Southern杂交实验
实验七Southern印迹法
实验七Southern印迹法Southern印迹法是分子生物学中常用的 DNA 转移与杂交技术。
Southern印迹法的目的是分离 DNA 片段，并根据它们的长度和数量测定第一种样品中特定 DNA 片段的存在。
该方法是以 Edward M. Southern 1975 年提出的。
Southern印迹法是一种将 DNA 片段转移到硝酸纤维素膜上的技术。
该方法的基本原理是将目标 DNA 的片段分离出来，通过凝胶电泳分离出 DNA 后，将它转移到硝酸纤维素或其他荧光杂交膜上。
转移后进行 DNA 与膜的固定和预处理，然后涂上 DNA 探针发现和显示 DNA 片段的方法。
这些探针经常是标记的核酸分子，它们与目标 DNA 片段杂合并可以通过荧光或放射性探测器进行检测。
1. DNA 片段的制备从需要研究的DNA中，通过限制酶切或PCR扩增等方法，将所需 DNA 片段制备出来。
2. 电泳用琼脂糖电泳分离DNA片段，根据分子大小排列。
3. 转移将分离出的 DNA 片段转移到硝酸纤维素或其他荧光杂交膜上。
4. 增强和固定增强和固定DNA与膜之间的结合力，以便进行杂交。
5. 杂交将贴有 DNA 片段的膜和DNA探针，一起置于一定的条件下进行杂交，以检测特定的DNA 片段是否存在。
6. 洗涤和显影通过洗涤和显影等操作，观察到探针与 DNA 片段的杂交情况，以得到所需的信息。
Southern印迹法在生物学领域中的应用广泛。
它被广泛用于研究 DNA 片段，如发现基因缺失、揭示癌症的起源等方面的研究。
此外，它还可以用于检测利用基因工程技术制造的 DNA 片段与细胞内的核酸结合情况。
总之，Southern印迹法是一种常用的 DNA 分析方法，它可以用于很多领域，比如基因工程、细胞生物学、药物研究和疾病诊断等。
该方法分离DNA 片段的能力和灵敏度高，可以对 DNA 片段进行量化，是分子生物学中不可或缺的重要技术手段。
实验十一 Southern杂交分析
的转移。
固定操作：将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：
如果你想采用 紫外交联的方法
（尼龙膜）
，烘烤（尼龙膜） ，烘烤（尼龙膜）
那么 将刚转好的湿润的尼龙膜DNA面向上放到保鲜膜上。 用紫外交联仪交联这块湿润的膜，DNA面向上。
DNA转移和固定 紫外光盒 或者商业化可用于紫外交联的其他设备
试剂 灭菌的双蒸水 pH8.0 灭菌的EDTA 地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者TE 缓冲液 洗涤缓冲液；马来酸缓冲液 检测缓冲液；TE缓冲液
2×SSC 或者20×SSC
杂交
尼龙膜，带正电荷 杂交袋或杂交管， 注意：当用地高辛杂 交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。
注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。
充分混合DIG-High Prime（1号管），并取4μL加入到变性DNA中， 混合并简单离心。
孵育1小时或者过夜。
注 意 ： 较 长 的 孵 育 时 间 （ 最 高 达 20 小 时 ） 能 够 提 高 地 高 辛 标 记 DNA的产量。
加入2 μL 0.2 M EDTA（pH 8.0）和/或 65℃加热10分钟终止反应。 注意：采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可 以从200 bp到1000 bp甚至更长，这主要取决于原始模板DNA的长 度。
杂交工作溶液的制备
分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶（7号瓶）中，然后 立即在37℃条件下搅拌5分钟进行溶解。
杂交温度
适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体 的公式如下：Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) {I=能够杂交上的片段的长度 ，以碱基对进行计算} Topt.= Tm -（20～25℃） 这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得 到的。 用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt. 要比计算出的Tm低20-25℃。 Topt. 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当 你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt（大约每1%的错 配要降低1.4℃），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤 温度）。
Southern 杂交技术-1
Southern 杂交技术-1Southern技术是指以Southern名字命名的DNA转移杂交技术。
它可用于基因组特定D NA序列的定位，可以测定相关片段的同源性、可以从c库、基因组文库中筛选完整基因等。
用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，随后，使DNA在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用已知核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。
该技术已成为分子生物学中一类重要的检测手段。
