免疫印迹步骤
免疫印迹法（PDF）
免疫印迹法免疫印迹法（immunobiotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot 相类似，亦被称为Western-blot。
免疫印迹法分三个阶段进行。
第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min 转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。
常用的HRP底物为3，3’-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。
阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。
本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。
在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。
抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒，可方便地在实验室中供检测用。
根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。
一． SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）基本原理是聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体acr聚合成长链并通过双功能化合物甲叉双丙烯酰胺Bis交联而成的三维网状结构凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶的机械性、弹性、透明度、粘着度取决于凝胶的总浓度，总浓度越大，平均孔径越小，机械强度越强。
免疫印迹步骤
2.6 免疫印迹（Western blot）（1）裂解细胞，提取细胞总蛋白：收集细胞（约2×106），离心洗涤2次，加入100µL RIPA裂解液，置冰上反应30min，4℃12,000r/min离心15min，取上清，蛋白定量后分装，-80℃冻存备用；（2）蛋白定量：Bradford法测定蛋白质含量[35]：①分别在微量离心管中各加入0.5mg/mL BSA 5µL、10µL、15µL及20µL，以0.15mmol/L的NaCl补足至100µL，同时以两管100µL的0.15mmol/L的NaCl作空白对照。
②每管各加入900μL考马斯亮蓝G-250溶液，振荡混匀，室温放置2min。
③用1cm光径的微量比色杯测A595吸光值，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线，并测量待测样品的A595吸光值，从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。
（3）SDS-PAGE电泳①制胶SDS丙稀酰胺凝胶12％分离胶8％分离胶5％积层胶去离子水 3.3mL 4.6mL 2.7mL1.5mol/L Tris-Cl(pH8.8)2.5mL 2.5mL －1.0mol/L Tris-Cl(pH6.8) －－0.5mL30%丙稀酰胺 4.0mL 2.7mL 0.67mL10% SDS 0.1mL 0.1mL 0.04mL10%APS 0.1mL 0.1mL 0.04mLTEMED 0.004mL 0.004mL 0.004mLTotal 10mL 10mL 4mL其中10%APS和TEMED需等临灌胶之前再加入。
先配制好分离胶，在涡旋混合器上混匀，立刻用吸管将胶缓缓灌入到大小两块玻璃板之间，至胶的最上缘距玻璃板顶端3cm左右。
再用去离子水覆盖在分离胶的上层，封闭空气使胶易于凝固。
室温静置1h左右可看到去离子水和胶之间由于折射率不同而出现一条界限，说明胶已经凝好，可用注射器小心吸出上层的去离子水。
免疫印迹操作步骤
1．主要内容检测限为2—20fmol，或约0．1～lng的50kDa蛋白质有多个操作步骤，需2天(或1天)时间完成。
检测抗原的存在，定量及其大小。
半定量至全定量。
抗原的检测依赖于耐变性的表位。
一般，低亲和力抗体亦可使用。
2．操作步骤(1)将蛋白质溶解于Laemmli样品缓冲液中。
最终的样品缓冲液条件是2％SDS、100mmol／LDTT(从lmol ／L的储存液中取出，临用前加入，该储存液置于—20℃冷冻保存)、60mmol／LTris(pH6．8)、0。
01％溴酚蓝和10％甘油。
全细胞可直接放在样品缓冲液中进行溶解；纯化或部分纯化的溶液可用2％的样品缓冲液1：1进行稀释。
加热至70℃10min。
最终蛋白质浓度应不超过150ug／每孔(微型胶不超过15pg／每孔)。
(2)将样品放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，移去平板，将凝胶剪成适当大小以进行转印。
在凝胶上作记号以确定方向。
(3)剪1张硝酸纤维素膜和4张吸附滤纸(Whatman 3MM或替代物)，其大小与凝胶相当。
