SDS-PAGE电泳分离蛋白质与蛋白质免疫印迹
蛋白质的SDS-PAGE检测
百泰派克生物科技
蛋白质的SDS-PAGE检测
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）十
二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离纯化技术，它利用十二烷基硫酸钠消除蛋白质结构和电泳的影响，使蛋白质仅根据分子质量差异进行分离，广泛用于蛋白质的分离、纯度鉴定、分子量鉴定以及表达分析等。
蛋白质SDS-PAGE检测包括蛋白质SDS-PAGE电泳和电泳后凝胶图像分析两个部分。
在蛋白质SDS-PAGE电泳过程中，不同分子质量的蛋白质迁移速率不同，相对分子
质量较大的蛋白质在电场的作用下迁移较慢，电泳结束后仍然靠近点样孔；而低分子质量的蛋白质迁移速率较快，电泳结束后处于离点样孔较远的位置。
经银染或考马斯亮蓝等方法染色后，便可以观察到凝胶上蛋白质条带的大小、数量和分布情况。
百泰派克生物科技采用Bio-Rad Mini-PROTEAN® Tetra凝胶系统，提供快速高效的蛋白质SDS-PAGE检测服务技术包裹，用于多种蛋白质组学分析，包括蛋白质分子
量测定、蛋白质鉴定、样品纯度分析、二硫键鉴定以及蛋白质定量等，欢迎免费咨询。
SDS-PAGE
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
3、蛋白质-SDS复合物的特点：
形状像一个长椭圆棒。 短轴对不同的蛋白质-SDS胶束基本上是相同的。
长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。
所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有电荷，消除了蛋 白质分子间原有电荷的差异。 在SDS-PAGE电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电 荷的影响，主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或 亚基分子量的大小。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
四、SDS-PAGE的应用
1、蛋白质纯度分析 2、蛋白质分子量、浓度的测定
3、免疫印迹的第一步
4、蛋白质修饰的鉴定 5、分离放射性标记的蛋白质 6、分离和浓缩用于产生抗体的抗原 7、显示小分子多肽
蛋白质分子量大小而定）； ② 恒定电压电泳一定时间； ③ 电泳结束后取下凝胶，至染色液中染色，过夜； ④ 用脱色液脱色至结果可见，经扫描保存。 结果分析参照蛋白质标准对照进行，或进一步进行 western blotting，分析不同蛋白质分子的组成。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
Western blotting多种蛋白的检测
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
二、SDS-PAGE样品检测
SDS-PAGE一般采用不连续缓冲系统，由Tris/甘氨 酸电极缓冲液、浓缩胶和分离胶构成，采用垂直电泳的 方式对待检测样品进行分析。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
二、SDS-PAGE样品检测
SDS-PAGE操作步骤如下：
① 采用一定浓度的浓缩胶和分离胶对样品进行检测（视
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
sdspage分离蛋白质原理
sdspage分离蛋白质原理
SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离技术，其原理基于聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS（十二烷基硫酸钠）的作用。
首先，将待分离的蛋白质样品加入SDS溶液中，SDS可以与
蛋白质发生非共价键结合，使蛋白质的电荷变得均匀，且带有负电荷。
这样，蛋白质在电场作用下会向阳极迁移。
接下来，将试样加载到聚丙烯酰胺凝胶孔中，聚丙烯酰胺凝胶中存在着连续的网络结构，该网络由交联的聚丙烯酰胺聚合物构成。
蛋白质在电场作用下会通过孔道中的凝胶网络逐渐迁移，迁移速度取决于其分子量，分子量较大的蛋白质迁移速度较慢，分子量较小的蛋白质迁移速度较快。
最后，当电泳进行一段时间后，蛋白质样品会在凝胶中分离成多个带状区域，每个带状区域代表了一种或多种分子量相近的蛋白质。
为了可视化蛋白质，可以通过染色或免疫检测方法进行进一步分析。
总结起来，SDS-PAGE通过使用SDS使蛋白质带有负电荷，
然后在聚丙烯酰胺凝胶电泳中根据蛋白质分子量的差异来分离蛋白质。
这种技术广泛应用于蛋白质分析和分离，用于探索蛋白质结构和功能，以及研究蛋白质相互作用。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
生物蛋白质的检测实验报告
生物蛋白质的检测实验报告生物蛋白质的检测实验报告引言：蛋白质是生物体中最基本的分子之一，其在细胞结构、代谢调控、信号传导等方面扮演着重要角色。
因此，准确地检测生物蛋白质的存在和量级对于研究生物学过程具有重要意义。
本实验旨在通过一系列方法，对蛋白质进行检测并分析。
材料与方法：1. 样本制备：选取不同类型的生物组织，如肌肉、肝脏和心脏，分别进行细胞裂解并制备蛋白质提取液。
2. 蛋白质定量：利用BCA法对蛋白质提取液进行定量，根据标准曲线计算样本中的蛋白质浓度。
3. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品与Laemmli缓冲液混合后，经过电泳分离，然后进行染色和成像。
4. 免疫印迹：将电泳分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，然后进行抗体探针的孵育和检测。
5. 质谱分析：将蛋白质样品经过酶解后，利用质谱仪进行分析，得到蛋白质的质量和序列信息。
结果与讨论：1. 蛋白质定量结果显示，不同组织中蛋白质的浓度存在差异。
肌肉组织中蛋白质浓度最高，而心脏组织中蛋白质浓度最低。
这可能与组织功能和代谢需求有关。
2. SDS-PAGE电泳结果显示，不同组织中蛋白质的分子量也存在差异。
