southern杂交实验方法和步骤
实验七Southern印迹法
实验七Southern印迹法Southern印迹法是分子生物学中常用的 DNA 转移与杂交技术。
Southern印迹法的目的是分离 DNA 片段，并根据它们的长度和数量测定第一种样品中特定 DNA 片段的存在。
该方法是以 Edward M. Southern 1975 年提出的。
Southern印迹法是一种将 DNA 片段转移到硝酸纤维素膜上的技术。
该方法的基本原理是将目标 DNA 的片段分离出来，通过凝胶电泳分离出 DNA 后，将它转移到硝酸纤维素或其他荧光杂交膜上。
转移后进行 DNA 与膜的固定和预处理，然后涂上 DNA 探针发现和显示 DNA 片段的方法。
这些探针经常是标记的核酸分子，它们与目标 DNA 片段杂合并可以通过荧光或放射性探测器进行检测。
1. DNA 片段的制备从需要研究的DNA中，通过限制酶切或PCR扩增等方法，将所需 DNA 片段制备出来。
2. 电泳用琼脂糖电泳分离DNA片段，根据分子大小排列。
3. 转移将分离出的 DNA 片段转移到硝酸纤维素或其他荧光杂交膜上。
4. 增强和固定增强和固定DNA与膜之间的结合力，以便进行杂交。
5. 杂交将贴有 DNA 片段的膜和DNA探针，一起置于一定的条件下进行杂交，以检测特定的DNA 片段是否存在。
6. 洗涤和显影通过洗涤和显影等操作，观察到探针与 DNA 片段的杂交情况，以得到所需的信息。
Southern印迹法在生物学领域中的应用广泛。
它被广泛用于研究 DNA 片段，如发现基因缺失、揭示癌症的起源等方面的研究。
此外，它还可以用于检测利用基因工程技术制造的 DNA 片段与细胞内的核酸结合情况。
总之，Southern印迹法是一种常用的 DNA 分析方法，它可以用于很多领域，比如基因工程、细胞生物学、药物研究和疾病诊断等。
该方法分离DNA 片段的能力和灵敏度高，可以对 DNA 片段进行量化，是分子生物学中不可或缺的重要技术手段。
Southern杂交实验
Southern 杂交实验Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。
如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
一、溶液配制(1)20 X SSC(1000 mL) :组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠NaCl 175.32g柠檬酸钠88.26gNaOH调PH值到7.0，高温高压灭(2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20.Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20ºC)Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(4)检测缓冲液Detection buffer 100ml组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20ºC)Tris 1.21g,NaCl 0.584gMgCl2 1.01g调ph值到9.5(5)变性溶液(500 mL)： 1 mol／L NaCl (43.83 g)， 0.5 mol／L NaOH (10 g)，(6)中和溶液(500 mL)：0.5 mol / L Tris (30.27 g)，3 mol／L NaCl (87.66 g)，用1 mol／L HCl调(7)5 × TBE (250 mL)：13.5g Tris 6.9g硼酸, 0.9 g EDTA-Na2，定容250 mL(8)6 ×溴酚蓝载样液：0.25 ％溴酚蓝，40 ％蔗糖(9)4 mol／L EDTA 100 mL(10)1M Tris-HCl (pH 8.0): 称取12,。
southern杂交
Southern杂交概述Southern杂交是一种常用于分析DNA序列和判定基因组结构的实验技术。
该技术由英国分子生物学家爱德华·南方于1975年首次提出，并以他的名字命名。
Southern杂交操作简单，适用于各种生物材料，被广泛应用于基因组学和分子生物学研究领域。
原理Southern杂交的原理基于亲和性结合和DNA互补碱基配对的特性。
该技术通过将待检测的DNA样品与一段标记的DNA探针进行杂交，通过探针与待检测样品DNA的配对形成稳定的双链DNA形式。
随后，通过探针上的标记进行检测，从而确定目标DNA序列的存在与否。
步骤Southern杂交主要包括以下几个步骤：1.DNA提取：从样本中提取待检测的DNA。
2.DNA消解：将DNA样本通过限制性内切酶消解为较小的DNA片段。
3.凝胶电泳：将消解后的DNA片段在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，根据DNA片段的大小形成DNA条带。
4.DNA定位：将凝胶中的DNA片段转移到薄膜或膜纸上。
5.杂交处理：将转移到膜上的DNA片段与一段标记的DNA探针进行杂交，探针可以是放射性同位素标记的DNA或荧光标记的DNA等。
