southern blot 杂交
southernblot知识
一、Southern杂交问题1：电泳后发现凝胶中DNA扩散，导致结果难以确定，如何解决这一问题？解决方案：（1）在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶及时处理使凝胶干燥；（2）琼脂糖的质量应该较好，尤其是不应含有内切酶，否则有时将使低拷贝数基因的杂交结果难以解释。
问题2：传统方法中转膜不完全的问题如何克服？解决方案：经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至24小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,因此,转膜不完全。
向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度较快,转移效率高。
利用地高辛标记探针进行 Southern 杂交时，对于大于15kb的 DNA片断，转膜之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率, 但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的 DNA 被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。
如果实验转膜过程中同时含有大于 15kb的DNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸，这样既可以提高大片断 DNA 的转移效率，又不会打碎小片段DNA。
另外，等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法，来解决这一难题：以转基因鼠的检测为例，实验步骤如下：1.转基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF 基因为构件，建立转基因小鼠。
转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾DNA做Southern进行鉴定。
2.琼脂糖凝胶直接杂交:(l)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液，取少量电泳检查酶切完全后，上样电泳8小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分钟，转置中和液(0.5MTrisHCl，0.15MNaCl)20分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置30分钟。
实验十一 Southern杂交分析
的转移。
固定操作：将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：
如果你想采用 紫外交联的方法
（尼龙膜）
，烘烤（尼龙膜） ，烘烤（尼龙膜）
那么 将刚转好的湿润的尼龙膜DNA面向上放到保鲜膜上。 用紫外交联仪交联这块湿润的膜，DNA面向上。
DNA转移和固定 紫外光盒 或者商业化可用于紫外交联的其他设备
试剂 灭菌的双蒸水 pH8.0 灭菌的EDTA 地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者TE 缓冲液 洗涤缓冲液；马来酸缓冲液 检测缓冲液；TE缓冲液
2×SSC 或者20×SSC
杂交
尼龙膜，带正电荷 杂交袋或杂交管， 注意：当用地高辛杂 交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。
注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。
充分混合DIG-High Prime（1号管），并取4μL加入到变性DNA中， 混合并简单离心。
孵育1小时或者过夜。
注 意 ： 较 长 的 孵 育 时 间 （ 最 高 达 20 小 时 ） 能 够 提 高 地 高 辛 标 记 DNA的产量。
加入2 μL 0.2 M EDTA（pH 8.0）和/或 65℃加热10分钟终止反应。 注意：采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可 以从200 bp到1000 bp甚至更长，这主要取决于原始模板DNA的长 度。
杂交工作溶液的制备
分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶（7号瓶）中，然后 立即在37℃条件下搅拌5分钟进行溶解。
杂交温度
适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体 的公式如下：Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) {I=能够杂交上的片段的长度 ，以碱基对进行计算} Topt.= Tm -（20～25℃） 这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得 到的。 用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt. 要比计算出的Tm低20-25℃。 Topt. 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当 你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt（大约每1%的错 配要降低1.4℃），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤 温度）。
蛋白核酸杂交转印膜(PVDF膜和尼龙膜)介绍
蛋白、核酸杂交转印膜（PVDF、尼龙膜）技术介绍转印膜：用于蛋白质和核酸的转移和检验过程的微孔膜。
Southern blot：又称Southern 印迹杂交，是研究DNA 图谱的基本技术。
Northern blot：又称Northern 印迹杂交，与Southern blot 方法类似，是检测RNA的基本技术。
