DNA分离出来，然后将其转移到琼脂膜上。
接着，利用探针特异性杂交，标记目标DNA的特定区段。
最后，利用探针上的标记（如酶或荧光）将目标DNA区段从杂交物质中分离出来并检测，以获取样品的DNA序列和长度信息。
4. Southern印迹与Northern印迹、Western印迹有什么不同？Southern印迹用于检测已知DNA序列，与之对应的Northern印迹用于检测RNA序列，而Western印迹则是用来检测蛋白质。
三种印迹技术都是利用探针与目标分子的互补配对关系，识别目标分子，并将其从杂交物质中分离出来以便检测。
5. Southern印迹技术的应用Southern印迹技术具有广泛的应用价值。
它可以用于检测和鉴定病菌、遗传疾病、肿瘤等疾病相关基因，进行生物工程和基因工程的基因克隆和筛选，进行DNA序列测定和鉴定等。
不仅如此，该技术也可以应用于无机化学、有机化学、分析化学等领域。
总之，Southern印迹技术的出现和发展，促进了生命科学、医学和生物工程等领域的发展，也推动了DNA以及其他分子的检测和分析研究。
Southern杂交方法
分子植物病理学实验--Southern杂交（同位素标记，防止污染！注意物品的放置与处置，检测！）核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。
其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则退火形成双链，杂交的双方是待测核酸序列及探针。
膜上印迹杂交是指待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。
其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。
再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。
最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。
由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。
Southern印迹是指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。
（目的：分析遗传位点、拷贝数；多态性；来源；文库分析；基因敲除；亚克隆；基因分离与检测等）一、基因组DNA的提取（选择方法；提取要完全，CTAB\SDS:去多糖的，冷却后再加好；去上清液要适度）二、基因组DNA的酶切（注意：酶种类、浓度、酶切时间（少于16h）等因素）三、电泳（胶要倒平（平衡！！），厚度一致；胶越浓，孔越小）琼脂糖浓度0.8 %，4℃下低电压缓慢电泳，1V/cm。
四、转膜（为毛细管法，也可电转移）↓首先要在电泳盒中取出凝胶，修胶，切除无用的凝胶部分，将凝胶的左下角切去，以便于定位。
然后将凝胶置于一搪瓷盆中。
（注意：进样孔要切除，因其薄，易透液。
留14cm；切左下角以示标记；用胶片托转）↓将凝胶浸泡于0.25N HCl中10min使其脱嘌呤.↓将凝胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量的0.4N NaOH中变性20min。
Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介
Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介姜永均 (江苏省如东高级中学 226400)摘 要 Southern印迹杂交(Southern b l ot)是分子生物学领域中最常用的技术方法之一,该技术是1975年英国爱丁堡大学的E. M.Sou t h ern首创的,Sou t h ern印迹杂交故因此而得名。
后来相继出现了三个原理、过程相似,但是操作对象不同的印迹方法,缘于学界前辈的幽默分别将其称为N ort h ern b l ot、W estern blot和Eastern b l ot,这些技术的命名与发明人姓氏并没有关系。
本文简要介绍了Sou t hern印迹杂交及其相关生物技术。
关键词 Sou t hern印迹杂交 Northern印迹杂交 W estern印迹杂交 Eastern印迹杂交在近年的一些省、市中学生生物奥赛试卷中常涉及到Southern印迹、N outhern印迹、W este m印迹等分子生物学技术。
本文将Sout hern印迹杂交及其相关生物技术作一个简单介绍。
Souther n印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法,是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。
Souther n印迹杂交技术1975年由英国人埃德温 迈勒 萨瑟恩(Ed w i n M ellor Southern)创建。
1977年詹姆斯 艾尔文(Ja mes A l w ine)等把此方法应用到RNA的研究方面,称作Northern印迹法。
1979年乔治 斯塔克(G eor ge Stark)等则把该方法扩展应用到单向电泳后的蛋白质分子的分析方面,被称作W estern印迹法。
1982年Re i nhart报道双向电泳后蛋白质分子的印迹分析,称之为Eastern印迹法。
目前,有人把Sou hern、Nort hern、W esther印迹法分别称作DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法。
地高辛标记探针的Southern-杂交技术
地高辛标记探针的Southern 杂交技术根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交。
将已知的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的检测手段，在科学研究和实践中具有十分广泛的用途。
它可用于基因组特定DNA序列的定位，测定相关片段的同源性、从cDNA文库、基因组文库中筛选完整基因等。
还可以用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图—指纹分析等。
