northern印迹杂交
Southern&northern&western杂交原理
Southern杂交Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。
一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。
Northern 印记杂交Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot 的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
Western杂交原理：是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。
其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。
先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。
Northern印迹杂交技术
5.酶联免疫染色 5.酶联免疫染色
• 室温，用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min，缓冲液 室温，用缓冲液Ⅰ min， min，再用缓冲液Ⅰ Ⅱ洗膜 30 min，再用缓冲液Ⅰ洗膜 1-5 min。 min。 • 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（1：2000）， 用缓冲液Ⅰ稀释抗体缓冲液（ 2000）， 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。 4℃只能稳定 稀释后的抗体溶液在4℃只能稳定12 h。室 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。 温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。 • 缓冲液Ⅱ洗膜2次，每次15 min，以除去未 缓冲液Ⅱ洗膜2 每次15 min， 结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液 缓冲液Ⅲ 结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液Ⅲ平 衡膜2 min。 衡膜2-5 min。
• Northern 杂交是用于RNA定量和定性分析的常用 杂交是用于RNA RNA定量和定性分析的常用 技术，它是将RNA RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维 技术，它是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维 素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上， 素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进行核 酸分子杂交的一种实验方法。 酸分子杂交的一种实验方法。 • 可以鉴定总RNA或poly(A)+RNA样品中同源RNA的存 可以鉴定总RNA RNA或 RNA样品中同源RNA的存 样品中同源RNA 在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度， mRNA分子的大小和丰度 在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度， 是分子生物学中研究基因表达在转录水平上的调 节以及cDNA合成的重要手段。 节以及cDNA合成的重要手段。 cDNA合成的重要手段
浸泡在 250 ml tris*NaCI 室温、 室温、30r/min 30min。 。
Northern blot技术
Northern杂交试验指导手册－Northern 印迹杂交A．探针准备DIG标记的RNA探针与DNA探针相比，显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景，因此，只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。
如果必须使用DNA探针，建议使用高SDS杂交缓冲液或DIG Easy Hyb以减少背景。
在正式杂交试验之前，优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。
探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。
取一小片空白膜，将其浸入不同探针浓度的溶液中（如：1μl/ ml、3μl/ ml、5μl/ ml …），可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。
在采用荧光检测或采用CSPD 化学发光检测时，建议试验探针浓度50－100ng/ml，如果采用CDP-Star化学发光检测，由于灵敏度很高，在此探针浓度下会产生很高的背景，因此，要适当降低探针浓度。
B. 印迹条件对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜，在10×和20×的SSC盐浓度下可以获得相同的结果，转膜时间是在4℃或室温下过夜。
C. 试剂及其配制MOPS缓冲液（10×）: 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )50mmol/L NaAc10mmol/L EDTA上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝甲醛（37%溶液，13.3mol/L）染液：0.5mol/L NaAc(pH 5.2)中含0.04%的亚甲蓝甲酰胺（去离子）70%乙醇SSC(20×)：3mol/L NaCl (175g/L)0.3mol/L 柠檬酸三钠•2H2O (88g/L)用1mol/L HCl调整至pH 7.0Denhardt溶液（100×)：10g Ficoll 400 + 10g PVP + 10g BSA(Penta x组分V)用DSPC处理水溶解，定容至500ml，过滤后分装成每份25ml于-20℃保存。
Northern印迹杂交技术教案资料
northern 印迹杂交流程图
所用材料、试剂及仪器 方法与步骤 参考书籍及文献
材料
总RNA样品或mRNA样品、 探针模板DNA、随机引物、地高 辛-dUTP、klenow酶、硝酸纤维 素虑膜等。
试剂