下面分别介绍利用光敏生物素试剂盒及DIG试剂盒进行杂交的方法。
十五－1:光敏生物素试剂盒杂交实验一仪器：分子杂交仪、摇床、烤箱、取液器、电泳仪、电泳槽二试剂：硫酸葡聚糖钠盐(可不用)、聚乙烯吡赂啉酮（PVP）、聚蔗糖、牛血清白蛋白（BSA）、100mM EDTA、3MnaAC、无水乙醇、电泳缓冲液、切变性鲱鱼精DNA （100ug/ml）20×SSC溶液氯化钠３Ｍ预杂交液６×SSC柠檬酸三钠 0.3M （含100ug/ul变性鲱鱼精DNA）pH 7.0 ５×Denhardt's 溶液0.5%SDS变性液 0.5M NaOH 中和液 1M Tris-HCL pH 7.41.5M NaCL 1.5M NaCL封闭液 3gBSA溶于70ml水中，浓盐酸调pH至3.0,煮沸20分钟后，冷至室温，NaOH调pH至7.5,加入10ml以下缓冲液（1M Tris-HCL pH7.5, MgCL2 0.19%, NaCL 5.8%, T riton X-100 0.05ml）定容至100ml５０×Denhardt's 溶液 1％PVP 1M PBS NaCL 0.8% pH 7.41%BSA KCL 0.02%1%聚蔗糖 Na2HPO4 0.144%KH2PO4 0.024%洗涤液Ａ:２×SSC,250ml中含0.1%SDSＢ：0.1×SSC,250ml中含0.1%SDS Ｃ：Tris-HCL 100mM pH 7.5 Ｄ：Tris-HCL 100mMNaCL 1M NaCL 0.5MMgCL2 2mM Tween 20 0.5% pH 7.5Triton X-100 0.05%亲和素－碱性磷酸酶溶液 Tris-HCL 100mMNaCL 1MMgCL2 2mMTriton X-100 0.05%pH 7.5碱性磷酸酶2-3单位/ml底物溶液 Tris-HCL 100mM pH 9.5 终止液NaCL 100mM Tris-HCL 10mMMgCL2 5mM EDTA 1mM。
实验六 southern杂交ECL检测
实验六水稻基因组DNA的Southern杂交与非放射性ECL直接核酸标记及检测【实验目的】通过本实验学习和掌握Southern转膜、辣根过氧化物酶直接标记探针、Southern杂交及增强化学发光（ECL）检测分子杂交结果的过程。
【实验原理】Southern杂交是一项在复杂的背景基因中识别特异性DNA序列的重要技术之一，它是Southern于1975年首创的杂交方法。
其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链DNA在一定的条件下可按碱基互补原则（A=T,C=G）形成双链。
杂交的双方是待测核酸序列及标记的探针。
此杂交过程是高度特异性的。
ECL直接核酸标记及检测系统用辣根过氧化物酶（HRP）直接标记探针。
该法用带正电荷的核酸标记试剂（经修饰成为带正电荷的HRP聚合体：HRP—对苯醌—聚乙烯亚胺复合物）与变性过的、带负电荷的单链核酸探针松散连接，然后加入戊二醛，在戊二醛的化学交联作用下与带负电荷的单链DNA共价结合，从而标记DNA。
标记的探针DNA与膜上的单链DNA杂交形成双链DNA，探针上的HRP在H2O2存在下，催化H2O2还原，同时使鲁米诺氧化并伴随蓝光产生，在增强剂的作用下使产生的光加强，从而可在X光片上检测。
首先将经限制性内切酶酶解的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳分离以及在凝胶上经NaOH处理使之变性，然后将尼龙膜（Hybond-N+）放在凝胶上，使之按原有顺序将条带转移至膜上并固定起来，这是Southern 转膜过程。
Southern膜杂交是将吸附并固定在Hybond-N+尼龙膜上的DNA片段与一个标记的探针杂交，最后经过显影从Ｘ光片上显现出杂交分子的区带。
本实验中，经琼脂糖凝胶电泳分离的水稻基因组DNA酶切产物，通过Southern转移，将其吸印在Hybond-N+尼龙膜上，通过辣根过氧化物酶直接标记探针，与膜上的水稻DNA进行杂交，再用增强的化学发光方法得到分子杂交结果。
本实验所用的探针来源于水稻和大麦，具有抗病基因NBS-LRR结构特点的DNA探针，因此水稻DNA 和探针之间有较好的同源性，可得到杂交带，可满足初学者对Southern杂交方法进行训练。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。
在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。
下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。
步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。
DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。
可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。
2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。
细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。
3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。
4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。
步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。
根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。
