免疫印迹技术ANA谱测定
免疫印迹法检测可提取性核抗原多肽抗体谱的临床应用
免疫印迹法检测可提取性核抗原多肽抗体谱的临床应用刘靳波;梁军;陈红英;温向琼【期刊名称】《中华医学写作杂志》【年(卷),期】2004(011)015【摘要】目的：探讨ENA多肽抗体谱在自身免疫性疾病临床诊疗中的作用。
方法：应用免疫印迹技术(IBT)对临床常见的6种自身免疫性痰病132例进行了抗ENA抗体检查，同时观察了间接免疫荧光法检查抗核抗体(IFANA)的结果。
结果：132例送检标本抗ENA多肽抗体谱总阳性率64．4％，且检出一种或一种以上抗ENA 抗体，系统性红斑狼疮(SLE)35例(77．8％)，多发性皮肌炎／皮肌炎(PM／DM)8例(42．1％)。
系统性硬皮病(PSS)5例(50％)，干燥综合征(SS)14例(87．5％)，混合性结缔组织病(MCTD)19例(100％)，类风湿性关节炎(RA)5例(20．8％)。
IFANA总阳性率71％。
结论：ENA多肽抗体谱检测对多种自身免疫性疾病的诊断和鉴别诊断有重要意义，ANA检测仍可作为自身免疫性疾病筛查的常规指标。
【总页数】3页(P1272-1274)【作者】刘靳波;梁军;陈红英;温向琼【作者单位】泸州医学院附属医院儿科;泸州医学院附属医院检验科，泸州市646000;泸州医学院附属医院肾病内科，泸州市646000【正文语种】中文【中图分类】R446【相关文献】1.自动蛋白印迹仪在检测抗可提取核抗原多肽抗体谱中的应用 [J], 钟丽民;方忠俊;周丽萍;邹广珠2.免疫印迹法检测可提取核抗原多肽抗体谱的临床应用分析 [J], 陆瑜;叶萍;沈霞;陈顺乐3.免疫印迹法检测可提取核抗原多肽抗体的评价 [J], 朱钰钰;甘小丹4.149例系统性红斑狼疮患者核抗原多肽抗体谱的检测 [J], 李月文;金淑仙5.免疫印迹法检测系统性红斑狼疮患者血清中ENA多肽抗体谱的探讨 [J], 游正芸;洪华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实验报告三--免疫印迹
实验三：免疫印迹1 原理免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
本试验采用湿法转移。
免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。
大多数应用前者。
本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。
转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。
目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。
本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。
2 试剂与仪器2.1 试剂（所有试剂均供两组用）2.1.1 转移缓冲液Tris 3.025g甘氨酸14.413g甲醇20mL加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS)Tris 2.42gNaCl 27.750g加蒸馏水约800mL，调pH至7.5，定容1000mL2.1.3 TTBSTBS 800mLTween-20 400μl2.1.4 封闭液及抗体稀释液脱脂奶粉0.3gTBS 100mL2.1.5 底物溶液二氨基联苯胺（DAB） 5.0mgTBS 18mLH2O220μl 临用前配2.1.6 丽春红总蛋白质染色液丽春红1g4%乙酸100mL2.1.7 5%小牛血清生理盐水小牛血清7.5mL0.85%生理盐水定容至150mL2.1.8 酶标抗IgG（1：1500）酶标抗IgG 0.1mL5%小牛血清生理盐水定容至150mL2.2 仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸3 试验步骤3.1 SDS-PAGE电泳分离所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从略。
欧蒙免疫印迹法（ANA谱3）模条本底颜色变深对结果影响2例分析
检测项目 病例 1 病例 2
ANA(S) ＜1:100 1:640
ANA核型 阴性 均质
表 1 2病例实验室检查结果
dsDNA(IU/mL) dsDNA荧光
4.58 633.34
阴性 强阳性
G(g/L) 64.3 37.6
IgG(mg/dL) -
2580
肝纤 4项 ↑ -
通讯作者：李 发 爵
有些研究中!在深色背景下!只要能观察到特 异性抗原位置条带阳性!均可视为明确阳性%若背 景颜色过深而严重影响到结果判读! 则样本不适 用于该检测体系!可考虑采用其他的检测方法(如 '3BD:)进行检测& 但本研究中血清稀释法再加上 BBC 作为补充也不失为一种简便易行的方法& 由于 观察样本例数有限! 在今后的工作中增加观察例 数及与临床的结合! 以对此类问题有一个比较全 面的了解& 参考文献
