文献综述 免疫印迹法
免疫印迹法（PDF）
免疫印迹法免疫印迹法（immunobiotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot 相类似，亦被称为Western-blot。
免疫印迹法分三个阶段进行。
第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min 转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。
常用的HRP底物为3，3’-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。
阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。
本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。
在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。
抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒，可方便地在实验室中供检测用。
根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。
一． SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）基本原理是聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体acr聚合成长链并通过双功能化合物甲叉双丙烯酰胺Bis交联而成的三维网状结构凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶的机械性、弹性、透明度、粘着度取决于凝胶的总浓度，总浓度越大，平均孔径越小，机械强度越强。
免疫印迹法在自身免疫性疾病中的应用价值
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本文 研 究 数 据 显 示,脑 卒 中 组 患 者 的 HCY 为 (１９．６４±８．１３)μmol/L,NTＧproBNP 为 (４１３．６３± ３２．４７)pg/mL,与健康 组 具 有 显 著 差 异,P＜０．０５,且 不同损伤 程 度 患 者 的 NTＧproBNP、Hcy 浓 度 及 不 同 梗死体积 的 患 者 的 NTＧproBNP、Hcy 浓 度 具 有 显 著 差异,P＜０．０５,表 明 HCY、NTＧproBNP 在 脑 卒 中 患 者中具有高 度 表 达,且 脑 梗 死 体 积 越 大,病 程 程 度 越 严重,其 NTＧproBNP、Hcy 浓 度 越 高,其 因 素 与 脑 卒 中所致的脑水肿致使颅内 压 力 急 剧 升 高,从 而 致 使 神 经低脂异常分泌,致使 NTＧproBNP、HCY 增加相关.
综上所述,NTＧproBNP 和 Hcy 检 测 在 脑 卒 中 患 者诊断中的应用意义显著,且 病 情 程 度 的 不 用 亦 导 致 NTＧproBNP 和 Hcy指标 具 有 显 著 差 异,临 床 中 可 将 其作为判定脑卒中病情严 重 程 度 的 重 要 指 标 之 一,值 得在临床中推广实施.
免疫印迹(5.4)
18兆去离子水调整总体积
40ml
每10ml RIPA裂解液放入0.1ml蛋白酶抑制剂cocktail. -20℃分装保存，临用前无需加入PMSF。
三、蛋白样品的变性
2×SDS-PAGE上样缓冲液：
① 100mM Tris-HCl(pH6.8) ② 200mM DTT ③ 4%SDS ④ 0.2%溴酚兰 ⑤ 20%甘油 ⑥ ddH2O
1M Tris-HCl (pH6.8) 10 ml
1M DTT
SDS 甘油 溴酚蓝 总体积
20 ml
4g 20 ml 0.2 g 100ml
1．尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢 失。
2．细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解， 低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解，蛋白酶抑制剂 的种类很多，要根据具体情况具体选择。 3．样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80℃。 切勿反复冻融已制备好的样品。 目的：要获得高丰度、高品质的蛋白质，以满足后续 实验的需求
