Southern杂交技术
实验七Southern印迹法
实验七Southern印迹法Southern印迹法是分子生物学中常用的 DNA 转移与杂交技术。
Southern印迹法的目的是分离 DNA 片段，并根据它们的长度和数量测定第一种样品中特定 DNA 片段的存在。
该方法是以 Edward M. Southern 1975 年提出的。
Southern印迹法是一种将 DNA 片段转移到硝酸纤维素膜上的技术。
该方法的基本原理是将目标 DNA 的片段分离出来，通过凝胶电泳分离出 DNA 后，将它转移到硝酸纤维素或其他荧光杂交膜上。
转移后进行 DNA 与膜的固定和预处理，然后涂上 DNA 探针发现和显示 DNA 片段的方法。
这些探针经常是标记的核酸分子，它们与目标 DNA 片段杂合并可以通过荧光或放射性探测器进行检测。
1. DNA 片段的制备从需要研究的DNA中，通过限制酶切或PCR扩增等方法，将所需 DNA 片段制备出来。
2. 电泳用琼脂糖电泳分离DNA片段，根据分子大小排列。
3. 转移将分离出的 DNA 片段转移到硝酸纤维素或其他荧光杂交膜上。
4. 增强和固定增强和固定DNA与膜之间的结合力，以便进行杂交。
5. 杂交将贴有 DNA 片段的膜和DNA探针，一起置于一定的条件下进行杂交，以检测特定的DNA 片段是否存在。
6. 洗涤和显影通过洗涤和显影等操作，观察到探针与 DNA 片段的杂交情况，以得到所需的信息。
Southern印迹法在生物学领域中的应用广泛。
它被广泛用于研究 DNA 片段，如发现基因缺失、揭示癌症的起源等方面的研究。
此外，它还可以用于检测利用基因工程技术制造的 DNA 片段与细胞内的核酸结合情况。
总之，Southern印迹法是一种常用的 DNA 分析方法，它可以用于很多领域，比如基因工程、细胞生物学、药物研究和疾病诊断等。
该方法分离DNA 片段的能力和灵敏度高，可以对 DNA 片段进行量化，是分子生物学中不可或缺的重要技术手段。
第16章 Southern杂交技术
第16章 Southern杂交技术根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交。
将已知的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA 进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的检测手段，在科学研究和实践中具有十分广泛的用途。
它可用于基因组特定DNA序列的定位，测定相关片段的同源性、从cDNA文库、基因组文库中筛选完整基因等。
还可以用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图—指纹分析等。
核酸杂交检测都是在滤膜上进行的，常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。
其基本过程包括以下几步。
首先将待检样品DNA或RNA分子直接点加到滤膜上，或经过凝胶电泳分离再通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，这个过程称为核酸印迹（nucleic acid blotting）转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法（dot and slot blotting）、菌落和嗜菌斑印迹法（colony and plaque blotting）；然后将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。
最后，经过放射自显影技术或光化学、免疫学技术显示出不同的颜色，根据颜色的有无和深浅判定结果。
根据操作方式和检测对象的不同，核酸杂交技术主要有以下几种：斑点杂交技术（Dot blot）、Southern杂交技术（Southern blot）、Northern杂交技术（Northern blot）。
前两者用于检测DNA，后者用于检测RNA。
本章主要介绍Southern杂交技术及其与斑点杂交技术的不同点。
而Northern杂交技术将在第17章介绍。
16.1主要内容1. Southern Blot方法的原理。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳。
实验十一 Southern杂交分析
的转移。
固定操作：将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：
如果你想采用 紫外交联的方法
（尼龙膜）
，烘烤（尼龙膜） ，烘烤（尼龙膜）
那么 将刚转好的湿润的尼龙膜DNA面向上放到保鲜膜上。 用紫外交联仪交联这块湿润的膜，DNA面向上。
DNA转移和固定 紫外光盒 或者商业化可用于紫外交联的其他设备
试剂 灭菌的双蒸水 pH8.0 灭菌的EDTA 地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者TE 缓冲液 洗涤缓冲液；马来酸缓冲液 检测缓冲液；TE缓冲液
2×SSC 或者20×SSC
杂交
尼龙膜，带正电荷 杂交袋或杂交管， 注意：当用地高辛杂 交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。
