Western印迹杂交
Southern&northern&western杂交原理
Southern杂交Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。
一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。
Northern 印记杂交Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot 的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
Western杂交原理：是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。
其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。
先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。
Western印迹
Western blot
抗HRP HRP
抗生物素 生物素 生物素化二抗 一抗 组织抗原
实验材料
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1．29:1聚丙烯酰胺凝胶 2．Tris-甘氨酸电泳缓冲液： 25mM Tris 碱 250mM 甘氨酸 0.1%(m/v) SDS 3．1×SDS凝胶加样缓冲液： 50mmol/L Tris-Cl (pH6.8) 100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT） 2% (m/v) SDS 0.1% (m/v) 溴酚蓝 10% 甘油 临用前加DTT，DTT可用0.01M 乙酸钠（pH5.2）配成1mmol/L母液。 4．转移缓冲液： 25mM Tris 碱 193mM 甘氨酸 20% 甲醇 5．1×TBS： 20mM Tris-HCl 150mM NaCl 最后调pH值至7.4 6．TBST: TBS中加入0.05% Tween-20。 7．封闭液：用TBST配制5%脱脂奶粉。 8．Stripping Buffer： 100mM β巯基乙醇 2%(m/v) SDS 62.5mM Tris-H次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别 较大则只需用TBST洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗 杂交开始，后续步骤同前。 • 如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近 则需更强的洗涤，可用 strip strip液（可用杂交袋）于室温摇动 洗涤30min~60min，然后用TBST洗涤10min×3次，再从封 闭开始，后续步骤同前。 • 对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条 带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃ 洗涤30min，然后用TBST洗涤10min×3次，再从封闭开始， 后续步骤同前。
蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot）技术手册
蛋白免疫印迹杂交 Western Blot 技术手册蛋白免疫印迹杂交 Western Blot WB 是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离 再转移到杂交膜blot 上 然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。
本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析 有助于成功完成WB。
A 蛋白样本提取制备1 细胞或组织裂解2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂3 蛋白定量4 电泳上样样品的准备B 电泳 1 PAGE胶的制备2蛋白分子量Marker 3 阳性对照4 内参对照5 上样与电泳 C 转膜与显色Western Blot 1 胶中蛋白的检测2 蛋白转膜3 膜上蛋白的检测 丽春红4膜的封闭 5 一抗的孵育6 二抗的孵育7 显色 D 常见问题分析与解决方案附录1 WB实验试剂配制方法附录2 SDS-PAGE胶的配制2WB概述: 检测原理: 3A 蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步 更是决定WB成败的关键步骤 总体原则和注意事项 1 尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白 通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品 2 保持蛋白的处于溶解状态 通过裂解液的PH 盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择 3 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等 低温操作 加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂 4 尽量去除核酸 多糖 脂类等干扰分子 通过加入核酸酶或采取不同提取策略 5 样品分装 长期于-80℃中保存 避免反复冻融。
A-1 细胞或组织裂解A-1-1 细胞裂解裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysis buffe 推荐试剂盒全细胞NP-40 or RIPA 附录1 全蛋白抽提试剂盒细胞质 可溶蛋白 Tris-HCl 附录1 胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质 细胞骨架等不溶蛋白Tris-Triton 附录1 蛋白分级抽提试剂盒细胞质 磷酸化蛋白 磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA 附录1 膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA 附录1 核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA 附录1 线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法 1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次 裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂 种类与量见本节2 2 吸净PBS 加入预冷的裂解液 1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask. 3 用细胞刮子刮取贴壁细胞 将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中 4 4℃摇动30 min 5 4℃离心12000 rpm 20 min 根椐细胞种类不同调整离心力 6 轻轻吸取上清 转移至新预冷的微量离心管中置于冰上 即为蛋白样本 弃沉淀. A-1-2 