+530+
实验与检验医学 !"!# 年 $ 月第 %& 卷第 % 期 '()*+,-*./01 0.2 3045+0/5+6 7*2,8,.*9 :;<=!"!#9>51=%&9?5=%
·病例报告·
欧蒙免疫印迹法（ANA谱 3）模条本底颜色变深对 结果影响 2例分析
章晓霞 1，李发爵 2，李湘成 3，陈民 2，苏悦 2，付红 2，彭丽平 2，梁小燕 2
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学 !""N !C & M&DM!= (收稿日期 2021-02-22Q
ANA谱检测及其意义
ANA谱汇总抗U1-n RNP抗体：高滴度的该抗体是混合性结缔组织病（MCTD，夏普综合征）的标志，阳性率为95—100%，抗体滴度与疾病活动性相关。
在30—40%的系统性红斑狼疮患者中也可检出该抗体，但几乎总是有抗Sm抗体。
抗Sm抗体：系统性红斑狼疮的特异性抗体，与抗ds DNA抗体一起，是系统性红斑狼疮的诊断标志。
但阳性率仅为5—10%。
抗SS-A抗体：与各类自身免疫性疾病相关，最常见于干燥综合征（40—80%）、也见于系统性红斑狼疮（30—40%）和原发性胆汁性肝硬化（20%）中，偶见于慢性活动性肝炎。
此外，在100%的新生儿红斑狼疮中抗SS-A抗体阳性。
该抗体可经胎盘传给胎儿引起炎症反应和新生儿先天性心脏传导阻滞。
抗SS-B抗体：几乎仅见于干燥综合征（40—80%）和系统性红斑狼疮（10—20%）的女性患者中，男女比例为：1∶29。
在干燥综合征中抗SS-A抗体和抗SS-B抗体常同时出现。
抗Scl-70抗体：见于25—75%的进行性系统性硬化症（弥散型）患者中，因实验方法和疾病活动性而异（Scl=硬化症）。
在局限性硬化症中不出现。
抗PM-Scl抗体：常见于多肌炎与硬化症的重叠综合征中，50%的该抗体阳性患者为肌炎与硬化症的重叠综合征，抗PM-Scl抗体也可见于单独的多肌炎患者中，阳性率为8%，在弥散型硬化症中的阳性率为2—5%。
抗Jo-l抗体：见于多肌炎，阳性率为25—35%。
常与合并肺间质纤维化有关。
抗着丝点抗体：与局限型进行性系统性硬化症（CREST综合征：钙质沉着、Raynaud＇s病、食管功能障碍、指硬皮病、远端血管扩张）有关，阳性率为70—90%。
在原发性胆汁性肝硬化患者中也可检测到该抗体（阳性率为10—30%）。
还可出现于雷诺氏综合征中。
抗PCNA抗体：PCNA为增殖性细胞核抗原，其表达与细胞周期有关。
抗PCNA抗体为系统性红斑狼疮的特异性抗体，但阳性率仅为3%。
有文献报道，抗PCNA抗体可能与系统性红斑狼疮患者发展为弥散性增殖性肾小球肾炎有关。
ana谱检查报告怎么看
ana谱检查报告怎么看当我们拿到一份 ana 谱（抗核抗体谱）检查报告时，可能会感到一头雾水，不知道如何解读其中的各项指标和结果。
别担心，接下来我将用通俗易懂的方式为您详细介绍如何看懂 ana 谱检查报告。
首先，我们来了解一下什么是 ana 谱检查。
抗核抗体谱是一组针对细胞核内各种成分的自身抗体的检测，它对于诊断自身免疫性疾病具有重要的意义。
常见的自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征、系统性硬化症等等。
在 ana 谱检查报告中，通常会包含多种抗体的检测结果。
其中一些常见的抗体有抗双链 DNA 抗体（dsDNA）、抗 Sm 抗体、抗 RNP 抗体、抗 SSA 抗体、抗 SSB 抗体等等。
先来说说抗双链 DNA 抗体。
如果这个抗体呈阳性，尤其是高滴度阳性，那么对于系统性红斑狼疮的诊断具有较高的特异性。
但需要注意的是，有时候其他疾病也可能会导致这个抗体出现低滴度的阳性。
抗 Sm 抗体对于系统性红斑狼疮的诊断也非常特异，如果检测出这个抗体阳性，往往提示患有系统性红斑狼疮的可能性较大。
抗 RNP 抗体阳性，在混合性结缔组织病中较为常见，但在其他一些自身免疫性疾病中也可能会出现。
抗 SSA 抗体和抗 SSB 抗体与干燥综合征密切相关。
如果这两个抗体阳性，再结合患者的口干、眼干等症状，医生会考虑干燥综合征的诊断。
除了关注抗体是否阳性，抗体的滴度也非常重要。
一般来说，滴度越高，提示疾病的可能性越大，但这也不是绝对的，还需要结合患者的具体症状、体征以及其他检查结果来综合判断。
此外，ana 谱检查报告中还可能会有一些其他的指标，比如核型。
常见的核型有均质型、斑点型、周边型等等。
不同的核型可能提示不同的疾病倾向，但同样不能仅凭核型就做出诊断。
当我们拿到报告后，首先要看清报告上的各项指标名称和对应的结果。
如果是“阳性”，要注意后面标注的滴度值。
同时，要将报告拿给医生进行解读。
医生会综合考虑患者的症状、病史、体格检查以及其他相关的检查结果，比如血常规、尿常规、肝肾功能、免疫球蛋白等等，来做出最终的诊断。
免疫印迹法
自身免疫性疾 病的筛选试验 ANA检测