6.杂交条件优化：调整温度、盐浓度和杂交时间等条件，以提高杂交效率和特异性。
7.杂交探测：通过探针上的标记进行检测，如放射性同位素检测或荧光检测。
8.数据分析：根据杂交的结果，确定目标DNA序列的存在与否。
应用Southern杂交技术在许多生物学研究中得到广泛应用，主要包括以下几个方面：1.基因型分析：可以通过Southern杂交技术确定目标基因的存在、拷贝数和序列变异等信息。
2.基因组结构研究：可以通过Southern杂交技术确定目标基因组的结构和大小。
3.DNA重组检测：可以通过Southern杂交技术检测DNA重组事件的发生和定位。
4.DNA甲基化分析：可以通过Southern杂交技术研究DNA甲基化修饰的分布和变化。
5.遗传疾病诊断：可以通过Southern杂交技术检测遗传疾病相关基因的缺失、重复或突变等。
Southern杂交分析原理和操作
Southern杂交分析原理和操作【原理】Southern杂交是分子生物学的经典实验方法。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。
通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。
一．基因组DNA的限制酶切【操作】DNA (1μg/ml)20μg、10×酶切buffer5.0μl、限制性内切酶(lOU /μl) 5.0μl、加ddH2O至50μl,在最适温度下消化1～3h。
消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。
如果消化效果不好,可以延长消化时间,但超过6h己没有必要。
或者放大反应体积,或者补充酶再消化。
如仍不能奏效,可能的原因是DNA样品中有太多的杂质,或酶的活力下降。
消化后的DNA 加入1/10体积的0.5mol/L EDTA,以终止消化。
然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提,2.5倍体积乙醇沉淀,少量TE溶解(参见DNA提取方法,但离心转速要提高到12000g,以防止小片段DNA的丢失)。
如果需要两种酶消化DNA,而两种酶的反应条件可以一致,则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致,则先用需要低离子强度的酶消化,然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度,再加第二种酶进行消化。
二．基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳【操作】1.制备0.8%凝胶一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。
2. 电泳电泳样品中加人6×Loading缓冲液,混匀后上样,留一或两泳道加DNAMarker。
1～2V/cm,DNA从负极泳向正极。
电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时,停止电泳。
取出凝胶,紫外灯下观察电泳效果。
在胶的一边放置一把刻度尺,拍摄照片。
正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带,照片摄人刻度尺是为了以后判断信号带的位置,以确定被杂交的DNA长度。
三．DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物【操作】1.碱变性室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。
Southern 杂交试验方案—本实验室
Southern 杂交试验方案一、探针标记1、探针标记严格按照罗氏试剂盒说明书进行；2、标记探针检测：取标记产物和普通PCR扩增产物各1μl，1.0%的琼脂糖凝胶电泳。
由于大分子量的DIG掺入，标记产物泳动速度比普通PCR产物要慢。
所以根据电泳图就可以判断是否标记上和有没有非特异标记！其余标记产物-20℃保存。
如果要准确检测标记效率（一般不必），取标记产物1μl和Dig标记的对照DNA，用DNA 稀释液按10倍系列稀释后点样于带正电荷尼龙膜上。
用紫外交联仪或真空烘烤固定DNA探针，按杂交检测方法进行信号检测，然后与膜条上的Dig标记的对照DNA信号强度对比，推算出标记的探针浓度。
如初始模板量较大，可取1μl标记产物稀释10~100倍后定量。
二、基因组DNA酶切1、采用EcoRI和一对甲基化敏感同裂酶HPaIl、MspI消化高粱基因组DNA 5ug，3 Unit/ug DNA，50uL反应体系，在37℃条件下酶切消化10h。
2、酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳（电压小于1v/cm，12h）分离。
凝胶在0.2mol/L的HCl 中脱嘌呤处理，至溴酚蓝变为黄色，弃去HCl后用蒸馏水洗几次，然后以0.4mol/L的NaOH 为转移液，利用毛细管作用将DNA转移到Hybond N+尼龙膜上，转移过夜后将膜取出夹放于滤纸间，80℃烘烤2小时。