• 10*MOPS缓冲液、DEPC水、6*RNA上样 缓冲液、37%甲醛、甲酰胺、 20*ssc(pH7.0) 杂交缓冲液、2*洗膜缓冲液 (2*ssc)、预杂交液、杂交缓冲液、缓冲液 Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ、NBT(硝基四氮唑蓝 )、 BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐) 、TE缓冲液、 显色液、琼脂糖等。
上样
用标尺测量加样 孔与条带的距离
，拍照
切去凝胶一角，用 用SSC冲洗并浸泡 胶板，以除去甲醛
。
电泳：用1*MOPS缓冲液 ，先用20V使样品进胶， 再用5V/cm电泳1 h ，停 止电泳。
2.转膜
浸泡在250 ml 50 Mmol/l NaOH ,室 温、30r/min 30 min。
浸泡在 250 ml
仪器
• 恒温水浴箱，电泳仪，杂交袋，真空转移 仪，真空泵，杂交炉，恒温摇床，脱色摇 床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液 器，电炉（或微波炉），离心机，烧杯， 量筒，三角瓶，紫外灯等。
1.RNA电泳
琼脂糖与纯水一定 比例于微波炉内混 匀、冷却到75°C
加mops缓冲液、 甲醛，混匀。
制备成电泳用胶 待胶凝过程中， 准备RNA样品。
tris*NaCI 室温、30r/min 30min。
浸泡在250ml 10*SSC约1min
。
RNA转膜前的处理
转膜的 方法
毛细管洗脱法 真空转移法 电印迹法
叠放的滤纸，凝胶和膜之间不能有气泡，转膜约 10 h。
Northern Blot 实验 Protocol
Northern Blot（Northern印迹杂交）是一种用于检测RNA表达水平的方法，它通过将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，然后与特定基因互补配对的探针进行杂交，从而检测目的片段。
实验原理：Northern Blot利用了RNA的分子量大小不同，通过电泳方法将其按照大小分离，然后转移至硝酸纤维素膜上。
探针与特定的基因互补配对，当探针与目标RNA片段杂交时，可以检测到特定基因的表达情况。
所需试剂和耗材：1.RNA样品或mRNA样品。
2.探针模板DNA。
3.尼龙膜。
4.NorthernMax Kit（Cat. # 1940,Ambion, Inc.）等试剂。
实验仪器：1.恒温水浴箱。
2.电泳仪。
3.凝胶成像系统。
4.真空转移仪和真空泵。
5.UV交联仪。
6.杂交炉。
7.恒温摇床。
8.脱色摇床。
9.漩涡振荡器。
10.分光光度计。
11.微量移液器。
12.电炉或微波炉。
13.离心管。
14.烧杯。
15.量筒。
16.三角瓶等。
准备工作：1.准备好所需的试剂和耗材，确保它们在有效期内，并按照要求储存和使用。
2.确保实验区域干净整洁，并无菌操作。
3.了解和掌握实验步骤，以及如何解决可能出现的问题。
4.使用DEPC水处理相关玻璃器皿，保证无RNA酶的污染。
实验方法：1.将RNA样品进行电泳分离，根据分子量大小将RNA分子分离至琼脂糖凝胶中。
2.将凝胶中的RNA分子转印到硝酸纤维素膜上。
3.将硝酸纤维素膜上的RNA与特定基因的探针进行杂交。
4.通过底片暗盒制作X光底片，以检测RNA的表达情况。
5.对硝酸纤维素膜进行脱色处理，以便进一步检测和分析。
6.通过分光光度计测定X光底片的吸光度，以定量分析RNA的表达水平。
7.根据定量分析结果进行数据分析，绘制图表等。
注意事项：1.在实验过程中，要注意防止污染，尤其是避免交叉污染，因为这会对实验结果产生极大的影响。
2.所有溶液都应该是新鲜的，并且在使用之前应该进行充分的过滤和离心处理。
northern印迹杂交原理
northern印迹杂交原理北方印迹杂交（Northern blot）是一种用于检测和分离特定RNA序列的实验技术。
它是南方印迹技术的衍生物，南方印迹技术是用于检测和分离DNA序列的一种实验技术。
北方印迹技术常用于研究基因的表达调控机制和RNA水平的变化。
北方印迹杂交的原理基本上与南方杂交的原理相似，但有一些具体差异。
北方印迹的主要步骤包括RNA提取、转印到膜上、固定RNA到膜上、杂交和检测。
首先，从细胞或组织中提取总RNA。
通常使用酚-氯仿法或商业RNA 提取试剂盒进行提取。
在提取过程中，应严格遵循消毒和无RNase污染的条件。
接下来，将提取的RNA样品加载到琼脂糖凝胶中进行电泳分离。
通过电泳可以将RNA按分子大小进行分离，从而得到RNA带。
在电泳结束后，在凝胶上用碱性溶液溶解凝胶，将RNA转移到尼龙或硝酸纤维膜上。
然后，固定RNA到膜上。
这通常是通过使RNA与膜上的阳离子进行静电相互作用来实现的。
可以使用UV交联来增强RNA与膜的结合。
在固定RNA后，开始进行杂交。
杂交是将与目标RNA序列具有互补序列的DNA或RNA探针与膜上的RNA进行配对。
探针可以是标记有荧光物质或放射性同位素的分子探针。
探针的选择应根据研究的具体目的来确定。
杂交的条件包括温度、时间和杂交液的组成。
温度通常选择在50-65摄氏度之间，时间通常在几小时到一夜之间。
杂交液中通常包含盐、DENHART's溶液、聚丙烯醇等。
最后，进行检测。
检测的方法可以是放射自显影、化学发光或荧光检测。
如果使用放射性标记的探针，可以使用放射自显影技术来检测。
如果使用化学发光或荧光标记的探针，可以使用相应的检测仪器进行检测。
北方印迹杂交技术可以用于许多研究领域，例如研究基因表达的调控机制、RNA的稳定性和降解等。
它的优点包括对RNA分子的特异性检测和分离，以及对研究RNA变化的敏感性和定量性。
它的局限性在于需要较长的处理时间和较大的RNA样品量，以及需要较高的实验技术要求。
Northern-Blot印迹杂交
杂交信号弱或无信号的问题及解决方案
• 转录水平低：考虑使用其他组织 或细胞类型进行实验，以确定目 标基因是否在所选样本中表达。
杂交信号弱或无信号的问题及解决方案
解决方案
2. 使用更高效的RNA提取方 法，确保获得高质量的RNA 样品。
样本电泳
01
02
03
选择合适的胶浓度
根据RNA的大小选择适合 的琼脂糖凝胶浓度，确保 RNA片段能够充分分离。
点样与电泳
将处理好的RNA样品点在 凝胶上，并进行电泳分离。
检测RNA条带
通过染色或放射自显影等 技术观察电泳结果，确保 RNA片段已成功分离。
样本转移
制备滤纸
选择适合的硝酸纤维素膜 或印迹膜，并将其固定在 滤纸上。
northern-blot印迹杂交
contents
目录
• northern-blot技术概述 • northern-blot实验原理 • northern-blot实验材料与设备 • northern-blot实验步骤 • northern-blot实验结果分析 • northern-blot实验问题与解决方案