核酸杂交检测都是在滤膜上进行的，常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。
其基本过程包括以下几步。
首先将待检样品DNA或RNA分子直接点加到滤膜上，或经过凝胶电泳分离再通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印〞上去的，这个过程称为核酸印迹〔nucleic acid blotting〕转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法〔dot and slot blotting〕、菌落和嗜菌斑印迹法〔colony and plaque blotting〕；然后将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。
最后，经过放射自显影技术或光化学、免疫学技术显示出不同的颜色，根据颜色的有无和深浅判定结果。
根据操作方式和检测对象的不同，核酸杂交技术主要有以下几种：斑点杂交技术〔Dot blot〕、Southern杂交技术〔Southern blot〕、Northern杂交技术〔Northern blot〕。
前两者用于检测DNA，后者用于检测RNA。
本实验主要介绍Southern杂交技术。
1主要内容1. Southern Blot方法的原理。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳。
3. DNA转移至硝酸纤维素膜/尼龙膜与膜处理。
分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术 ppt
分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术摘要：上世纪70年代美籍华裔科学家简悦威采用Southern印迹杂交技术成功诊断了α地中海贫血症和镰状细胞贫血症，开创了临床分子生物学检验的先河，他是怎样做到的呢？知识点：分子杂交、核酸分子杂交、探针Southern印迹杂交、琼脂糖凝胶电泳技术、印迹技术临床分子生物学检验技术的发展第一阶段：分子杂交第二阶段：PCR第三阶段：生物芯片第四阶段：DNA测序美籍华裔科学家简悦威应用DNA分子杂交技术诊断α地中海贫血(1976)、镰状细胞贫血(1978)分子杂交(molecular hybridization) 两条单链核酸、抗原与抗体、受体与配体等经相互作用重新组成新的杂交分子图片源于网络非原创核酸分子杂交两条序列互补的单链核酸之间(DNA 与DNA ，DNA与RNA或RNA与RNA)借助氢键相连形成杂合双链碱基互补配对A=T,A=U,C≡G杂合双链图片源于网络非原创核酸分子杂交：待测核酸与探针图片源于网络非原创核酸探针 (nucleic acid probe)能与待测靶核酸特异互补杂交的已知被标记的核酸分子核酸探针的标记1.放射性核素标记：32P、3H、35S等2.非放射性标记：生物素、地高辛、荧光素等分子杂交(molecular hybridization)反应介质液相杂交固相杂交原位杂交印迹杂交Southern印迹杂交(E.M.Southern,1975) ——镰状细胞贫血症的分子诊断(1978)琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创琼脂糖凝胶电泳技术——分离、纯化、鉴定核酸 碱性缓冲液 琼脂糖凝胶 负极 正极核酸加样孔 电极琼脂糖凝胶电泳技术可将分子量和构象不同的核酸分子进行分离小分子量核酸电泳结束后不同分子量的核酸的迁移位置琼脂糖凝胶电泳技术图谱DNA Marker 核酸样品琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术印迹技术 (Blotting）将核酸分子通过一定方式转移并固定到固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上印迹技术膜核酸凝胶琼脂糖凝胶电泳技术Southern印迹杂交印迹技术分子杂交技术视频源于网络非原创应用Southern印迹检测红色特异DNA片段1. 从样品中提取DNA并通过限制性核酸内切酶消化样品DNA2.消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离3. 凝胶中DNA经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交6. 通过洗涤除去未杂交的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段Southern 印迹技术1. 通过限制性核酸内切酶消化样品DNA，2. 消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳技术分离，3. 凝胶上被分离好的DNA片段经碱处理变性成单链，4. 单链DNA经印迹技术从凝胶转移到膜上并固定，5. 附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交，6. 杂交后洗脱未特异结合的探针，经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA 片段杂交检测杂交信号预杂交制备携带标记的核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针图片源于网络非原创应用Southern印迹杂交技术诊断镰状细胞贫血？分子诊断的先河——Southern印迹杂交技术。
southern blot
实验名称：Southern 印迹杂交一、实验目的核酸杂交是分子生物学的一个重要手段，它应用于克隆鉴定，同源性分析，以及癌症、遗传疾病和致病细菌、病毒和寄生虫的分子诊断。
通过本实验了解和掌握Southern杂交的基本原理和操作。
二、实验原理根据DNA变性和复性发展的一种实验技术，就是分子杂交（hybridization)。
指两条来源不同但具有同源性的核酸单链在一定条件下，根据碱基互补的原则缔结成双链分子。
Southern杂交是指一种利用标记的探针与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。