组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织 尽量置于冰上以防蛋白酶水解 2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中 加入液氮冻结组织于冰上均质研磨 长期可保存于-80°C 3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer 冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时 裂解液体积与组织样本量有适当比例 最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml. 4 4℃离心12000 rpm 20 min 轻轻吸取上清 转移至新预冷的微量离心管中置于冰上 即为蛋白样本 弃沉淀A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 4 推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL 或按下表配制 备注 其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下 所有步聚均需在通风橱中进行 1. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液. 2. 用盐酸HCl 调至pH 9.0 3. 煮沸至溶液无色尽量减少水分挥发. 4. 冷却至室温 5. 再调pH 至9.0 6. 再煮沸至无色7. 重复上述过程直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0 8. 用水定容至原体积9. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用. A-3 蛋白定量Bradford 法Lowry 法或BCA 法 均有商品化试剂盒可选择 操作简单、需分光光度计或酶标仪 小牛血清白蛋白BSA 作为标准曲线。
Western Blot(免疫印迹法)步骤
主要包括以下 4 个基本步骤：样品制备；电泳分离；蛋白的膜转移；免疫杂交与显色――蛋白检测。
溶液和试剂1. 1X 磷酸盐缓冲液(PBS )2. ModifiedRIPAbuffer：Tris-HCl:50 mM, pH 7.4； NP-40: 1%；Na-deoxycholate: 0.25%；NaCl: 150 mM；EDTA :1 mM；PMSF: 1 mM；Aprotinin,leupeptin,pepstatin:1 microgram/ml each；Na3VO4: 1 mM；NaF: 1 mM3. 1X SDS 样品缓冲液：62.5 mMTris-HCl(pH 6.8 于25° C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mMDTT, 0.01% w/v溴酚蓝4. 转移缓冲液：25 mM Trisbase, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3)5. 10X Tris缓冲盐 (TBS)：准备1L 10X TBS：24.2 g Trisbase, 80 g NaCl；用1N HCl调pH为 7.67. 甲醇8. TBS/T缓冲液：1X TBS, 0.1% Tween-209. 封闭缓冲液(TBS/T)：1X TBS,0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA10. 一抗的稀释：1X TBS,0.1% Tween-20 加 5% BSA ( 多抗) 或 5%脱脂奶粉( 单抗)。
Note：一般来说，BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率。
样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
1.培养细胞或药物处理。
2.弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
3.加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate,100μl /w或 75 cm2 plate,500- 1000μl/瓶) ，刮落细胞，转移到Ep管。
Western杂交
操作步骤：
编辑本段
原理
Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
Western Blot编辑本段回目录此项技术是一种蛋白质的固定和分析技术，是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，其程序Sonthern Blot相似，故称为Western Blot,第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗(同位素或非同位素的酶)来检测，此方法可检测1ng抗原蛋白。Western杂交方法灵敏度高，通常可从植物总蛋白中检测出50ng的特异性的目的蛋白。
(2)用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在Scotch-Brit Pad上，在胶的阴性端放上滤纸，胶的表面用该缓冲液浸湿，排出所有气泡。
(3)在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜，排出气泡，再在滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放一个Scotch-Brit Pad。
蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)图示
10、100、1000 uL 枪头与移液枪、EP 管、EP 管防爆夹、96 孔板、单格或 5 格孵育盒、镊子、锡纸、保鲜膜、
滤纸、乳胶手套、薄膜手套、医用口罩等
A 蛋白样本提取制备
A-1 细胞或组织裂解
A-2 蛋白定量
A-3 电泳上样样品的准备 一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要
(2) 主要试剂： 1） RIPA 等裂解液 2） 2×或 5×或 6×或 10×蛋白上样缓冲液 3） 彩色预染蛋白质分子量标准 4） 四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine, TEMED） 5） 10%过硫酸铵（ammomium persulfate, APS） 6） TrisCl,1.5M(PH 8.8) 缓冲液 7） TrisCl,1M(PH6.8) 缓冲液 8） 30% Acr-Bis(29:1) (即 30% acrylamide-bisacrylamide) 9） 甘氨酸（Glycine） 10）Tris 碱（Trisbase） 11）十二烷基硫酸钠（SDS） 12）甲醇（methanol） 13）吐温-20（Tween-20） 14）牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉 15）PVDF 膜 16）ECL 显色底物 A 液和 B 液 （3）抗体 1）β-Actin 等内参抗体 2）辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG 等带 HRP 的二抗 3）指标抗体