（－）
SLE治疗缓解
病情特重（大量IC沉积消耗抗体）
（＋）低滴度 高滴度 常见于RA等其它自身免疫性疾病 可作为诊断SLE的依据
ENA抗帮助诊断SLE
硬皮病 PM/DM 干燥综合症 抗AMA-M2：PBC
确诊试验
抗dsDNA、Sm、rib抗体
抗Scl-70 抗Jo-1抗体 抗SSA和抗SSB 胞浆自身抗体
自身免疫性疾病检测的应用原则
免疫球蛋白、 补体等检测
+
ANA筛选
抗胞浆型抗体鉴定
ENA抗体谱
其它自身抗体
怀疑自身免疫性疾病
怀疑系统性自身免疫疾病
怀疑器官特异性自身免疫疾病
类风湿因子、抗中性粒细 胞胞浆抗体、抗磷脂抗体 及其它自身抗体检测
④ 加入酶标二抗反应
③ 洗去未反应蛋白 ② 加入标本反应
E ENA检测方法 E
自身抗体
非特异 蛋白
① 纯化抗原膜条（膜条试剂盒）
临床常检测的抗ENA抗体谱主要包括： 抗U1-RNP 抗Sm 抗SSA 抗SSB 抗Scl-70 抗Jo-1 抗rib-P蛋白
抗可提取性核抗原（ ENA ）抗体 anti-extractable nuclear antigen antibodie
SS？
雷诺现象 干燥综合征？ 面肌痉挛，神经痛 睡眠障碍，头痛
1:3200颗粒型
1:1000颗粒型着丝点 型 1:320颗粒型 1:100颗粒型 1:100胞浆型
高效价斑点型常见于MCTD
核膜型（或周边型）
相关抗体：抗dsDNA抗体 与胶原病、PBC、慢性活动性肝炎等相关
核仁型
相关抗体：抗RNA聚合酶-1抗体、抗SCL-70抗体 与硬皮病相关
免疫荧光检测
免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案）荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。
荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。
荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。
荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。
本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。
抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。
抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。
如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。
加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。
试剂与器材1．抗原片现多用商品试剂。
如需自行制备，方法如下：(1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。
将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。
将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。
冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。
(2)Hep-2细胞抗原片制备：Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。
经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。
干燥后，用无水乙醇固定。
(3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。
-30℃保存备用。
2．异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体(FITC-抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。
ANA谱3在自身免疫性疾病诊治中的临床应用