(4)将硝酸纤维素膜放入蒸馏水中润湿。
将膜转入转印缓冲液中浸泡5min。
将吸水纸浸泡于转印缓冲液中。
转印缓冲液1(20 000～400 000kDa蛋白质)：48mmol／LTris，390mmol／L甘氨酸、0．1％(w／v)SDS、20％甲醇加蒸馏水至1000ml。
转印缓冲液2(<80 000kDa蛋白质)：25mmol／LTris、190mol／L甘氨酸、20％甲醇加蒸馏水至1000ml。
(5)将凝胶、印迹膜、滤纸和支持垫浸入转印缓冲液中使其完全浸泡。
小心地将支持垫中的气泡排出。
(6)组装转印夹层组合：依次为支持垫、2张吸水纸、凝胶、膜、2张吸水纸和支持垫。
将组装好的夹层组合放入转印槽中，并使膜靠近正极(阳极，红色电极)。
(7)于4C条件下转印过夜。
分子质量>100 000kDa的蛋白质，先在28V转印1h，然后在84V转印14～16h。
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
免疫印迹分析流程
免疫印迹分析流程
一、实验准备
1.准备试剂和设备：免疫印迹分析需要的试剂和设备包括蛋白样本、SDS-凝胶、转膜膜、植物生物素-磷酸化酶、抗体等。
2.蛋白样本制备：将待检测的蛋白样本加入SDS-凝胶中，通过电泳
分离蛋白。
3.封闭：将分离的蛋白转移到转膜膜上，然后使用封闭液（如牛奶或BSA）阻断非特异性结合位点。
4.探测：将转膜膜与目标蛋白特异性的抗体结合，然后添加辅助试剂（如生物素-磷酸化酶）使得信号可检测。
5.探测：将荧光标记的探针（如荧光素-磷酸化物）与辅助试剂结合，产生荧光信号。
6.检测：使用荧光成像系统或其他适当的设备检测荧光信号，分析结果。
二、应用领域
1.蛋白表达分析：免疫印迹可以用于检测蛋白在细胞中的表达水平，
通过比较不同细胞或不同条件下蛋白的表达水平，可以进一步研究蛋白的
功能和调节机制。
2.蛋白相互作用分析：免疫印迹可以用于检测蛋白与其他分子（如受体、配体等）的相互作用，从而揭示蛋白在信号传导通路或代谢途径中的
作用机制。
3.肿瘤标志物检测：免疫印迹可以用于检测肿瘤标志物，帮助早期诊
断和监测肿瘤的进展，为个体化治疗提供依据。
4.免疫原性研究：免疫印迹可以用于检测抗原的免疫原性，用于疫苗
研发和免疫治疗的评估。
5.药物筛选和评价：免疫印迹可以用于评估药物对特定蛋白的作用效果，帮助筛选和优化药物开发。
总之，免疫印迹是一种重要的生物技术方法，可广泛应用于生物学和
医学研究领域，为我们更深入地理解生命的奥秘提供了有效的工具和手段。
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色二、实验步骤1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗涤3 次；5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。
下面将详细介绍WB实验的具体步骤。
1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。
使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。
再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。
2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。
3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。
电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。
电泳结束后，将凝胶转移到膜上。
4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。
5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。
常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。
6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。
一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。
7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。
8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。
10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。
最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。
11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。