肌肉组织中蛋白质的分子量较大，而心脏组织中蛋白质的分子量较小。
这与组织的功能和结构有关。
3. 免疫印迹结果显示，不同组织中蛋白质的表达模式也存在差异。
肌肉组织中特定蛋白质的表达量较高，而心脏组织中特定蛋白质的表达量较低。
这可能与组织的功能和代谢调控有关。
4. 质谱分析结果显示，蛋白质样品中存在多个肽段，通过对质谱峰的分析，可以推测蛋白质的氨基酸序列和质量。
结论：通过本实验的一系列方法，我们成功地检测了生物蛋白质的存在和量级，并对其进行了分析。
结果显示，不同组织中蛋白质的浓度、分子量和表达模式存在差异，这与组织的功能和代谢调控密切相关。
质谱分析进一步揭示了蛋白质的氨基酸序列和质量信息。
这些结果对于深入理解生物学过程以及研究相关疾病具有重要意义。
展望：虽然本实验对生物蛋白质的检测和分析取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。
实验十 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质
实验十聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质【实验目的】1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；2. 掌握用此法分离蛋白质组分的操作方法。
【实验原理】在生物化学、分子生物学和基因（遗传）工程实验中，常常要进行蛋白质和核酸的分离工作。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质或核酸分离的一种电泳方法。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。
通过改变单体浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，用于分离分子量大小不同的物质。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N－四甲基乙二胺（简称TEMED）。
通常控制这二种溶液的用量，使聚合在1小时内完成。
（2）光聚合：通常用核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加入TEMED 加速反应。
聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。
一般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）；②凝胶的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）。
③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。
因此，样品分离效果好，分辨率高。
SDS即十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。
这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。
蛋白质免疫印迹实验
蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验原理蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。
对已知的表达蛋白，可以用相应的抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可以融合部分的已知片段进行检测，如HA-tag，Flag-tag，c-myc-tag等。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，被检测的是蛋白质，其中检测探针是相应的抗体，显色是使用的标记后的二抗。
经过PAGE凝胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，如醋酸纤维素膜，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。
然后以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，然后再与标记后的二抗起反应，经过底物显色以检测目的蛋白。
蛋白质免疫印迹（Western Blot）原理蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。
所以在此阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。
如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察；第二阶段为电转移，又称为转膜。
即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选用恒流300 mA，通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。
转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的，如果想观察转移的效果，可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。
第三阶段为酶联免疫显色检测将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。
westernblot电泳原理
westernblot电泳原理Western blot电泳是一种分离和鉴定蛋白质的方法，它基于电泳原理，可以将蛋白质按照分子量大小分离并定位到膜上，然后通过染色、显影等方式检测目标蛋白质的存在和数量。
Western blot电泳主要分为4个步骤：样品制备、SDS-PAGE电泳、蛋白印迹，以及染色、显影。
下面将对每个步骤进行详细介绍。
第一步：样品制备在进行Western blot电泳之前，需要对样品进行制备。
一般来说需要采用还原剂和蛋白酶抑制剂等化学试剂处理样品，以避免蛋白质被氧化或降解，保证电泳结果的准确性。
常见的还原剂有DTT和β-mercaptoethanol等。
另外，还需选用相应的溶解液处理样品，使蛋白质完全溶解并不附着于膜上。
第二步：SDS-PAGE电泳在样品制备完成后，需要将蛋白质进行分离。