注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。
充分混合DIG-High Prime（1号管），并取4μL加入到变性DNA中， 混合并简单离心。
孵育1小时或者过夜。
注 意 ： 较 长 的 孵 育 时 间 （ 最 高 达 20 小 时 ） 能 够 提 高 地 高 辛 标 记 DNA的产量。
加入2 μL 0.2 M EDTA（pH 8.0）和/或 65℃加热10分钟终止反应。 注意：采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可 以从200 bp到1000 bp甚至更长，这主要取决于原始模板DNA的长 度。
杂交工作溶液的制备
分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶（7号瓶）中，然后 立即在37℃条件下搅拌5分钟进行溶解。
杂交温度
适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体 的公式如下：Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) {I=能够杂交上的片段的长度 ，以碱基对进行计算} Topt.= Tm -（20～25℃） 这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得 到的。 用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt. 要比计算出的Tm低20-25℃。 Topt. 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当 你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt（大约每1%的错 配要降低1.4℃），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤 温度）。
Southern 杂交技术-1
Southern 杂交技术-1Southern技术是指以Southern名字命名的DNA转移杂交技术。
它可用于基因组特定D NA序列的定位，可以测定相关片段的同源性、可以从c库、基因组文库中筛选完整基因等。
用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，随后，使DNA在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用已知核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。
该技术已成为分子生物学中一类重要的检测手段。
下面分别介绍利用光敏生物素试剂盒及DIG试剂盒进行杂交的方法。
十五－1:光敏生物素试剂盒杂交实验一仪器：分子杂交仪、摇床、烤箱、取液器、电泳仪、电泳槽二试剂：硫酸葡聚糖钠盐(可不用)、聚乙烯吡赂啉酮（PVP）、聚蔗糖、牛血清白蛋白（BSA）、100mM EDTA、3MnaAC、无水乙醇、电泳缓冲液、切变性鲱鱼精DNA （100ug/ml）20×SSC溶液氯化钠３Ｍ预杂交液６×SSC柠檬酸三钠 0.3M （含100ug/ul变性鲱鱼精DNA）pH 7.0 ５×Denhardt's 溶液0.5%SDS变性液 0.5M NaOH 中和液 1M Tris-HCL pH 7.41.5M NaCL 1.5M NaCL封闭液 3gBSA溶于70ml水中，浓盐酸调pH至3.0,煮沸20分钟后，冷至室温，NaOH调pH至7.5,加入10ml以下缓冲液（1M Tris-HCL pH7.5, MgCL2 0.19%, NaCL 5.8%, T riton X-100 0.05ml）定容至100ml５０×Denhardt's 溶液 1％PVP 1M PBS NaCL 0.8% pH 7.41%BSA KCL 0.02%1%聚蔗糖 Na2HPO4 0.144%KH2PO4 0.024%洗涤液Ａ:２×SSC,250ml中含0.1%SDSＢ：0.1×SSC,250ml中含0.1%SDS Ｃ：Tris-HCL 100mM pH 7.5 Ｄ：Tris-HCL 100mMNaCL 1M NaCL 0.5MMgCL2 2mM Tween 20 0.5% pH 7.5Triton X-100 0.05%亲和素－碱性磷酸酶溶液 Tris-HCL 100mMNaCL 1MMgCL2 2mMTriton X-100 0.05%pH 7.5碱性磷酸酶2-3单位/ml底物溶液 Tris-HCL 100mM pH 9.5 终止液NaCL 100mM Tris-HCL 10mMMgCL2 5mM EDTA 1mM。
southern杂交原理
southern杂交原理Southern杂交原理是一种分子生物学技术，常用于研究DNA序列。
它是由爱德华·南方（Edwin Southern）于1975年提出的，被广泛应用于DNA杂交等领域。
Southern杂交原理主要是通过将DNA样品与DNA探针杂交，然后用放射性同位素或化学荧光等方法检测杂交的情况，从而确定目标DNA序列的存在与否。
这一原理的核心是通过互补配对的碱基间形成稳定的双链结构，从而实现DNA的特异性识别与检测。
