蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)图示

(4) 耗材
10、100、1000 uL 枪头与移液枪、EP 管、EP 管防爆夹、96 孔板、单格或 5 格孵育盒、镊子、锡纸、保鲜膜、
滤纸、乳胶手套、薄膜手套、医用口罩等
A 蛋白样本提取制备
A-1 细胞或组织裂解
A-2 蛋白定量
A-3 电泳上样样品的准备 一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要
(2) 主要试剂： 1） RIPA 等裂解液 2） 2×或 5×或 6×或 10×蛋白上样缓冲液 3） 彩色预染蛋白质分子量标准 4） 四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine, TEMED） 5） 10%过硫酸铵（ammomium persulfate, APS） 6） TrisCl,1.5M(PH 8.8) 缓冲液 7） TrisCl,1M(PH6.8) 缓冲液 8） 30% Acr-Bis(29:1) (即 30% acrylamide-bisacrylamide) 9） 甘氨酸（Glycine） 10）Tris 碱（Trisbase） 11）十二烷基硫酸钠（SDS） 12）甲醇（methanol） 13）吐温-20（Tween-20） 14）牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉 15）PVDF 膜 16）ECL 显色底物 A 液和 B 液 （3）抗体 1）β-Actin 等内参抗体 2）辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG 等带 HRP 的二抗 3）指标抗体
C-7 显色 (化学发光法) 现在最常用的是化学发光法：HRP 化学发光底物 Lumino（l ECL 法 chemiluminescence）及其改良法， 对
于 HRP 偶联的二抗，一般传统上使用 ECL 和 ECL+，推荐使用后者，更灵敏。其中不同商家的产品特点总 结 如下表：
X-ray 胶片：传统上使用手工曝光的方法，可控制 X-ray 胶片在曝光和在定影剂的时间调节。而全自动 X-ray 胶片曝光器也广泛使用并操作简便。
B 电泳
B-1 PAGE 胶的制备 聚丙酰胺凝胶 PAGE 电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE 胶是由两种化合物聚合 而成的，即丙烯酰胺（acr）和 N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，聚合需加入过硫酸铵及 DMAP 或 TEMED，凝胶为 中性、水溶性、三维网 状结构。 不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表》，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高 浓度胶分离。
配制 5%脱脂奶粉或 BSA 溶液：每 100 ml TBST 中加入 5 g 脱脂奶粉或 BSA，混匀后过滤，如不过滤会导 致使膜污染上细微黑颗粒。 封闭时，4°C 摇动，封闭 1 hour ，再用 TBST 洗 5 秒，进入下一步抗体的孵育。
C-5 一抗的孵育 孵育 Buffer：按抗体说明书建议的稀释倍数，用 TBST 稀释一抗，如果说明书没有建议的稀释倍数，则参 照 一般推荐的稀释倍数(1:100-1:3000)，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带。 C-6 二抗的孵育 一抗孵育结束后，用 TBST 摇动洗膜数次，每次 5min 或更长，去除残留的一抗。 孵育 Buffer 和稀释倍数：用 TBST 按说明书推荐的倍数稀释二抗，如果说明书没有标出稀释倍数，则按常 规 的倍数稀释(1:1000- 1:20,000)预试，二抗的浓度过高也会导致非特异性条带。室温、1-2 hours, 摇动 二抗连接物：推荐使用二抗连接 HRP，不建议连接 AP 碱性磷酸酶，因其不够灵敏。
C-1 胶中蛋白的检测 电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用铜染或考马斯蓝染色检测，如果凝胶中 的蛋白需要进行转膜则需可逆的铜染法，否则采用不可逆考马斯蓝法染色。 铜染法：电泳胶用蒸馏水洗数秒钟，加入 0.3 M CuCl2 染色 5-10 分钟，再用去离子水洗一次，在暗背景下 观察在兰色胶背景下蛋白出现透明条带，胶置于 0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 缓冲液中漂洗脱色两次， 再置于电转缓冲液中开始转膜。 考马斯蓝法：用 40%双蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇的溶液固定胶中蛋白，考马斯蓝 R-250 染液（凯基产品）室 温染色 4 小时至过夜，保持摇匀，转入 67.5%双蒸水, 7.5% 醋酸, 25%甲醇摇匀至脱去多余的染料，蛋白被染 成深蓝色。 C-2 蛋白转膜