ddH2O 样品
BCA(ML )
0 10
2
50 10
2
75
10 2
87.5
10 2
93.5
10 2
96.8
10 2
Bradford法敏感度高，并且与一系列干扰Lowry、BCA法的
还原剂（如DTT、巯基乙醇）相容。
与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受常用浓度去
垢剂的影响。
与Lowry法相比，BCA法操作更简单且稳定性更好，几乎没
免疫印迹技术方法研究
免疫印迹技术方法研究一、前言免疫印迹技术借助的是抗体与抗原的特异性结合的作用，来检测样品中蛋白质表达情况的一项免疫学检测技术，不需要复杂的大型机器，主要依靠凝胶电泳和电转移来对蛋白质提取，最终对蛋白质进行定性定量分析。
二、内容1、技术原理（1）样品的凝胶电泳：制备凝胶，加入样品进行凝胶电泳，使样品中蛋白质分离。
（2）电印迹：所谓电印迹就是将凝胶电泳上的经过分离的蛋白转移到一个固相膜上。
因为如果让蛋白质在凝胶电泳后直接检测，部分蛋白质会嵌在凝胶里面，探针无法到达，同时可能对蛋白质条带有破坏作用，因此为了方便探针与蛋白质互相结合，将其转移到另一个与探针结合度更好的物质上，也就是固相膜。
（3）选择性封闭：为避免探针和无关物质结合，将膜上没有结合蛋白质的部分封闭，防止其他干扰。
（4）免疫结合：将抗体与膜上的蛋白质结合，使其反应，再用二抗与一抗反应。
（5）产物检测：通过二抗间接检测目的蛋白，将膜上的抗体和能发出荧光的物质结合，对产生的发光物质进行检测。
2、方法(1)聚丙烯酰胺凝胶的制备:把玻璃板洗净并晾干,四边对齐，置于制胶架上。
其次配制分离胶，蛋白质的相对分子量不同制胶也不同。
分离胶制好后沿玻璃板上的一角缓慢、平稳地注入两层玻璃板中间,待其充分凝固后,把浓缩后的胶溶液沿玻璃板一角注入，立刻插入梳子。
(2)蛋白样品的前处理:将缓冲液和蛋白质样品按一定比例混合,待其沸腾若干分钟后,放入冰块中待用。
(3)样品上样和电泳:将制好的凝胶缓慢从架上取下,放进电泳槽,将缓冲液注入电泳槽,再拔出梳子。
吸取经过预处理的蛋白样品20μL加样。
打开电泳槽电源,选择稳压模式,100v左右的工作电压，待电泳时加入的指示染料到达胶底部时关闭电泳槽。
经凝胶电泳处理后，样品蛋白质带负电荷，在凝胶中游动，游动速度与分子量大小成反比，自阴极游到阳极。
（4）蛋白质转移（电转印）：将凝胶板取下,切去不用的部分,剪裁和凝胶一样大小的NC膜或PVDF膜,再在电转移液中浸泡固相膜，裁剪数张比凝胶尺寸稍微小一点的滤纸,放入缓冲液中浸泡。
Western Blot(免疫印迹法)
Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：⏹样品制备⏹电泳分离⏹蛋白的膜转移⏹免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂⏹1X 磷酸盐缓冲液(PBS)⏹Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM⏹1X SDS 样品缓冲液62.5 mMTris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT,0.01% w/v溴酚蓝⏹转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)⏹10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6⏹脱脂奶粉或BSA⏹甲醇⏹TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20⏹封闭缓冲液（TBS/T）1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA⏹一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
⏹预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
1．培养细胞或药物处理。
2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
免疫印迹法
自身免疫性疾 病的筛选试验 ANA检测
（－）
SLE治疗缓解
病情特重（大量IC沉积消耗抗体）
（＋）低滴度 高滴度 常见于RA等其它自身免疫性疾病 可作为诊断SLE的依据
ENA抗帮助诊断SLE