其主要步骤包括：⑴基因组DNA的限制性酶切；⑵DNA酶切片段的电泳分离和转移；⑶杂交及检测。
基因组DNA采用实验五中制备的HL-60细胞基因组DNA，接着是将DNA进行限制性酶切；本实验检测的靶DNA为原癌基因c-myc，c-myc的致癌机理包括染色体异位和病毒基因组的插入突变而导致c-myc基因的过度表达。
基因的变化可通过Southern杂交检测。
c-myc基因的酶切位点有EcorI、ClaI、HindIII等，基因组DNA首先经限制内切酶酶切成较短的片段，经电泳分开，然后再经碱变性使DNA成为单链，有利于结合于膜上和进行下一步杂交。
转移是根据毛细管作用原理进行的。
单链DNA经高温烘烤定于膜上。
杂交是根据靶DNA单链与探针之间的碱基互补的原则进行。
本实验采用的探针为1.4kb的ClaI和EcorI酶切片段，对应于c-myc的第3个外显子的部分片段。
探针用非放射性标记物地高辛（DIG）标记。
杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色。
为了降低背景，减少标记探针的非特异性结合，一般先行预杂交，用牛血清白蛋白（BSA）、葡聚糖（Ficoll）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及去污剂SDS和十二烷基磺酸钠封闭膜上非特异结合位点，还在杂交液中加入小分子鲑精DNA作为竞争性封闭剂。
杂交一般在5或6xSSC和封闭剂的溶液中进行，水溶液中杂交温度为Tm-25°（65-70°）。
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Southern blot印迹杂交原理示意图
详细操作步骤
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一、 待测核酸样品的制备 二、 琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品 三、 电泳凝胶预处理 四、 转膜 五、 探针标记 六、 预杂交 七、 与标记分子杂交 八、 洗膜 九、 放射性自显影检测
电泳凝胶预处理
• DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构。为了
预杂交
• 将固定亍膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，
必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA 片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前， 必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭， 这就是预杂交的目的。 预杂交的DNA是与哺乳类动物的同源性极低，不 会与DNA探针DNA杂交
•
Southern blot技术优点：
进行有效地实现Southern印迹转移，对电泳凝胶做预处 理十分必要。分子量超过10kb的较大的DNA片段与较 短的小分子量DNA相比，需要更长的转移时间。所以为 了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须 将最长的DNA片段控制在大约2kb以下。DNA的大片段 必须被打成缺口以缩短其长度。因此，通常是将电泳凝 胶浸泡在0.25mol/L 的HCl溶液短暂的脱嘌呤处理之后， 移至于碱性溶液中浸泡，使DNA变性并断裂形成较短的 单链DNA片段，再用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓 冲液。这样，DNA片段经过碱变性作用，亦会使之保持 单链状态而易于同探针分子发生杂交作用。
• 将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到
一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上， 即印迹（blotting）
• 固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的
温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
• 电泳
基本操作步骤：
• 将基因组DNA进行限制性内切酶消化 • 琼脂糖凝胶电泳分离 • DNA的转移与固定 • 核酸杂交 • 用适当的方式显色与鉴定
Southern blot 分子杂交
讲解人: 苏维岚 周知航
Southern印记杂交介绍
• 印迹法(blotting)即转移电泳，
Southern印记杂交法亦称Fra bibliotekDNA印迹法。
• Southern建立了检测特异DNA片段的
DNA-RNA杂交法，称作Southern印迹 法。
Southern杂交技术原理
• 遗传病诊断 • DNA图谱分析 • PCR产物分析
遗传病诊断
• 临床水平层次 • 细胞水平 • 蛋白质水平 • 基因水平
无创DNA产前检测
21三体
13三体
That’s all, thank you !!
转膜
• 即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支
持物上。而此过程最重要的是保持各DNA 片段的相对位置不变。DNA是沿与凝胶平 面垂直的方向移出并转移到膜上，因此， 凝胶中的DNA片段虽然在碱变性过程已经 变性成单链并已断裂，转移后各个DNA片 段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位 置仍然一样，故而称为印迹（blotting）。
• Southern blot方法十分灵敏
注意事项：
• 1. 膜的大小及预杂交、杂交过程中所用试
剂的量可根据需要进行适当调整。 • 2．将凝胶中和至中性时，要测pH，防止 凝胶的碱性破坏硝酸纤维素膜。 • 3. 要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜 之间的气泡。
Southern 印迹杂交技术的应用