常温放于干燥处保存备用。
（转膜：1、将胶裁成9.8cm×8.0cm 大小，于平皿中用蒸馏水冲洗一次；（此步一定记好胶的大小，后面裁纸/膜以及杂交液体积的选择都要用到）2、加入100ml 0.25 mol/L 的盐酸脱嘌呤，室温振荡15~30 min，至溴酚蓝完全变成黄色。
（如果限制性片段＞10kb，酸处理时间可适当延长；若限制性片段很小，此步可省略）3、用蒸馏水冲洗2 次。
加入变性液（1.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaOH）室温振荡20~30min；至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。
在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。
下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。
步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。
DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。
可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。
2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。
细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。
3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。
4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。
步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。
根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。
2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。
3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。
启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。
4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。
步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。
Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介
Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介姜永均 (江苏省如东高级中学 226400)摘 要 Southern印迹杂交(Southern b l ot)是分子生物学领域中最常用的技术方法之一,该技术是1975年英国爱丁堡大学的E. M.Sou t h ern首创的,Sou t h ern印迹杂交故因此而得名。
后来相继出现了三个原理、过程相似,但是操作对象不同的印迹方法,缘于学界前辈的幽默分别将其称为N ort h ern b l ot、W estern blot和Eastern b l ot,这些技术的命名与发明人姓氏并没有关系。
本文简要介绍了Sou t hern印迹杂交及其相关生物技术。
关键词 Sou t hern印迹杂交 Northern印迹杂交 W estern印迹杂交 Eastern印迹杂交在近年的一些省、市中学生生物奥赛试卷中常涉及到Southern印迹、N outhern印迹、W este m印迹等分子生物学技术。
本文将Sout hern印迹杂交及其相关生物技术作一个简单介绍。
Souther n印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法,是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。
Souther n印迹杂交技术1975年由英国人埃德温 迈勒 萨瑟恩(Ed w i n M ellor Southern)创建。
1977年詹姆斯 艾尔文(Ja mes A l w ine)等把此方法应用到RNA的研究方面,称作Northern印迹法。
1979年乔治 斯塔克(G eor ge Stark)等则把该方法扩展应用到单向电泳后的蛋白质分子的分析方面,被称作W estern印迹法。
1982年Re i nhart报道双向电泳后蛋白质分子的印迹分析,称之为Eastern印迹法。
目前,有人把Sou hern、Nort hern、W esther印迹法分别称作DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法。