需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。
同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。
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2.6 免疫印迹（Western blot）
（1）裂解细胞，提取细胞总蛋白：收集细胞（约2×106），离心洗涤2次，加入100µL RIPA裂解液，置冰上反应30min，4℃12,000r/min离心15min，取上清，蛋白定量后分装，-80℃冻存备用；
（2）蛋白定量：Bradford法测定蛋白质含量[35]：
①分别在微量离心管中各加入0.5mg/mL BSA 5µL、10µL、15µL及20µL，
以0.15mmol/L的NaCl补足至100µL，同时以两管100µL的
0.15mmol/L的NaCl作空白对照。
②每管各加入900μL考马斯亮蓝G-250溶液，振荡混匀，室温放置2min。
③用1cm光径的微量比色杯测A595吸光值，取A595吸光值对标准蛋白浓
度作图，画出标准曲线，并测量待测样品的A595吸光值，从BSA标
准曲线中确定待测样品的浓度。
（3）SDS-PAGE电泳
①制胶
SDS丙稀酰胺凝胶
12％分离胶8％分离胶5％积层胶去离子水 3.3mL 4.6mL 2.7mL
1.5mol/L Tris-Cl(pH8.8)
2.5mL 2.5mL －
1.0mol/L Tris-Cl(pH6.8) －－0.5mL
30%丙稀酰胺 4.0mL 2.7mL 0.67mL
10% SDS 0.1mL 0.1mL 0.04mL
10%APS 0.1mL 0.1mL 0.04mL
TEMED 0.004mL 0.004mL 0.004mL
Total 10mL 10mL 4mL
其中10%APS和TEMED需等临灌胶之前再加入。
先配制好分离胶，在涡旋混合器上混匀，立刻用吸管将胶缓缓灌入到大小两块玻璃板之间，
至胶的最上缘距玻璃板顶端3cm左右。
再用去离子水覆盖在分离胶的上层，封闭空气使胶易于凝固。
室温静置1h左右可看到去离子水和胶之间由于折
射率不同而出现一条界限，说明胶已经凝好，可用注射器小心吸出上层的
去离子水。
在两层玻璃板间插好合适厚度和宽度的齿梳，再将积层胶灌制
在分离胶的上层，没过齿梳至玻璃板顶端。
室温静置20~30min左右，浓缩
胶可以凝好。
将齿梳拔出，小心取出玻璃板去掉两板间的间隔条，再将两
层玻璃板翻转，将大板朝外重新置于塑料套件中，将整个套件置于电泳槽
中，用去离子水冲洗上样孔，向电泳槽上下槽中加入适量电泳缓冲液。
②准备样品：向(10~20)µL样品/5μL蛋白marker加入2×Loading
buffer(1/2样品体积)，煮沸3～5min后取出，稍微离心。
③上样：用注射器加样，样品的蛋白量为50µg/孔，同时加蛋白marker。
④电泳：恒流10mA/板，当溴酚兰前沿到达分离胶时，电流改至15mA/
板，直至溴酚兰到胶底部时终止。
（4）转膜（湿转）：电泳结束后，关闭电源，取出玻璃板。
用塑料平铲撬开小板，切去上部的浓缩胶，将转膜用的夹子浸入盛有转移缓冲液的托盘中展开，按以下顺序安装黑色栅（阴性电极）、吸水海绵、三张滤纸、凝胶、标记好的PVDF膜（用前用甲醇浸泡1min）、三张滤纸、吸水海绵、红色栅（阳性电极）。
每放一层均用玻璃棒赶出层间气泡。
将夹子卡上放入电转移装置中，使PVDF膜朝向正极侧，胶则在负极侧，加入转移缓冲液。
在恒流200mA，4℃条件下，通过电转移将蛋白从SDS-PAGE胶转到硝酸纤维素膜上，转膜约2-3h，转移结束后，关闭电源，取出转印膜。
（5）免疫杂交
①将PVDF膜用1×TBS漂洗5min。
②10％牛奶封闭液封闭膜上的非特异性抗原位点，在水平脱色摇床上
室温震摇1h，转速90r/min。
③1×PBST 摇动洗膜3次，每次10min。
④加入用1×PBST稀释的HIF-1α兔多克隆抗体（1:500），4℃摇动过
夜。
⑤1×PBST 摇动洗膜3次，每次10min。
⑥ 加入用PBST （不含叠氮钠）稀释的辣根过氧化物酶（HRP ）标记的羊抗兔Ig （1:10,000）室温摇动孵育1h 。
⑦
1×PBST 摇动洗膜3次，每次10min 。
⑧ 显像：按Pierce 公司的ECL 试剂盒方法，通过HRP 使化学发光底物氧化发出蓝光可以使X 光胶片显影，进行荧光显迹反应，具体步骤如下。
⑨ 将膜放入现配的含过氧化氢/鲁米诺和对碘苯酚的底物混合液中，平稳摇动10min ，使膜和底物充分作用。
⑩ 取出膜将水滴干，以膜正面朝下放在一张透明的塑料保鲜膜上，向后折叠用保鲜膜将膜包裹好，排除其间的气泡。
将膜正面向上放入压片盒中，用胶带固定四角。
○11 在暗室中将X 光胶片压置在膜上，曝光1~3min 后取出X 光胶片，置于显影液中，至出现清晰图象（约2min ），取出沥干水分再置于定影液中2min 。
用清水冲洗胶片，晾干。
（6） 胶片用凝胶成像分析仪进行光密度扫描，用Bandscan 分析软件对图像条带作半定量分析，各组条带的光密度值结果以s x _表示，用SPSS10.0数据统计软件One-Way ANOV A 的LSD 对组间数据进行处理和分析。