2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。
3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。
启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。
4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。
步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。
Southern blotting实验方法
Southern 杂交的实验方法Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。
通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。
该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。
但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交。
但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。
一、基因组DNA的制备（前述）二、基因组DNA的限制酶切根据实验目的决定酶切DNA的量。
一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。
购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。
为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。
消化的DNA浓度不宜太高，以0.5μg /μl 为好。
由于内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。
具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入DNA（1μg /μl） 20 μg10×酶切buffer 4.0 μl限制性内切酶（10U/μl） 5.0 μl加ddH2O 至 500 μl在最适温度下消化1-3hr。
消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。
如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。
或者放大反应体积，或者补充酶再消化。
如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降。
消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA，以终止消化。
然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提，2.5倍体积乙醇沉淀，少量TE溶解（参见DNA提取方法，但离心转速要提高到12000g，以防止小片段DNA的丢失）。
southern blot
实验名称：Southern 印迹杂交一、实验目的核酸杂交是分子生物学的一个重要手段，它应用于克隆鉴定，同源性分析，以及癌症、遗传疾病和致病细菌、病毒和寄生虫的分子诊断。
通过本实验了解和掌握Southern杂交的基本原理和操作。
二、实验原理根据DNA变性和复性发展的一种实验技术，就是分子杂交（hybridization)。
指两条来源不同但具有同源性的核酸单链在一定条件下，根据碱基互补的原则缔结成双链分子。
Southern杂交是指一种利用标记的探针与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。
其主要步骤包括：⑴基因组DNA的限制性酶切；⑵DNA酶切片段的电泳分离和转移；⑶杂交及检测。
基因组DNA采用实验五中制备的HL-60细胞基因组DNA，接着是将DNA进行限制性酶切；本实验检测的靶DNA为原癌基因c-myc，c-myc的致癌机理包括染色体异位和病毒基因组的插入突变而导致c-myc基因的过度表达。
基因的变化可通过Southern杂交检测。
c-myc基因的酶切位点有EcorI、ClaI、HindIII等，基因组DNA首先经限制内切酶酶切成较短的片段，经电泳分开，然后再经碱变性使DNA成为单链，有利于结合于膜上和进行下一步杂交。
转移是根据毛细管作用原理进行的。
单链DNA经高温烘烤定于膜上。
杂交是根据靶DNA单链与探针之间的碱基互补的原则进行。
本实验采用的探针为1.4kb的ClaI和EcorI酶切片段，对应于c-myc的第3个外显子的部分片段。
探针用非放射性标记物地高辛（DIG）标记。
杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色。
为了降低背景，减少标记探针的非特异性结合，一般先行预杂交，用牛血清白蛋白（BSA）、葡聚糖（Ficoll）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及去污剂SDS和十二烷基磺酸钠封闭膜上非特异结合位点，还在杂交液中加入小分子鲑精DNA作为竞争性封闭剂。
杂交一般在5或6xSSC和封闭剂的溶液中进行，水溶液中杂交温度为Tm-25°（65-70°）。
Southern杂交实验
Southern 杂交实验Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。
如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