SDS-PAGE电泳就是最常用的蛋白质分离方法之一。
它利用SDS与蛋白质的作用，使得蛋白质的形态发生改变，变为线性构象。
同时SDS还赋予蛋白质等电性，可以使得蛋白质按照分子量大小进行迁移。
在SDS-PAGE电泳，要将样品加入凝胶槽中，施加电场，使蛋白质向电极迁移。
随着时间的推移，蛋白质会按照分子量大小被分离到不同位置。
经过电泳，蛋白质带会形成。
第三步：蛋白印迹蛋白印迹是Western blot电泳的核心步骤，它将已经分离好的蛋白质转移到膜上，并固定在膜上以方便后续的染色和检测。
常用的膜包括尼龙膜、nitrocellulose膜和PVDF膜等。
在印迹过程中，需要将SDS-PAGE凝胶与膜叠在一起，并由电流进行迁移，使蛋白质分子也迁移至膜上，形成同样的蛋白质带。
通过此步骤，可以在膜上确定蛋白质的位置和分子量。
第四步：染色、显影蛋白印迹完成后，即可进行染色、显影。
通常的做法是利用特殊的染料如蛋白质染料Ponceau S染色检测蛋白质是否在膜上，并调整印迹的质量。
对于染色后的膜，可以通过荧光素着色、成像的方式直接观察目标蛋白的含量。
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八、检测 根据标记二抗的标记物不同,其杂交的结果检测方法 也不同,较常用的检测系统有增强化学发光(ECL)和 DAB检测系统. 1) 辣根过氧化物酶-DAB法: ①DAB显色液的配制:按照1mlH2O加显色剂A,B,C 各1滴,混匀. ②显色:将适量DAB显色液平铺在二抗杂交后的印迹 膜上,室温放置观察,可出现明显的棕褐色蛋白显色 带 ③终止:用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止 反应.
凝胶浓度 (T) 的选择与被分离物质分子量密切 相关。 表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)
蛋
10KD 1O-40KD 1O-100KD 100KD 500KD
白 质
20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
分离胶的聚合（12%）
5ml体系
七、抗体杂交 抗体表面主要采用间接法。即先加入未标记特 异性抗体与膜上抗原结合，再加入标记的抗体 进行杂交检测，标记二抗物质有放射性核素、 酶以及生物素等。 杂交过程： １）封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体 稀释液稀释的一抗，封口，4℃孵育过夜或室温 （22-25℃）摇动孵育2h. ２） 液洗膜3次x10min ３）标记的二抗室温1h，洗膜3x10min
考马斯亮蓝和DAB
考马斯亮蓝染色： 将凝胶取出放入培养皿中加入少量的染色液，以浸没凝胶为宜，在摇床 上震荡，直到凝胶上出现明显的条带为止，一般5-6小时或者4℃过夜。 然后倾去染色液，用脱色液洗涤震荡，其间要不断换脱色液，直至脱色 液颜色稍清亮，凝胶背景清楚为止。 DAB显色
常见问题及解决方案
注意事项:
1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关。因此，凝胶电 泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低， 如果过低应该重新纯化和浓缩使用，或者建议做一次 梯度稀释，上样电泳后，直接考马斯亮蓝染色选择最 佳上样量。 2. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度，激活剂的浓度适当， 不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量， 凝胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。因此，建议 要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离 胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为1520分钟最佳，对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟 开始可见聚合。灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧 气的结合。
3、电泳 将电泳仪与电源接通，打开电泳仪稳流，开始时电 流约20mA，待样品进入分离胶后，将电流调至25-30 mA，当溴酚蓝染料距底框0.5cm时，停止电泳，关闭 电源
4、染色与脱色 电泳结束后，取下凝胶板，用胶铲撬开短玻璃板，从 凝胶板上切下一角作为加样标记。加入染色液染色1-2 h，再加自来水(加几滴3MKCl)煮沸三次(10min/次)脱色， 则可见蛋白质区带清晰。
2) 辣根过氧化物酶-ECL法： 增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化 学发光物质，生成一种不稳定的中间物质，其衰变时在 暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带，利用X线胶 片感光原理,将结果记录下来。 ECL显色剂配制：按EP管中加显色剂A、B各1滴,混匀， 在暗室将杂交后印迹膜放入显色盒中，加上混合好的显 色液，反应1-5分钟， 用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角 部分多余的显色液，将一透明的保鲜膜盖住抚平，并确 定干的表面与胶片接触。 将印迹膜在暗室中使胶片暴光1-5分钟，冲洗胶片以确定 所测抗原的正确暴光时间，暴光时间可短至几秒也可以 长到数小时。 冲洗胶片步骤：先在显影液中冲洗至胶片上出现条带或 者胶片透明为止，在放入定影液中漂洗，十秒即可。
30%丙烯酰胺的配制
1、称量Acrylamide290g，Bis10 g，置于1 L烧 杯中 2、向烧杯中加入约600 ml的去离子水，充分搅 拌溶解。 3、 加去离子水将溶液定容至1 L，用0.45 mm滤 膜滤去杂质。 4. 于棕色瓶中4℃保存。 注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过 皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套、 口罩等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因 为有可能含有少量的未聚合成份。