Western blot：又称Western 印迹杂交，与Southern blot 方法类似，是蛋白质检测分析的基本技术。
转印膜在蛋白质和核酸的转移和检测过程中应用广泛，不同的转印膜规格和参数不同，选择正确、均一稳定的转印膜对达到最佳的实验结果起到关键性的作用。
常用的转印膜对比：常用的三种转印膜：硝酸纤维素膜（NC 膜）、带正电的尼龙膜（N66膜）、聚偏氟乙烯膜（PVDF膜）。
C ob e t t er三种转印膜结合DNA或RNA的能力：带正电尼龙膜>PVDF膜>硝酸纤维素膜。
三种转印膜机械强度比较：硝酸纤维素膜较脆，易破碎，不能重复使用；尼龙膜和PVDF 膜机械强度较高，可重复使用。
带正电的尼龙膜可结合短至10bp核酸片段，因此是最理想的核酸杂交转印膜。
PVDF膜机械强度高、耐高温，是蛋白印迹最理想的转印膜。
Cobetter专为蛋白核酸杂交研发了性能优良的转印膜，Cobetter杂交转印膜的种类如下：retteboC⏹N66尼龙转印膜⏹N66尼龙带正电荷转印膜⏹PVDF疏水转印膜⏹PVDF亲水转印膜Cobetter转印膜孔径有0.45um、0.22um 两种。
CobetterN66尼龙转印膜：相比起硝酸纤维素膜而言，其机械强度高，在经历多次杂交、洗脱和标记后不易产生破损和变形，可重复使用，非常适用于核酸检测。
制模过程中通过特殊的表面改性方法嫁接了亲水性的基团，使用过程中不需要再做预润湿处理。
通过在膜表面嫁接羟基基团，改变其表面电荷性能（正电），使得其能紧密结合DNA 而降低背景，快速结合DNA。
SouthernBlot印记杂交常见问题解析
Southern Blot印记杂交常见问题解析1、针对不同的实验材料，southern杂交实验难度有差异么？答：不同的实验材料，在进行试验过程中难度差异很大，例如玉米、小麦、葡萄的Southern杂交检测难度要比普通的材料要大。
(1)、物种本身的基因组较大（例如小麦），检测操作难度大(2)、材料本身含有高糖多酚（例如葡萄）严重影响酶切操作(3)、物种品系复杂（例如玉米），在基因组信息研究层面还不透彻。
2、核酸质量对southern杂交实验的影响答：核酸质量对实验的影响是直接的，既要求客户提供的总量足够——实验消耗（上样量），又要求保证质量——按要求准备材料。
上样量指的是基因组DNA酶切消化后，回收后的DNA片段的量。
根据不同物种的基因组大小不同，上样量也有所区别。
基因组越大，上样量越多。
例如，拟南芥大概需要3ug ，酵母3ug，人8ug，小麦15ug。
酶切消化之后不能直接上样，需要回收纯化。
回收会有损失，最多能损失一半，所以需要客户提供足够量的样品，一般要求至少20 ug的基因组DNA。
（以上上样量均为一个泳道）DNA 样品一般对 OD 值和浓度有如下要求：OD260/280=1.8～2.0，OD260/230＞2.0，浓度≥100 ng/ul 。
同时，需要对 DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示该 DNA 样品无蛋白质和 RNA 等物质污染，无降解弥散，条带清晰。
（如图所示）3、探针设计是怎么回事，有哪些原则？答：探针就是与待测目的基因序列同源的一段地高辛标记的DNA序列，可以和酶切后的基因组片段特异性的结合。
探针设计有如下几个原则: (1)、长度适中。
探针的片段长度一般控制在300-1000bp，探针太长时会导致非特异性结合的概率增加，探针太短时，探针结合的地高辛标记物太少，会导致发光信号减弱。
(2)、特异性强。
最佳的探针序列是仅与目的基因同源，与整个基因组序列的同源片段低于30%。
southern印迹杂交名词解释
southern印迹杂交名词解释Southern印迹杂交是生物学中一个重要的术语，它来源于美国生物学家Edwin Southern所发明的南方杂交技术。
这种技术通常用于DNA分子的检测与分析，在生命科学研究领域具有重要的应用价值。
1.什么是Southern印迹？Southern印迹，又称Southern blot，是一种通过琼脂糖凝胶电泳和酶解技术，将筛选出的DNA样本在膜上进行定向转移，并与特定探针杂交的技术，可以用于检测和分析目标DNA序列。
2.什么是杂交？杂交是指在DNA的两条链之间发生的配对作用。
它是生物学中基本的遗传现象，决定了每个个体的基因型和表型。
3.什么是南方杂交技术？南方杂交技术是一种高效的分子生物学技术，广泛用于分析DNA序列、检测特定基因等方面。
它利用核酸探针与目标DNA的互补配对关系，识别目标DNA序列。
在使用Southern blot技术时，DNA样品首先通过电泳将不同长度的DNA分离出来，然后将其转移到琼脂膜上。
接着，利用探针特异性杂交，标记目标DNA的特定区段。
最后，利用探针上的标记（如酶或荧光）将目标DNA区段从杂交物质中分离出来并检测，以获取样品的DNA序列和长度信息。
4. Southern印迹与Northern印迹、Western印迹有什么不同？Southern印迹用于检测已知DNA序列，与之对应的Northern印迹用于检测RNA序列，而Western印迹则是用来检测蛋白质。
三种印迹技术都是利用探针与目标分子的互补配对关系，识别目标分子，并将其从杂交物质中分离出来以便检测。
5. Southern印迹技术的应用Southern印迹技术具有广泛的应用价值。
它可以用于检测和鉴定病菌、遗传疾病、肿瘤等疾病相关基因，进行生物工程和基因工程的基因克隆和筛选，进行DNA序列测定和鉴定等。
不仅如此，该技术也可以应用于无机化学、有机化学、分析化学等领域。
总之，Southern印迹技术的出现和发展，促进了生命科学、医学和生物工程等领域的发展，也推动了DNA以及其他分子的检测和分析研究。
southern杂交
Southern流程示意 Southern流程示意
基因组DNA 基因组DNA
限制性酶切
DNA限制片段 DNA限制片段
琼脂糖凝胶电泳
转 膜
转移缓冲液
பைடு நூலகம்与标记探针杂交 检测
盖子 两层长滤纸 三层湿滤纸 凝胶 n+ 尼龙膜 三层湿滤纸 十层干滤纸 10cm吸水纸 10cm吸水纸
转膜