在Southern杂交实验中，首先需要提取待检测的DNA样品。
这可以通过细胞裂解、DNA纯化等方法来完成。
然后，将目标DNA序列与DNA探针进行杂交反应。
DNA探针是一段已知序列的DNA 片段，通常是标记有放射性同位素或荧光染料的单链DNA。
在杂交反应中，目标DNA序列与DNA探针通过互补配对的碱基结合在一起形成双链结构。
通过探针的标记物可以追踪杂交的情况。
放射性同位素通常用于探测杂交产物，而化学荧光则常用于非放射性检测。
完成杂交反应后，需要进行杂交产物的检测与分析。
对于放射性同位素标记的探针，可以通过放射性测量仪来检测杂交产物的放射性信号强度。
而对于化学荧光标记的探针，可以通过荧光显微镜或荧光成像仪来观察和记录荧光信号。
Southern杂交原理的应用非常广泛。
例如，它可以用于检测特定基因的存在与表达情况，研究基因组结构与功能，鉴定DNA的来源，进行亲缘关系分析等。
此外，Southern杂交还可以与其他分子生物学技术相结合，如聚合酶链反应（PCR），构建DNA文库等，进一步拓展其应用范围。
Southern杂交原理是一种重要的分子生物学技术，通过DNA的互补配对和标记物的检测，实现了对目标DNA序列的高度特异性识别与检测。
它在基础研究、临床诊断、法医学等领域具有广泛的应用前景，为科学研究和医学诊断提供了有力的工具和方法。
southern印迹杂交名词解释
southern印迹杂交名词解释Southern印迹杂交是生物学中一个重要的术语，它来源于美国生物学家Edwin Southern所发明的南方杂交技术。
这种技术通常用于DNA分子的检测与分析，在生命科学研究领域具有重要的应用价值。
1.什么是Southern印迹？Southern印迹，又称Southern blot，是一种通过琼脂糖凝胶电泳和酶解技术，将筛选出的DNA样本在膜上进行定向转移，并与特定探针杂交的技术，可以用于检测和分析目标DNA序列。
2.什么是杂交？杂交是指在DNA的两条链之间发生的配对作用。
它是生物学中基本的遗传现象，决定了每个个体的基因型和表型。
3.什么是南方杂交技术？南方杂交技术是一种高效的分子生物学技术，广泛用于分析DNA序列、检测特定基因等方面。
它利用核酸探针与目标DNA的互补配对关系，识别目标DNA序列。
在使用Southern blot技术时，DNA样品首先通过电泳将不同长度的DNA分离出来，然后将其转移到琼脂膜上。
接着，利用探针特异性杂交，标记目标DNA的特定区段。
最后，利用探针上的标记（如酶或荧光）将目标DNA区段从杂交物质中分离出来并检测，以获取样品的DNA序列和长度信息。
4. Southern印迹与Northern印迹、Western印迹有什么不同？Southern印迹用于检测已知DNA序列，与之对应的Northern印迹用于检测RNA序列，而Western印迹则是用来检测蛋白质。
三种印迹技术都是利用探针与目标分子的互补配对关系，识别目标分子，并将其从杂交物质中分离出来以便检测。
5. Southern印迹技术的应用Southern印迹技术具有广泛的应用价值。
它可以用于检测和鉴定病菌、遗传疾病、肿瘤等疾病相关基因，进行生物工程和基因工程的基因克隆和筛选，进行DNA序列测定和鉴定等。
不仅如此，该技术也可以应用于无机化学、有机化学、分析化学等领域。
总之，Southern印迹技术的出现和发展，促进了生命科学、医学和生物工程等领域的发展，也推动了DNA以及其他分子的检测和分析研究。
Southern杂交方法
分子植物病理学实验--Southern杂交（同位素标记，防止污染！注意物品的放置与处置，检测！）核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。
其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则退火形成双链，杂交的双方是待测核酸序列及探针。
膜上印迹杂交是指待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。
其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。
再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。
最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。
由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。
Southern印迹是指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。
（目的：分析遗传位点、拷贝数；多态性；来源；文库分析；基因敲除；亚克隆；基因分离与检测等）一、基因组DNA的提取（选择方法；提取要完全，CTAB\SDS:去多糖的，冷却后再加好；去上清液要适度）二、基因组DNA的酶切（注意：酶种类、浓度、酶切时间（少于16h）等因素）三、电泳（胶要倒平（平衡！！），厚度一致；胶越浓，孔越小）琼脂糖浓度0.8 %，4℃下低电压缓慢电泳，1V/cm。
四、转膜（为毛细管法，也可电转移）↓首先要在电泳盒中取出凝胶，修胶，切除无用的凝胶部分，将凝胶的左下角切去，以便于定位。
然后将凝胶置于一搪瓷盆中。
（注意：进样孔要切除，因其薄，易透液。