5、转移电泳： 凝胶电泳结束前30min，将PDVF膜浸泡 在转移缓冲液中。从模具中取出凝胶放在 PDVF膜上，驱除气泡，然后置于滤纸上 放入转移模具中，将模具放入转移电泳槽， PDVF膜一面朝正极，恒压100伏70min， 4℃电泳过夜，次日取出PDVF膜做好标 记。
六、膜的封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止免 疫试剂的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质或去污 剂，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，5%脱脂奶等，至 于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测试剂相适应，如采 用葡萄球蛋白A（SPA）作用检测试剂，就不能用全血清封 闭，其次是尽可能使非特异着色背静浅，封闭液以20%BSA 效果较好，其次是5%N-fat milk. 封闭过程： 1) 洗转印膜：室温漂洗3次x10min,以尽量洗去转印膜上的 SDS，防止影响后面的抗体结合。 2) 取漂洗的转印膜，放入5% No-fat milk的封闭液内，摇床 震动，室温封闭1h，也可在4度过夜。 3) 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次x10min.
蒸馏水 30%丙烯酰胺 1.5MpH8.8 Tris-SDS 10%AP 1.634ml 2.0ml 3.7ml 25ul
Байду номын сангаас
TEMED
5ul
上层加异丙醇压胶，室温一小时
积层胶的聚合（5%）
2.5ml体系
蒸馏水 1.75ml
30%丙烯酰胺
1MpH6.8 Tris-SDS 10%AP TEMED 室温一小时
3. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套 口罩防护。梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡，可将 梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生，梳子拔出来时应 该小心，不要破坏加样孔，如有加样孔上的凝胶歪斜可 用针头插入加样孔中纠正，但要避免针头刺入胶内。 4. 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的 气和未聚合的丙烯酰胺，同时建议低电压短时间的预电 泳，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程 中电泳的畅通(恒压10-20V，20-30min) 5. 加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品，以 减少蛋白质沉淀堵塞胶孔。 6. 为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品 缓冲液。
0.413ml
0.338ml 12.5ul 2.5ul
过程图
http://202.114.128.248/newkj/my/moban2/index.htm
（二）方法 1、制胶：制备凝胶板，将混合后的分离胶溶液，用1ml枪加 至距梳齿下缘约1 cm。用1 mL枪在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻 轻加一层异丙醇(约高3–4 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率 不同的界线。 将异丙醇倒去用重蒸水洗净胶面，将混合均匀后的浓缩胶溶液 加入分离胶上方，轻轻插入梳子. 待上层胶聚合，拔出梳子，放 入电泳槽，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.3 cm，即 可加样。 2、样品处理： 样品经反复冻融裂解，离心，测浓度后，向样品中加入适量的 上样缓冲液6*SDS，金属浴105°C 10min，加样量一般每个样 品池10~40l。
SDS－PAGE电泳分离蛋白质与 蛋白质免疫印迹
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot ）是将 蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大 小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后 通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性 检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行 和成熟的技术之一。
原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺 (Acr)和交 联剂 N,N- 甲叉双丙烯酰胺 (Bis)在加速剂 N， N， N，N—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过 硫酸铵(简称AP)作用下聚合交联成三维网状结 构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙 烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数 月，但是反复冻融会使蛋白质降解。 8. 为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进 行电泳，电泳结束后也应尽快转印。 9. 上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加 样孔。 10. 取出凝胶后应注意分清上下，可用刀片切 去凝胶的一角作为标记(如左上角)，转膜时也 应用同样的方法对PDVF膜做上标记(如左上角) 以分清正反面和上下关系。 11. 转膜时应依次放好PDVF膜与凝胶所对应 的电极，即凝胶对应负极。PDVF膜对应正极。