将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如 SDS 的上样 buffer （loading buffer），并于 95-100°C 煮沸 5 分钟。 SDS 的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的 SDS 数量不同，所带负电荷也不同， 电泳迁移速度不同，因此 SDS-PAGE 电泳可将不同分子量的蛋白分离开
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）图示
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot ,WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转 移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB 是进行蛋白质分 析最流行和成熟的技术之一。
培养细胞总蛋白提取试剂 哺乳动物组织总蛋白提取试剂
清 无色蛋白条带清晰，（膜也可以用 TBST 或水重新洗后再进行染色）PVDF 膜需用甲醇再活化后用 TBST 洗后进行封闭。
C-4 膜的封闭 为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭，传统上有 两种封闭液：脱脂奶粉或 BSA，脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脱脂奶粉含有酪蛋白， 该蛋白 本身就是一种磷酸化蛋白），使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景。
蛋白因结合 SDS 而带电荷，在电场下从胶中转至膜上，转膜操作根椐电转仪制造商的说明书进行转膜 方式 分为半干和湿转两种，半干式转膜速度快，而湿式成功率高并特别适合用于分子量大于 100KD 的蛋 白。
两类膜可供选择：硝酸纤维素膜和 PVDF 膜（正电荷尼龙膜），根据不同需要选择（下表），PVDF 膜需 要
(29:1)、TEMED、10% SDS、1M Tris-HCl,pH6.8、1.5M Tris-HCl,pH8.8）
SDS-PAGE 电泳缓冲液（甘氨酸、 Tris-Base、SDS）
彩色预染蛋白分子量标准
考马斯亮蓝染色 试剂盒(常规法)
快速银染试剂盒
染胶
转膜
硝酸纤维素（NC）膜、PVDF 膜 转膜缓冲液（甘氨酸、Tris-Base、甲醇）
Western 封闭液 Western 洗涤液（TBST）

孵育一抗 TBST 洗膜
Western 一抗二抗稀 释液
孵育二抗
羊抗小鼠 IgG-HRP 羊抗兔 IgG-HRP
(1) 主要设备： 1）超声细胞破碎仪 2）Bio-Rad 垂直电泳仪及转移系统 3)Bio-Rad ChemiDoc™ XRS+化学发光成像系统 4）酶标仪（BCA 法，具 562 nm 波长） 5）高速冷冻离心机
B-2 蛋白分子量 Marker 预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪
B- 3 阳性对照 目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有
效性，特别是一抗的质量和效率。建议使用该对照。可查阅文献或抗体说明书选择购买或自提该对照样本。 B-4 内参对照
转印滤纸
丽春红染色液
染膜
DAB 显色试剂 DAB 显色检测试剂盒 BCIP/NBT 显色试剂
超敏化学发光 ECL 底物 超敏化学发光 ECM 试剂盒 显影定影试剂盒 柯达 X-OMAT BT 胶 压片暗盒 X 光片背景去除液试剂盒 蛋白印迹膜再生液
化学显色方法检测 TBST 洗膜
化学发光方法检测
封闭
浸泡甲醇中 1-2 分钟，再孵育于冰冷的电转缓冲液中 5 分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡 3-5 分 钟， 否则转膜时会导致条带变形。
C-3 膜上蛋白的检测：丽春红为检测转膜是否成功，可用丽春红染色， 丽春红染色工作液：2%的丽春红贮备液 1：10 稀释，即加 9 倍的 ddH2O 染色方法： 将膜放入 TBST 洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色 5 分钟，大量的水洗膜直至水变
细菌总蛋白提取试剂 细胞胞浆和胞核蛋白提取试剂 细胞真核膜蛋白提取试剂盒
细胞线粒体提取试剂盒 红细胞裂解液
快速沉淀和浓缩蛋白试剂盒
提取蛋白 蛋白定量 上样、电泳
BCA 蛋白定量试剂盒 BCA 蛋白定量试剂盒（增强型） 考马斯亮蓝（Bradford）蛋白定量试剂盒
SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(2、5、6X) SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒（30% Acr-Bis
管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个 WB 实验过程及体系是否正常 工作， 并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照。必须设立。
B-5 上样与电泳 每孔上样量为 20-40 μg 蛋白，使用 10 微升枪头或注射针头，勿溢出加样孔
C 转膜与显色（Western Blot）