硬皮病 PM/DM 干燥综合症 抗AMA-M2：PBC
确诊试验
抗dsDNA、Sm、rib抗体
抗Scl-70 抗Jo-1抗体 抗SSA和抗SSB 胞浆自身抗体
自身免疫性疾病检测的应用原则
免疫球蛋白、 补体等检测
+
ANA筛选
抗胞浆型抗体鉴定
ENA抗体谱
其它自身抗体
怀疑自身免疫性疾病
怀疑系统性自身免疫疾病
怀疑器官特异性自身免疫疾病
类风湿因子、抗中性粒细 胞胞浆抗体、抗磷脂抗体 及其它自身抗体检测
④ 加入酶标二抗反应
③ 洗去未反应蛋白 ② 加入标本反应
E ENA检测方法 E
自身抗体
非特异 蛋白
① 纯化抗原膜条（膜条试剂盒）
临床常检测的抗ENA抗体谱主要包括： 抗U1-RNP 抗Sm 抗SSA 抗SSB 抗Scl-70 抗Jo-1 抗rib-P蛋白
抗可提取性核抗原（ ENA ）抗体 anti-extractable nuclear antigen antibodie
SS？
雷诺现象 干燥综合征？ 面肌痉挛，神经痛 睡眠障碍，头痛
1:3200颗粒型
1:1000颗粒型着丝点 型 1:320颗粒型 1:100颗粒型 1:100胞浆型
高效价斑点型常见于MCTD
核膜型（或周边型）
相关抗体：抗dsDNA抗体 与胶原病、PBC、慢性活动性肝炎等相关
核仁型
相关抗体：抗RNA聚合酶-1抗体、抗SCL-70抗体 与硬皮病相关
免疫印迹法原理
免疫印迹法原理
免疫印迹法是一种实验室技术，用来检测抗体与抗原之间的相互作用。
它是一种比较灵敏的技术，可以快速准确地测量抗体和抗原之间的交互作用。
这一方法的特点是可以检测到极低浓度的抗体，并且可以在短时间内完成测试。
免疫印迹法通常具有五个步骤：1）准备抗原：将抗原溶解在溶剂中，以便它能够与抗体结合。
2）制备抗体：将抗体溶解在溶剂中，以便它能够与抗原结合。
3）将抗体与抗原混合：将抗体和抗原混合，使它们能够形成结合物。
4）检测结合物：使用某种技术，如荧光技术，来检测抗体和抗原之间的结合物。
5）分析结果：对检测到的结合物进行分析，以确定抗体与抗原之间的交互作用。
免疫印迹法在医学诊断中有着重要的应用。
它可以用来检测抗体与抗原之间的结合，以确定患者是否患有特定病毒或疾病。
此外，它还可以用来检测肿瘤细胞，以确定是否有癌症。
免疫印迹法的优点是，它可以检测到极低浓度的抗体，可以在短时间内完成测试，并且可以检测出抗体与抗原之间的结合物。
它的缺点是，它只能检测出抗体与抗原之间的结合，而不能检测出抗体与抗原之间的其他关系。
免疫印迹法是一种灵敏、准确的技术，可以用来检测抗体与抗原之
间的结合，以确定患者是否患有特定病毒或疾病。
它可以快速准确地检测出极低浓度的抗体，并且可以在短时间内完成测试。
因此，免疫印迹法在医学诊断中具有重要的应用。
免疫印迹法的发展历程
免疫印迹法的发展历程免疫印迹法（Immunoblotting）是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定蛋白质分子在混合溶液中的存在以及测定其相对分子质量和含量。
通过将蛋白质分子分离和转移到膜上，并利用特异性抗体与目标蛋白结合，再利用染色剂或放射性探针进行检测，从而实现对目标蛋白的检测和分析。
下面将介绍免疫印迹法的发展历程。
一、发展起源免疫印迹法最初是在1979年由Burnette首次提出的，他将此技术称之为“Western Blotting”。
当时，Burnette的研究目的是检测并验证特定肿瘤抗原的存在，以及分析蛋白质的电泳方式。
他使用低分子量蛋白质分离电泳将蛋白质分子按照相对分子质量大小进行分离，并将其转移到硝酸纤维素膜上，然后利用特异性抗体与目标蛋白进行结合，最后通过染色剂进行检测。
二、技术元器件的更新随着技术的发展，免疫印迹法在实验操作上进行了一系列的改进。
使用硝酸纤维素膜转移蛋白质分子被逐渐取代，目前主要采用的是聚合物膜，如聚氟乙烯（PVDF）膜和聚丙烯酰胺（NC）膜。
与硝酸纤维素膜相比，聚合物膜具有更好的机械强度和耐用性，能更好地保留蛋白质分子的完整性。
另外，为了提高免疫印迹法的灵敏度和特异性，研究者们开始使用荧光标记的二抗和化学发光等新型探针。
这些探针能够与特异性抗体发生结合，并产生明亮的荧光或发光信号，从而在低浓度蛋白的检测中提供更高的灵敏性和检测精度。
三、自动化技术的应用随着计算机和自动化技术的飞速发展，免疫印迹法的实验操作也得到了极大的简化和提高效率。
自动化的蛋白质分离装置和转印装置的出现，使得整个实验过程更加标准化和稳定。
同时，计算机软件的运用，实现了蛋白质分析图像的定量化和数据分析结果的自动处理，大大提高了免疫印迹法的效率和可靠性。
四、多通道技术的发展在免疫印迹法的发展历程中，多通道技术的出现使得同时检测多个蛋白质成为可能。