一、溶液配制(1)20 X SSC(1000 mL) :组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠NaCl 175.32g柠檬酸钠88.26gNaOH调PH值到7.0，高温高压灭(2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20.Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20ºC)Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(4)检测缓冲液Detection buffer 100ml组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20ºC)Tris 1.21g,NaCl 0.584gMgCl2 1.01g调ph值到9.5(5)变性溶液(500 mL)： 1 mol／L NaCl (43.83 g)， 0.5 mol／L NaOH (10 g)，(6)中和溶液(500 mL)：0.5 mol / L Tris (30.27 g)，3 mol／L NaCl (87.66 g)，用1 mol／L HCl调(7)5 × TBE (250 mL)：13.5g Tris 6.9g硼酸, 0.9 g EDTA-Na2，定容250 mL(8)6 ×溴酚蓝载样液：0.25 ％溴酚蓝，40 ％蔗糖(9)4 mol／L EDTA 100 mL(10)1M Tris-HCl (pH 8.0): 称取12,。
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Southern 杂交实验Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。
如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
一、溶液配制(1)20 X SSC(1000 mL) :组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠NaCl 175.32g柠檬酸钠88.26gNaOH调PH值到7.0，高温高压灭(2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20.Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20ºC)Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(4)检测缓冲液Detection buffer 100ml组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20ºC)Tris 1.21g,NaCl 0.584gMgCl2 1.01g调ph值到9.5(5)变性溶液(500 mL)： 1 mol／L NaCl (43.83 g)， 0.5 mol／L NaOH (10 g)，(6)中和溶液(500 mL)：0.5 mol / L Tris (30.27 g)，3 mol／L NaCl (87.66 g)，用1 mol／L HCl调(7)5 × TBE (250 mL)：13.5g Tris 6.9g硼酸, 0.9 g EDTA-Na2，定容250 mL(8)6 ×溴酚蓝载样液：0.25 ％溴酚蓝，40 ％蔗糖(9)4 mol／L EDTA 100 mL(10)1M Tris-HCl (pH 8.0): 称取12,。
114g Tris-base, 溶于80ml 蒸馏水中，用HCl 调pH 至8.0后，用蒸馏水定容之100ml，高压灭菌，分装保存。
(11)0.5M EDTA (pH 8.0): 称取18.61g EDTA，溶于80ml蒸馏水中，用NaOH调pH至8.0后，用蒸馏水定容之100ml，高压灭菌，分装保存。
(12)T E buffer ：取1M Tris-HCl (pH 8.0) 5ml，0.5M EDTA (pH 8.0) 1ml，用蒸馏水定容至500ml，调pH至8.0后，高压灭菌，分装保存。
(13)10% SDS：称取10g SDS，溶于90ml蒸馏水中，68℃加热溶解，用盐酸调pH至7.2，定容至100ml。
(14)低严谨度洗膜液：将20 X的SSC 用蒸馏水稀释成2 X SSC，并按照100:1( 2X SSC: 10% SDS) 加入10% SDS，配成2 XSSC 0.1% SDS。
(15)高严谨度洗膜液：将20 X的SSC 用蒸馏水稀释成0.5 X SSC，并按照100:1(0.5 X SSC: 10% SDS) 加入10% SDS，配成0.5XSSC 0.1% SDS。
(16)B locking Solution: 用Maleic acid buffer 将6#中的10 X Blocking Solution稀释成1X的工作液，现配现用。
(17)A ntibody Solution :将4#试剂离心，按照1:5000加入Blocking Solution，2-8℃可保存12小时，即每5ml Blocking Solution中加1ul Ab抗体，与地高辛标记探针结合。
(18)C olor substrate solution (显色液)：将5#试剂按照1:50 用Detection buffer稀释，即从5#中取100ul 加入5ml Detection buffer，要避光，现配现用，用于显示抗体结合位点。
(19)杂交液DiG Easy Hyb：将64ml 无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37 ºC摇动溶解5min。