southern_杂交实验流程
SOUTHERN BLOTTING实验操作流程A.小麦基因组DNA的提取1)采集5g鲜嫩的小麦幼苗，将其剪成2cm左右的片段，用液氮冷冻后在研钵中将其研成粉末（研磨15min左右）。
2)将研磨好的样品转移到预冷的50ml离心管中，加入20ml预热的S buffer，颠倒混匀。
S Buffer成分100mM Tris.Cl pH8.5100mM NaCl50mM EDTA pH8.02％ SDS3)于65℃水浴锅中温育1-2h，并不时轻柔混匀。
4)加入20ml（等体积的）酚/氯仿，轻柔地颠倒混匀，直至呈乳状（注意：保证混匀。
为有效除去蛋白，此步可以重复）。
5)用水平转子离心机以2000rpm的转速离心20-30min。
6)加入等体积的氯仿，轻柔地颠倒混匀，2000rpm离心20min。
7)转移上清到1个灭菌的50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置一段时间，用玻璃勾将DNA钩出。
8)用70％的乙醇清洗DNA 2-3次后，将其挑在玻璃钩上晾干，然后溶解在5ml 1×TE中。
9)待DNA完全溶解后接入10μl RNase，于37℃恒温箱中温育1h。
10)加入等体积的酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，以2000rpm的转速离心15min。
11)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，以2000rpm的转速离心15min。
12)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入1/10 体积 3M pH 5.0的乙酸钠（终浓度为0.3M），混匀后再加入2倍体积95％的乙醇，混匀。
13)用玻璃勾将DNA钩出，然后用70％的乙醇清洗2-3次，晾干后加入1.8-2ml 1×TE溶解。
14)待DNA完全溶解后，取1μL DNA电泳，检测DNA的浓度和完整性。
15)DNA样品可以放在4℃保存备用。
B.小麦基因组DNA的酶切1）通常情况下采用下列酶进行谷类作物DNA分析。
识别6碱基序列的酶识别4碱基序列的酶Apa I Hind III Bam HI Alu I Mbo I Hha ISal I Bgl I Sst I Dde I Msp I Taq IDra I Pvu II Eco RV Hae III Rsa I Hinf IEco RI Xba I2）如果一次酶切DNA的量在10μg左右，一般采用30μL反应体系。
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southern杂交实验方法和步骤
一、主要仪器：
离心机
恒温水浴锅
Orbital shaker恒温摇床
Poner PAC300核酸电泳仪
VersaDoc凝胶成像系统
水平摇床
HL-2000Hybrilinker分子杂交仪
烘箱
二、主要材料
whatman3mm滤纸尼龙膜吸水纸玻璃板玻璃棒废旧胶片方形果盘平板
三、主要试剂
RNase A
真菌基因组提取试剂盒
DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I
DNA Maker
NaOH，NaCl，浓盐酸，Tris碱，柠檬酸钠，马来酸
四、试剂准备
变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl；
Southern blot中和液：0.5mol/L Tris-HCl（pH=7.5），1.5mol/L NaCl；
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，浓盐酸调节pH至7.0；
2×SSC：取100mL20×SSC溶液，灭菌去离子水定容至1L；
2×SSC+0.01%SDS：取100mL20×SSC溶液，10mL10%SDS，灭菌去离子水定容至1L；
0.5×SSC0.01%SDS：取25mL20×SSC溶液，10mL10%SDS，灭菌去离子水定容至1L；
洗涤缓冲液：0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH7.5，0.3%（v/v）Tween20；
马来酸缓冲液：0.1M马来酸，0.15M NaCl，用NaOH（固体）调节pH值至7.5；
检测缓冲液：0.1Tris-HCl，0.1M NaCl，pH9.5；
封阻溶液：将DIG试剂盒内的6号瓶置于37℃水浴锅中预热，充分溶解后，取12mL，与108mL马来酸缓冲液混匀备用（新鲜配制，立即使用）；
抗体溶液：将DIG试剂盒内的4号管10000rpm高速离心5min，取4µL上清，加入20mL封阻溶液中，备用；
底物显色液：取20mL检测缓冲液，避光加入400µL DIG试剂盒内的5号管。
五、实验安排
确定实验样本，查找序列，进行酶切位点及探针设计，并合成引物；
培养样本，配制杂交所用试剂，PCR探针合成，回收，质量检测，DIG标记探针；
提取样本基因组，检测基因组质量，酶切预实验；
正式酶切，电泳，转膜；