传统的免疫印迹法需要进行多次染色和检测，而现在，研究者可以利用多通道技术，在同一膜上同时检测多个目标蛋白质，大大提高了实验效率。
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免疫印迹法近年发展综述
摘要：简述了免疫印迹法的原理和方法，并对近年来的应用作了简要概括，使读者能对免疫印迹法的近年发展有一定的认识，并对其未来的发展作展望。
关键词:免疫印迹法小分子蛋白间接疫荧光法 HIV抗体糖尿病
前言：蛋白免疫印迹法自发明以来，发展迅猛，本文对其近年来的发展作了简要概述。
正文：
1原理
蛋白免疫印迹技术(Westernblot)由美国斯坦福大学的乔治·斯塔克发明，其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白样品进行着色，再通过分析着色的位置和深度获得目的蛋白在样品中的表达情况信息[1-3]。
蛋白免疫印迹技术集凝胶电泳、蛋白转印和免疫学标记等三部分于一体，在现代生物医学中广泛应用[4,5]。
2方法简述
该项技术通过聚丙酰胺凝胶电泳分离目的蛋白质标本，并将其转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜，聚偏二氟乙烯膜等）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相对应的单克隆或者多克隆抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗起反应，经过底物显色检测电泳分离的特异性目的蛋白成分与含量[6-8]。
3应用
蛋白免疫印迹法自发明以来被广泛应用于现代生物学研究中的蛋白质定性和半定量分析[9]。
3.1免疫印迹法、酶联免疫法及放射免疫法对胰岛自身抗体检测的比较
采用免疫印迹法测定81例糖尿病患者胰岛自身抗体,将结果与酶联免疫法测定的GAD-A、ICA,放射免疫法测定IAA结果进行比较。
结论是放射免疫法检测IAA、酶联免疫法检测ICA阳性率均高于免疫印迹法,免疫印迹法检测GAD-A阳性率则高于放射免疫法[10]。
3.2检测小分子蛋白的实验条件优化研究
探讨免疫印迹法不同参数对小分子蛋白检测效果的影响，从而优化并获得最佳实验条件。
方法：比较不同转膜电压和时间、转移缓冲液甲醇含量、不同化学发光剂对小分子蛋白的检测效果。
结论是选用高电压、短时间组合，选择含20%甲醇转移缓冲液和飞克级化学发光剂信号均有助于小分子蛋白免疫印迹检测[11]。
3.3间接疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果的分析比较
比较间接免疫荧光法筛查抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱（谱）特异性抗体结果的一致性，分析二者的相互关系及临床意义。
结论是两种检测无统计学差异，但法对的筛查具有覆盖谱抗体面广的特点，而特异性自身抗体检测具有疾病特异性和较高的检测敏感性，并且两种方法学间存在检测敏感性和特异性的差异[12]。
3.4 HIV抗体不确定血清蛋白免疫印迹法检测条件的正交实验优化及应用
优化蛋白免疫印迹法（WB）对艾滋病病毒（HIV）抗体不确定血清的检测条件,并测试其检测效能。
以样本量100μＬ、样本孵育时间2小时、酶联合物孵育时间15分钟,为HIV抗体不确定血清的最优检测条件；同标准检测条件相比,优化检测条件对HIV阴性或阳性血清的检测效能一致，但对19例HIV抗体不确定血清的检测效能更高[13]。
3.5化学发光酶免疫法和免疫印迹法检测糖尿病自身抗体的结果分析
对比分析化学发光酶免疫法和免疫印迹法在糖尿病自身抗体检测中的应用效果。
结论CLISA法检测糖尿病自身抗体敏感性及特异性较IB法高，值得在糖尿病诊断中推广应用[14]。
3.6免疫印迹法的改良
通过改变添加抗体方式的不同达到改良的目的。
不同总量蛋白的免疫印迹法显并无显著性差异。
但是，相比常规方法改进法使用的抗体量更少，条带更容易检测得到。
结论：改进后的免疫印迹法能有效的节约抗体，操作方便，实用性强[15]。
结论:综上所述，免疫印迹法在蛋白质的检测方面有着重要作用，尤其在
医疗方面的应用有着巨大的影响和发展空间，近年来在这方面有许多研究。
其发展潜力是较大的，但目前更偏向于应用，未来可能在不同的蛋白质研究和人类疾病方面深入发展，以往的技术已较为成熟，对免疫印迹法的改良也可能还会做出更多成果。
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