即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。而此过 程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。DNA是沿与凝胶 平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此，凝胶中的DNA片段虽 然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂，转移后各个DNA片段 在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，故而称为印 迹（blotting）。用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素 膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等，转膜时 可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。其中常用的是 NC膜和Nylon膜。各种膜的性能和使用情况比较见各种尼龙膜性 能及使用情况比较表。
与标记分子杂交
• （一）原理 • 转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的探针 转印后的滤膜在预杂交液中温育 ， DNA（探针 预先经加热变性成为单链DAN分子），即可进行杂 分子）， （探针DNA预先经加热变性成为单链 预先经加热变性成为单链 分子），即可进行杂 交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜， 交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜， 然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高， 然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高，杂交的 严格程度越高，也就是说， 严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源 性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。 性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。 • （二） 步骤 • 1.将标记的 将标记的DNA探针置沸水浴 探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min， ，迅速置冰上冷却 ， 将标记的 探针置沸水浴 变性。 使DNA变性。 变性 • 2.从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋，剪开一角，将变 从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋， 从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋 剪开一角， 性的DNA探针加到预杂交液中。 探针加到预杂交液中。 性的 探针加到预杂交液中 • 3.尽可能除取袋中的空气，封住袋口，滞留在袋中的气泡要尽可 尽可能除取袋中的空气， 尽可能除取袋中的空气 封住袋口， 能地少，为避免同位素污染水浴， 能地少，为避免同位素污染水浴，将封好的杂交袋再封入另一个未污 染的塑料袋内。 染的塑料袋内。 • 4.置42℃水浴温育过夜（至少 置 ℃水浴温育过夜（至少18h）。 ）。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。
在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。
下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。
步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。
DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。
可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。
2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。
细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。
3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。
4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。
步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。
根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。
2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。
3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。
启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。
4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。
步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。
Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介
Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介姜永均 (江苏省如东高级中学 226400)摘 要 Southern印迹杂交(Southern b l ot)是分子生物学领域中最常用的技术方法之一,该技术是1975年英国爱丁堡大学的E. M.Sou t h ern首创的,Sou t h ern印迹杂交故因此而得名。