烘干固定，预杂交，杂交过夜；
洗膜，显色。
六、大量真菌基因组的提取
取绿僵菌孢子接种于20mL的1/4SDAY培养液中，250rpm×28℃培养2d；抽滤收集菌丝，灭菌水冲洗3次以上；将抽滤的菌丝加液氮速冻后研磨成粉末，研磨3次以上，取约500mg粉末至2mL的离心管中，按照真菌基因组提取试剂盒的方法步骤依次进行操作：
①加入400μL的LE Buffer，震荡使其充分混匀，再加入4μL的100mg/mL的RNaseA，混匀，置于65℃水浴锅中温浴半小时；
②加入130μL DA Buffer，混匀后冰浴5min后14000g高速离心3min；
③将离心后上清转移到新的1.5ml的PE管中，加入750μL E Binding Buffer，充分混匀，将混合液体转移到Spin colum中，6000g离心1min，弃去管中液体；
④向Spin colum中加入500μL G Binding Buffer，10000g高速离心30s，弃去管中液体；
⑤向Spin colum中加入600μL Wash Buffer，10000g高速离心30s，弃去管中液体；
⑥重复上一步；
⑦再次将Spin colum于10000g高速离心1min，并将Spin colum放置在一个新的1.5ml离心管上；
⑧室温静置3min，向Spin colum中加入40μL灭菌去离子水，室温放置1min，12000g高速离心1min。
检测提取得到的基因组的质量和浓度。
七、Southern blot验证敲除转化子
①基因组酶切：
将敲除转化子和野生型菌株的基因组用X1和X2双酶切，反应体系如下：
10×FD buffer 4.5μl
X12μl
X22μl
样品DNA6μg
ddH2O水至45μl
总体积45μL
37℃恒温反应2h。
②电泳分离
酶切1.5h后，取2μL酶切DNA样品于1%的琼脂糖凝胶上进行检测，判断酶切程度。
当酶切充分时，制备1%的琼脂糖电泳凝胶，样品中加入10×loading buffer，于30-40V稳压电泳4-5h（包括DNA Marker和阳性对照质粒），电泳完成之后，切下样品及质粒部分的凝胶，剩余DNA Marker部分则单独浸泡在添加了10μL10 mg/ml溴化乙锭（EB）的100mL1×TAE buffer中染色30min。
③电泳凝胶预处理
1)将凝胶浸于适量变性液中（浸没凝胶），室温，于水平摇床上低速晃动15 min，并重复一次；
2)再将凝胶浸于灭菌的ddH2O中，室温，轻轻晃动10min；
3)将凝胶浸在中和液中，室温轻轻晃动15min，并重复一次；
4)在20×SSC缓冲液中平衡凝胶10min以上。
④转膜
1)裁剪一张大小合适（19cm×20cm）的whatman3mm滤纸，经20×SSC buffer 浸湿后，放在比凝胶稍大的支撑平台上，两端浸入20×SSC buffer，形成一个“桥”；
2)将与凝胶等大的滤纸Ⅰ放在搭好桥的滤纸上，再将凝胶放置于滤纸Ⅰ上（凝胶背面向上放置），切掉左上角，注意两者之间杜绝气泡；
3)裁剪尼龙膜，与凝胶等大，放置在凝胶上，利用玻棒使其平整，杜绝气泡出现；
4)将三张与膜等大的whatman3mm滤纸放在膜上，利用玻棒使其平整后，放置一叠与凝胶大小一致的吸水纸，并用玻璃板作为放置重物的平台，压在吸水纸上，再添加500g左右的砝码；
5)用塑料隔板封闭凝胶四周，以防止吸水纸通过接触凝胶的边缘而直接接触平板造成液流的短路，
6)转移3小时后，将浸湿的吸水纸换掉，添加干燥的吸水纸，整个转移过程为18-24h，期间根据吸水纸湿润情况换纸1-2次；
7)DNA在膜上的固定：将完成转移后的尼龙膜置于2×SSC缓冲液中短暂洗涤1min，放置于两张滤纸中，120℃烘箱中烘干固定30min。
⑤杂交
1)预杂交：将尼龙膜上没有固定DNA的一面贴瓶壁，放入杂交瓶中，加入42℃预热的Hyb高效杂交液（Hyb-100）(10mL/100mm2)，置于42℃杂交炉中预杂交2h；
2)标记探针：用引物TF和TR进行PCR扩增制备探针，胶回收产物，再按照DIG试剂盒的操作说明标记探针，并用PCR产物纯化试剂盒纯化探针；
3)探针变性：将纯化后的探针沸水中水浴变性10min，立即置于冰上，冰浴2min（现用现备）；
4)杂交：弃去预杂交液，往杂交瓶中加入新的Hyb高效杂交液（10mL/100㎜2），再加入6μL变性好的探针（5-20ng/mL杂交液），混匀，置于杂交炉中42℃杂交过夜。
⑥洗膜及DIG信号检测
1)杂交后，室温下，20mL2×SSC+0.1%SDS洗膜5min，重复一次；
2)将0.1×SSC+0.1%SDS洗液置于65℃水浴锅中预热后，加入20mL进杂交瓶中，65℃洗涤15min，重复一次；
3)将膜取出，置于平板中，加入20mL洗涤缓冲液中轻轻晃动5min，倒掉液体；
4)加入100mL阻断液反应30min（在摇床上轻轻摇动），倒掉液体；
5)加入20mL含有抗体的缓冲液，摇动孵育30min后，倒掉液体；
6)再加入100mL洗涤缓冲液洗涤15min，倒掉液体后，重复此步骤一次；
7)加入20mL检测缓冲液，平衡5分钟；
8)将膜放在盛有底物显色液的盒中（10mL显色液/100mm2），15-25℃避光孵育3-5h；
9)当显色到适合的效果后用水洗膜5min，扫描结果。