留14cm；切左下角以示标记；用胶片托转）↓将凝胶浸泡于0.25N HCl中10min使其脱嘌呤.↓将凝胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量的0.4N NaOH中变性20min。
southern杂交
Southern杂交概述Southern杂交是一种常用于分析DNA序列和判定基因组结构的实验技术。
该技术由英国分子生物学家爱德华·南方于1975年首次提出，并以他的名字命名。
Southern杂交操作简单，适用于各种生物材料，被广泛应用于基因组学和分子生物学研究领域。
原理Southern杂交的原理基于亲和性结合和DNA互补碱基配对的特性。
该技术通过将待检测的DNA样品与一段标记的DNA探针进行杂交，通过探针与待检测样品DNA的配对形成稳定的双链DNA形式。
随后，通过探针上的标记进行检测，从而确定目标DNA序列的存在与否。
步骤Southern杂交主要包括以下几个步骤：1.DNA提取：从样本中提取待检测的DNA。
2.DNA消解：将DNA样本通过限制性内切酶消解为较小的DNA片段。
3.凝胶电泳：将消解后的DNA片段在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，根据DNA片段的大小形成DNA条带。
4.DNA定位：将凝胶中的DNA片段转移到薄膜或膜纸上。
5.杂交处理：将转移到膜上的DNA片段与一段标记的DNA探针进行杂交，探针可以是放射性同位素标记的DNA或荧光标记的DNA等。
6.杂交条件优化：调整温度、盐浓度和杂交时间等条件，以提高杂交效率和特异性。
7.杂交探测：通过探针上的标记进行检测，如放射性同位素检测或荧光检测。
8.数据分析：根据杂交的结果，确定目标DNA序列的存在与否。
应用Southern杂交技术在许多生物学研究中得到广泛应用，主要包括以下几个方面：1.基因型分析：可以通过Southern杂交技术确定目标基因的存在、拷贝数和序列变异等信息。
2.基因组结构研究：可以通过Southern杂交技术确定目标基因组的结构和大小。
3.DNA重组检测：可以通过Southern杂交技术检测DNA重组事件的发生和定位。
4.DNA甲基化分析：可以通过Southern杂交技术研究DNA甲基化修饰的分布和变化。
5.遗传疾病诊断：可以通过Southern杂交技术检测遗传疾病相关基因的缺失、重复或突变等。
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二、Southern杂交的基本原理
• 利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切 、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定 量分析、基因突变分析及限制性片断长度多 态性分析（RFLP）等。
三、Southern 杂交的主要步骤
1、待测DNA样品的制备、酶切 2、待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖
第16 讲
核酸分子杂交
ห้องสมุดไป่ตู้------Southern杂交
基本内容
一、核酸分子杂交技术 二、Southern杂交的原理 三、Southern杂交的主要步骤 四、Southern杂交的应用 五、课堂小结 六、作业
一、核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术是分子生物学中最常用的基本技术之一。
1、基本原理：
具有一定序列同源性的两条核酸单链在一定的条件下
特性：
检测特异性强；灵敏度高；对酶促反应无任 何影响，也不影响碱基配对的特异性和稳定 性；易造成放射性污染；半衰期短的同位素 应用受到限制，随用随标记，立即使用，不 能长时间存放。
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
⑤非放射性标记 • 优点：无环境污染，可较长时间贮存 • 要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无
凝胶电泳
3、凝胶中DNA的变性：碱变性 4、Southern转膜：
–硝酸纤维素膜 (NC) 、尼龙膜 – 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空
转移法
三、Southern 杂交的主要步骤
4、Southern转膜：
三、Southern 杂交的主要步骤
4、Southern转膜：
三、Southern 杂交的主要步骤
同源性比较，与非靶区域的同源性不应超过70%或有连 续8个或更多的碱基同源。
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备 ③探针的种类
cDNA 探针、基因组DNA探针、寡 核苷酸探针、RNA探针等。
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
④放射性探针标记物
[α-*N]-dNTP 、32p(14d)、35S(87d)、 3H(12y)、125I(60d)、14C、131I
滤膜（固相）杂交
一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的 分类：