01 northern-blot技术概述
定义与特点
定义
Northern-blot印迹杂交是一种用于 检测RNA在样本中的表达水平的分 子生物学技术。
特点
具有高灵敏度、高特异性和高分辨率 ，能够检测出微量的RNA分子，并可 对RNA分子进行定性、定量和定位分 析。
northern-blot技术的应用范围
1. 重新设计探针并进行验证， 确保与目标基因完全匹配。
3. 优化实验条件，如延长杂 交时间和提高探针浓度。
northern印迹杂交操作步骤
northern印迹杂交操作步骤标题：Northern印迹杂交技术的操作步骤详解Northern印迹杂交是一种研究基因表达的分子生物学技术，主要用于检测细胞中特定mRNA的存在和数量。
其基本原理是利用核酸之间的碱基配对原则，将放射性或非放射性的DNA探针与固定在硝酸纤维素膜上的RNA进行杂交，然后通过显影、放射自显影或者化学发光等方式显示结果。
以下是Northern印迹杂交的基本操作步骤：1. RNA的提取：首先从待测样本中提取总RNA。
常用的RNA提取方法有酚氯仿法、Trizol法等。
提取后的RNA需要进行定量和质量检查，以确保后续实验的准确性。
2. RNA的电泳分离：将提取到的总RNA通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。
根据RNA的大小不同，会在凝胶上形成不同的条带。
通常情况下，28S rRNA的迁移速度比18S rRNA慢，因此可以根据这两个条带的位置和强度来判断RNA的质量。
3. RNA的转移：将电泳分离后的RNA通过毛细管作用转移到硝酸纤维素膜上。
这个过程称为“转膜”。
转膜时需要注意的是，硝酸纤维素膜的正反两面不能混淆，因为转膜后要进行的杂交反应只在膜的一面上进行。
4. RNA的固定：转膜后的RNA需要被固定在硝酸纤维素膜上，防止其在后面的杂交过程中脱落。
常用的固定方法是在高盐溶液中进行热处理。
5. 杂交：将标记好的DNA探针与固定的RNA进行杂交。
杂交过程一般在恒温水浴中进行，温度应设定在Tm值以下5℃左右。
杂交的时间视探针的长度和浓度而定，一般为过夜。
6. 洗脱：杂交后的硝酸纤维素膜需要进行洗涤，目的是洗去未与RNA杂交的游离探针。
常用的洗涤液是SSC缓冲液，洗涤次数视具体情况而定。
7. 显影：将洗涤后的硝酸纤维素膜用X光片覆盖，并放置在暗盒中曝光一段时间，然后进行显影。
如果使用的是放射性标记的探针，则需要进行放射自显影；如果是非放射性标记的探针，则可以采用化学发光的方式进行显影。
总的来说，Northern印迹杂交是一种相对传统的分子生物学技术，虽然操作步骤较为繁琐，但因其能够直接反映mRNA的存在和量的变化，因此在基因表达的研究中仍具有重要的地位。
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northern印迹杂交
Northern印迹杂交（Northern blot）。
这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。
DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern 印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。
Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。
RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。
在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。
为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照相，样品胶则进行Northern转印。
标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸铵中10min，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。
琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。
所有操作均应避免RNase的污染。
RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法。
<1>试剂：
10×MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/L EDTA pH8.0。
5×载样缓冲液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝。
甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。
20×SSC；
去离子甲酰胺；
50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl)；
0.1mol/L Tris，pH7.5。
<2>步骤：
[1]40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7ml10×MSE缓冲液，11.5ml
甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。
[2]等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。
[3]使RNA变性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺10ml。
[4]55℃加热15min，冰浴冷却。
[5]加2ml5×载样缓冲液。
[6]上样、同时加RNA标记物。
[7]60伏电泳过夜。
[8]取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。
[9]室温下将胶浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。
[10]室温下将胶浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使胶中和。
[11]20×SSC洗胶1h。
[12]20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。
[13]取出硝酸纤维素膜，80℃真空烘烤2h。