二、基因组DNA的提取采用CTAB法微量提取植物总DNA：(1) 取叶片0.1～0.2g，剪碎，加入到2mL Eppendorf管中液氮研磨。
(2) 加入2 X CTAB 800μl, 65ºC水浴保温30min，不时颠倒混匀；(3) 加入等体积800μl 的24 :1，混匀10中；(4) 室温下12000rpm离心15min；(5) 重复步骤（3）一次(6) 小心将上清吸入新的1.5ml离心管中；(7) 加入等体积异丙醇，颠倒混匀；(8) -20 ℃放置30min以上，出现絮状DNA沉淀；12000rpm离心15min ，弃掉上清；(9) 75％乙醇洗涤1～2次，晾干沉淀；(10) 加入2uL RNaseA（10ug/uL），37ºC处理20min，除去RNA。
(11) 加40ul ddH2O溶解DNA，-20℃贮存备用三、酶切与电泳分离(1) 酶切反应体系1μg /μl15 μg10×酶切buffer 30 μl限制性内切酶（10U/μl） 6 μl加ddH2O 至300 μl(2) 混匀后于37ºC酶切16h，酶切完成后，取3μl酶切反应物电泳分析，检测酶切效果(3) 酶切完成后，用等体积氯仿抽提，0.1倍体积的3mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇混匀后于—20 o C沉淀1h，(4) 12000g，4ºC离心10min，小心弃上清，加入500μl 70% 乙醇洗一遍，离心2 min，弃上清，少量TE或dd H2O溶解。
四、琼脂糖凝胶电泳(1) 用0.5 X TBE 配制0.8% 的琼脂糖凝胶，凝胶厚度约为0.5 cm。
(2) 待凝胶充分凝固后，在点样孔中依次加入：阳性对照：质粒酶切产物，阴性对照：水及检测样品。
(3) 加入电泳缓冲液至刚好与胶面持平，加100 V电压，电泳5 min 待溴酚蓝进入胶中后，将电压降至50 V 电泳3-4 h，(4) 电泳结束后，)染色，长波紫外线下观察电泳结果，用1 张保鲜膜覆盖在凝胶上，复制下各分子量参照物及各DNA 样品带的位置，在凝胶旁置 1 标尺照像五、变性与转膜(1) 将胶浸于4倍体积的变性溶液中，在摇床上温和摇动2 X 15 min，变性液要能没过胶。
(2) 将胶在双蒸水中稍微洗涤，然后放入4倍体积的中和溶液中，在摇床上温和摇动2 X 15 min，中和液要能没过胶。
(3) 转膜：20×SSC浸湿一张whatman 3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一个―桥‖，凝胶反放在浸湿的whatman 3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。
(4)照凝胶的大小剪一张尼龙膜（长，宽略大0.2cm，剪去与凝胶对应的一角）。
膜放在凝胶上。
(5)尼龙膜上放一张whatman 3mm滤纸（长，宽略小0.2cm）一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.2～0.5kg的物品。
在20×SCC的转移缓冲液中充分转移18～24h及时换掉浸湿的吸水纸。
(6) 固定：将膜在2 X SSC 溶液中短暂漂洗，除去过多的盐分，然后DNA 结合面朝上，放在一张干净的滤纸上晾干后，夹在两层滤纸中间，120ºC 烘箱中30 min，或者80ºC 2h，促进DNA与尼龙膜结合。
六、预杂交与杂交(1) 预杂交DiG Easy Hyb：将64ml 无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37 ºC摇动溶解5min，预热一定体积的DiG Easy Hyb（10ml/100cm2膜）至杂交温度42ºC 。
预杂交60min，在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液中42ºC下充分润湿。
（此过程可以延长至数小时）(2) 探针变性：Dig标记的探针1ul（约25ng/ml）加40µl H2O, 95 ºC变性10min后迅速放在冰上冷却10min。
(3) 杂交：将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2）中，混匀，避免泡沫，倒出预杂交液，加入探针和DIG Easy Hyb混合液，继续在42 ºC下温浴过夜（单拷贝探针）。
含有探针的DiG Easy Hyb杂交液可重复利用，杂交结束后放入离心管中于-20 ºC保存，可重复使用几次，只需在使用前于68 ºC处理10min即可,不要煮沸DiG Easy Hyb杂交液七、洗膜与显色(1) 洗膜：2×SSC，0.1% SDS室温下洗涤5分钟，洗2次。
0.5×SSC，0.1% SDS 65-68ºC温和振荡15分钟，洗2次(2) 免疫与显色：a. 杂交和洗膜后，用马来酸缓冲液（Washing Buffer，Buffer1）浸泡1-5minb. 在100ml 1×Block solution（Buffer2）中温育30minc. 用1×Block solution（Buffer2）稀释抗体–DIG-抗原偶联物至150mU/ml（1:5000）d. 用10ml antibody solution处理膜30mine. 用100ml马来酸洗膜15min，洗2次f. 在20ml detection buffer（Buffer3）中平衡2-5ming. 在8ml 新鲜配制的color substrate solution中处理膜5分钟，放在塑料袋或盒中，保持黑暗中。
注意不要在显色过程中摇动(颜色沉淀在几分钟内开始出现，在16h内完成显色反应(在显色过程中膜可在光亮处短暂暴露几次)。
h. 5h后斑点出现，可在20ml水中洗膜5min中止反应。
i. 结果照像。