③膜杂交：用标记DNA 或RNA探针检测固定 在硝酸纤维素（NC） 膜上的DNA序列。 Brown等应用这一技 术评估了爪蟾rRNA 基 因的拷贝数。
一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交 的分类：
④原位杂交：菌落 原位杂交；组织 原位杂交；染色 体原位杂交等。
二、Southern杂交的基本原理
• Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：
一是将待测定DNA分子通过一定的方法转移
并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜 或尼龙膜）上，即印迹（blotting）; 二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一
定的温度和离子强度下退火，即核酸分子杂
交过程。
二、Southern杂交的基本原理
一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的分类：
②固相杂交：将参加反应的一条核酸链先 固定在固体支持物上，另一条游离在溶 液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、 尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。 固相杂交时，未杂交的游离片段可容易 地漂洗除去，膜上的杂交物容易检测和 能防止靶DNA自我复性等优点，故该法最 为常用。
– 荧光素：如FITC、罗丹明类等，可以被紫外线激发出荧光进行观察 ，主要适用于细胞原位杂交。
– 化学发光：一些标记物可与另一物质反应而产生化学发光现象，可以 像放射性核素一样直接对X-光胶片进行曝光，这类标记物可能是今后 研究的主流。
• 该技术是1975年英国爱丁堡大学的 E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故 因此而得名。
• 早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性 后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维 膜上。近年来印迹方法和固定支持滤膜都有 了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转 移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（ 如APT、ABM纤维素膜）等。
4、Southern转膜：
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备 ①探针的选择原则
高度的特异性 制备探针的难易性 检测手段的灵敏法
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
②探针设计原则 • 长度：10~50bp
• 碱基成分:G+C含量为40%~60% • 探针分子内无互补序列。 • 避免同一碱基重复出现。 • 一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因序列进行
按碱基互补配对原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异 性的，但杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全 互补。
杂交的双方是待测核酸序列及探针。将核酸从细胞分
离纯化后可在体外与探针杂交，也可直接在细胞或组织内进 行原位杂交。
一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的分类：
①液相杂交：将探针与靶 序列在溶液中杂交，通 过平衡密度梯度离心分 离杂交体。杂交后过量 的未杂交探针在溶液中 除去较为困难，误差较 高。该法很慢、费力且 不精确，但它开拓了核 酸杂交技术的研究。
一、核酸分子杂交技术
2、核酸分子杂交的分类：
⑤生物芯片 ：高通量，高效的最新生物技术。
一、核酸分子杂交技术
3、核酸杂交过程：不同来源的两条核酸单链由 于具有互补序列，在一起复性时，互补序列配 对，形成杂化分子。
一、核酸分子杂交技术
3、核酸杂交过程：
一、核酸分子杂交技术
4、影响因素
*离子强度(高-消除静电斥力-利于杂交) *温度（低于Tm 20-25℃） *有机试剂（去离子甲酰胺）-降低Tm *样品/探针分子的大小和复杂程度 *洗涤条件（高严谨性，洗去非特异性结合探针） *支持物 *添加物（吸附DNA探针，使DNA接触面增大）
特异亲和性、分子量小，对探针杂交无影 响或影响甚小，不影响DNA三维空间构象的 形成。
三、Southern 杂交的主要步骤
5、探针的制备
⑤非放射性标记
分类：
– 半抗原：目前使用较多的非放射性标记物是生物素和地高辛，它们都 是半抗原，可以利用这些半抗原的抗体进行免疫检测。
– 配体：生物素还是一种抗生物素蛋白(卵白素，avidin)和链霉菌类抗 生物素蛋白(strep tavidine)的配体，可以利用亲和法进行检测。