后来相继出现了三个原理、过程相似,但是操作对象不同的印迹方法,缘于学界前辈的幽默分别将其称为N ort h ern b l ot、W estern blot和Eastern b l ot,这些技术的命名与发明人姓氏并没有关系。
本文简要介绍了Sou t hern印迹杂交及其相关生物技术。
关键词 Sou t hern印迹杂交 Northern印迹杂交 W estern印迹杂交 Eastern印迹杂交在近年的一些省、市中学生生物奥赛试卷中常涉及到Southern印迹、N outhern印迹、W este m印迹等分子生物学技术。
本文将Sout hern印迹杂交及其相关生物技术作一个简单介绍。
Souther n印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法,是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。
Souther n印迹杂交技术1975年由英国人埃德温 迈勒 萨瑟恩(Ed w i n M ellor Southern)创建。
1977年詹姆斯 艾尔文(Ja mes A l w ine)等把此方法应用到RNA的研究方面,称作Northern印迹法。
1979年乔治 斯塔克(G eor ge Stark)等则把该方法扩展应用到单向电泳后的蛋白质分子的分析方面,被称作W estern印迹法。
1982年Re i nhart报道双向电泳后蛋白质分子的印迹分析,称之为Eastern印迹法。
目前,有人把Sou hern、Nort hern、W esther印迹法分别称作DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法。
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Sourthern 杂交
（1）DIG-DNA标记：a）取1 μg的模板DNA加入灭菌双蒸水至16 μL体积；b）将16 μL的模板DNA置于100℃水浴变性10 min，之后迅速置于冰上冷却；c）加入4 μL混匀后的DIG-High Primer，混合均匀后离心，置于37℃水浴20 h 以上；d）65℃水浴10 min终止反应。
（2）基因组DNA的酶切消化、电泳以及变性：a）用限制性内切酶酶切基因组DNA（30~60 μg），点样跑胶以较低的电压3 v/cm电泳酶切样品；c）将凝胶转移至含1.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L NaOH的变性液中，室温轻轻振荡30 min，使凝胶中的基因组DNA变性（注意中间可以换液1次）；d）倒去变性液，用去离子水清洗3次，然后加入0.5 mol/L Tris-HCl，1mol/L NaCl（pH8.0）的中和液室温轻轻摇动洗涤30 min。
（3）DNA转膜：a）将带电荷的尼龙膜漂浮于含去离子水的平皿中，直至尼龙膜完全浸湿，然后转移至碱性转膜缓冲液（0.4M NaOH, 1M NaCl）中浸没5 min；b）在水平玻璃板放一张厚的滤纸（20 cm × 20 cm）作为滤纸条，待完全湿润后，用玻璃棒轻轻滑动以赶走气泡；c）从转膜缓冲液中取出浸泡过的凝胶，置于滤纸条的中央，用玻璃棒轻轻滑动，使得凝胶与滤纸条之间没有气泡；d）用塑料薄膜封闭凝胶的边缘，确保尼龙膜的边缘不能与滤纸条接触，然后吸取转膜缓冲液将凝胶表明湿润，再将尼龙膜置于凝胶上面，确保尼龙膜与凝胶之间无气泡；e）再取两张与尼龙膜同等大小的厚的滤纸置于尼龙膜的上面，用玻璃棒轻轻滑动赶走气泡；f）剪取一叠同等大小的纸巾置于两张滤纸上，再在上面平放一玻璃板，用400 g砝码压平稳，静置转移约12~24 h，期间需要频繁更换纸巾数次；h）弃纸巾、凝胶以及滤纸，在尼龙膜上用铅笔标记加样孔的位置以及方向，然后浸没于中和缓冲液（0.5M Tris-HCl, 1M NaCl）中，达30min，注意中间换洗1次，然后在10× SSC溶液中浸泡5min；i）将尼龙膜置于1张干净的滤纸上，自然风干；j）将尼龙膜置于紫外交联仪（70000 μJ/cm2）照射，正面朝上，使得DNA 固定交联到尼龙膜上。
（4）探针杂交过程：a）将含有靶DNA的尼龙膜浸于盛有6× SSC的平皿中，直至尼龙膜自上而下完全浸湿，浸泡2 min；b）用镊子将尼龙膜放入杂交管中，确
保尼龙膜与杂交管之间无气泡；c）将适量体积的预杂交液（DIG Easy Hyb，10 mL/100cm2尼龙膜）预加热到杂交温度（37℃~42℃），然后轻轻沿着杂交管壁倒入杂交管中，拧紧管盖，放入杂交炉中（37℃~42℃）预杂交30 min(预杂交时间可以延长至2h，预杂交延长有利于降低背景)；d）预杂交结束后，将DIG标记的DNA探针（约25 ng/μL DIG Easy Hyb）在沸水浴中变性5 min，并迅速放到冰上冷却；e）将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5 mL/100 cm2尼龙膜）中混匀，并避免泡沫形成；f）倒掉预杂交液并加入探针/杂交液混合液，于42℃温浴过夜；g）含有DIG标记的DNA探针的DIG Easy Hyb保存于-20℃，可以重复使用几次，但在使用之前必须置于68℃条件下变性10 min；h）杂交结束后，在42℃下，用足量的2× SSC，0.2% SDS混合液洗膜2次，每次5 min；i）在68℃下，用68℃预热过的0.5× SSC，0.1% SDS混合液洗膜2次，每次15 min。
（5）免疫显色：a）15~25℃，转移至100 mL Washing buffer中，摇动温浴l~5 min；b）15~25 ℃，浸没于l00 mL Blocking solution 中，摇动温浴30 min；c）15~25℃，浸没于20 mL Antibody solution 中，摇动温浴30 min；d）15~25 ℃，用l00 mL Washing buffer 洗膜2 次，每次15 min；e）15~25℃，浸于20 mL Deteetion buffer中平衡2~5 min；f）将膜表面的水分吸干后，在膜的正面加入1 ml CSPD（via 5），并使液体均匀覆盖膜的表面，之后用保鲜膜包裹，尽量避免气泡，在黑暗孵育10 分钟，用LAS4000 化学发光成像系统自动曝光并保
存照片。