• 论 著 •215[15] 薛桥,王士雯,翟金月,等.国产伊贝沙坦与进口缬沙坦降压疗效的比较[J].中华老年心脑血管病杂志,2001,3(6):431.[16] 凌左明,陶绕生.缬沙坦治疗原发性高血压临床对比观察[J].药物流行病学杂志,2003,12(6):297-298.[17] 夏志勇.非洛地平缓释片并缬沙坦治疗老年高血压的临床观察[J].心血管康复医学杂志,2005,14(6):567-569.[18] 郑东诞,曾群英,王强,等.伊贝沙坦与缬沙坦治疗高血压病的疗效和安全性的临床研究[J].中西医结合心脑血管病杂志.2005,3(10):851-853.[19] 孙志刚,郭方明,杨国宽,等.缬沙坦治疗海员高血压的临床研究[J].中华航海医学与高血压医学杂志,2004,11(3):178-179.[20] 关红梅,杜玉彬,韩丽平,等.缬沙坦治疗原发性高血压的临床观察[J].心血管康复医学杂志,2004,13(1):61-62.[21] 杨昌民,张允霞.缬沙坦联合药物治疗原发性高血压的临床观察[J].山东医药,2004,44(25):26.[22] 林阳,白树功,朱小玲,等.厄贝沙坦治疗轻中度原发性高血压的临床研究[J].中国现代应用药学杂志,2003,2O (6):517-519.[23] 李伟,许波宁.贝那普利与缬沙坦合用治疗轻中度原发性高血压的临床观察[J].辽宁药物与临床,2003,6(2):71-72.[24] 范毅敏,曾群英,麦炜颐,等.A C E I 与A Tl 受体拮抗剂合用治疗轻中度原发性高血压的临床观察[J].国外医学.心血管疾病分册,2002,29(2):112-115.[25] 张云,李石,郭冀珍,等.国产缬沙坦治疗原发性高血压病的疗效和安全性评价[J].中国新药杂志,2001,10(5):363-365.[26] 王高频,陆红.缬沙坦与依那普利治疗原发性高血压70例[J].中国新药杂志,2001,10(5):374.[27] 曾群英,麦炜颐,何清,等.两种A T1拮抗剂治疗轻中度原发性高血压的临床研究[J].中国临床药理学杂志,2001,17(3):182-185.[28] 魏广和,高东升,张金国,等.缬沙坦和苯那普利治疗高血压病的临床对照研究[J].济宁医学院学报,2000,23(3):28-29.[29] 曾群英,麦炜颐,何清,等.缬沙坦治疗轻、中度原发性高血压的临床研究[J].新医学,2000,31(12):716-718.[30] 吴洪德.缬沙坦治疗轻中度高血压病的临床疗效[J].中国航天工业医药,2004,2(4):29-31.ANA谱3在自身免疫性疾病诊治中的临床应用陈效琴（广元市中心医院检验科，四川 广元 628000）【摘要】目的 讨论ANA 谱3检测在自身免疫性疾病诊治中的临床应用。
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罗俐梅
Westernblot法
SDS-PAGE电泳
转移电泳
酶免疫检测
条带印迹法: ANA谱
纯化抗原的免疫印迹法
纯化可提取性细胞核抗原（ENA）包 被于硝酸纤维膜上，待测血清标本 与之反应，如存在相应抗体，则会 结合上去，并进一步结合酶标记的 二抗，经酶底物显色即可观察到相 应的抗体。
全部操作应振摇进行，否则检测敏感性会有所下 降。 不同血清标本，显色强度会有不同，弱阳性结果 需仔细观察。
试剂需恢复至室温方可使用，否则会影响检测结 果。
试验准备
分为 5组 ,每组取 1个病人标本 , 在一个反应板上试 验。 其中一组增加阴性和阳性质控。
各组需领取以下物资：
待测标本1份
阴性和阳性质控1份（第1组）
操作步骤
润膜：取出反应槽，每槽加入 1.5ml样本稀释液，缓慢于 室温孵育5分钟,将膜条充分润湿，倒掉样本缓冲液 加样：然后在每个槽中加入样本缓冲液 1.5mL ，并加入待 检血清或质控血清 15μ L，充分混匀，缓慢在室温振摇孵 育30分钟。 洗涤：弃去槽内液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗涤 3 次，每次每槽加稀释洗涤液1.5ml，洗涤5分钟/次。
操作步骤
加酶：每槽加入稀释后酶标抗体1.5mL，混匀，缓 慢在室温摇床上孵育30分钟。 洗涤：同前洗涤。
显色：每槽加入显色液1.5mL，室温反应10分钟
终止：每槽弃去反应液，用蒸馏水洗涤三次，取 出膜条，有序贴于结果分析页上，待膜条干后进 行结果判断。Fra bibliotek影响因素
未用完的洗涤液弃之，不可留作下次用。
免疫印迹法检测ENA谱的原理 ⑥ 加底物显色，观察结果 ⑤ 洗去多余酶标二抗
④ 加入酶标二抗反应
③ 洗去未反应蛋白 ② 加入标本反应
E ENA检测方法 E
自身抗体
非特异 蛋白
① 纯化抗原膜条（膜条试剂盒）
试剂
样本稀释液:直接使用 工作洗涤液：直接使用（已配好） 酶标记二抗:直接使用（已配好） 底物:直接使用
反应板和吸水纸 样本缓冲液1瓶 样本洗涤液（已稀释）1瓶 酶标记抗体（已稀释）共用
底物1瓶
结果解释
首先观察第一条质控线应显色才可判读结果，若 不显色则说明试剂失效或实验失败，需复查。 将膜条上显色区带与抗体位置对应抗体带对照， 即可判断出阳性抗体.
抗可提取性核抗原（ENA）抗体
抗nRNP抗体：MCTD 95 -100%（高滴度） 抗Sm抗体：SLE标记性抗体（20%-30%） 抗SSA抗体：PSS 60 -75%，其它CTD 抗RO52抗体:意义不明 抗SSB抗体： PSS 10 -40%，其它CTD 抗Scl-70抗体：SSc 25 -75%, 标记性抗体 抗Jo-1抗体：PM/DM 25%，标记性抗体 抗rib抗体： SLE特异性抗体（10%-30%）