C-7 显色 (化学发光法) 现在最常用的是化学发光法：HRP 化学发光底物 Lumino（l ECL 法 chemiluminescence）及其改良法， 对
于 HRP 偶联的二抗，一般传统上使用 ECL 和 ECL+，推荐使用后者，更灵敏。其中不同商家的产品特点总 结 如下表：
蛋白免疫印迹杂交(WesternBlot)技术手册
蛋白免疫印迹杂交〔Western Blot〕技术手册A蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting 的第一步，更是打算WB 成败的关键步骤，总体原则和留意事项：1：尽可能提取完全或降低样本简洁度只集中于提取目的蛋白〔通过承受不同提取方法或选择不同的试剂盒产品〕2：保持蛋白的处于溶解状态〔通过裂解液的PH 盐浓度外表活性剂、复原剂等的选择〕3：提取过程防止蛋白降解、聚拢、沉淀、修饰等，〔低温操作，参与适宜的蛋白酶和磷酸酶抑制剂〕4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子〔通过参与核酸酶或实行不同提取策略〕5：样品分装，长期于-80℃中保存，避开反复冻融。
A-1细胞或组织裂解A-1-1细胞裂解裂解液Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推举裂解液Lysis buffe 推举试剂盒全细胞NP-40 or RIPA〔附录1〕全蛋白抽提试剂盒细胞质〔可溶蛋白〕Tris-HCl〔附录1〕胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质〔细胞骨架等不溶蛋白〕Tris-Triton〔附录1〕蛋白分级抽提试剂盒细胞质〔磷酸化蛋白〕磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA〔附录1〕膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA〔附录1〕核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA〔附录1〕线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法：1培育的细胞经预冷的PBS 漂洗2 次，裂解液中参与蛋白酶和磷酸酶抑制剂〔种类与量见本节2〕2吸净PBS，参与预冷的裂解液，〔(1 ml per 107cells/100mm dish/150cm2flask; 0.5ml per 5x106cells/60mm dish/75cm2flask).3用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温存地转移至预冷的微量离心管中，44℃摇动30 min54℃离心12,000 rpm，20 min〔根椐细胞种类不同调整离心力〕6轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.A-1-2组织裂解1 用灭菌的预冷的工具分别目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf 管中，参与液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，3每约5 mg 参与约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2 小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，〔最终的蛋白浓度至少到达0.1 mg/ml, 抱负的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).44℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,A-2蛋白酶和磷酸酶抑制剂推举购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL。
Western印迹杂交分析p53蛋白在人鼻咽癌中的表达
Western印迹杂交分析p53蛋白在人鼻咽癌中的表达郑美莲 区宝祥 龙江斌 邓满泉 陈丽珍 梁启万 李辉梅(中山医科大学肿瘤防治中心;广州,510060)摘 要 目的:探讨p53蛋白在人鼻咽癌中的表达及其临床意义。
方法:采用Western印迹法结合免疫沉淀技术,检测鼻咽活检组织p53蛋白表达。
结果:104例鼻咽癌活检组织中,12例(11 5%)p53蛋白突变;8例鼻咽慢性炎症活检组织中,p53蛋白表达未见异常。
鼻咽癌病人中IgA/VC A抗体滴度 1 160者p53蛋白突变检出率11 8%(11/93),IgA/VCA抗体滴度 1 80者,p53蛋白突变检出率9 1%(1/11)。
IgA/EA抗体滴度阳性者,p53蛋白突变检出率14 1%(11/78),IgA/EA抗体滴度阴性者,p53蛋白突变检出率3 8%(1/26)。
p53蛋白表达异常的鼻咽癌病人中,有2例复发。
结论:鼻咽癌p53蛋白的异常表达多见于恶性程度较高,分期较晚,IgA/VC A滴度高和IgA/EA阳性的病例,提示p53基因在鼻咽癌中可能发挥一定的作用。
主题词 鼻咽肿瘤;基因,p53;印迹法,蛋白质中图号 R739.63Western Blot Analysis of p53Protein Expression in HumanNasopharyngeal CarcinomaZheng Meilian Ou Baoxiang Long Jianbin Deng Manquan Chen Lizhen Liang Qi w an Li Huimei(Cancer Institute,Sun Yat sen University of Medical Sciences,Guangzhou,510060)Abstract Objective:To investigate the expression of p53protein in nasopharyngeal carcinoma and its clinical sig nificant.Methods:Western blot hybridization and im munopercipitation techniques were used to examine protein expres sion of p53gene in human nasopharyngeal biopsy.Results:The104nasopharyngeal carcinoma biopsy12(11.5%) showed abnormal expression of p53protein.Abnormal expression of p53protein was not found in8biopsy of the na sopharyngeal chronic inflammation.The protein abnor mal of p53gene were11.8%(11/93)and9 1%(1/11)in na sopharyngeal carcinoma with EBV I gA/VCA 1 160and EBV IgA/VC A 1 80,respectively.The p53protein positive rates of mutation type were14 1%(11/78)and3 8%(1/26),respectively in nasopharyngeal carcinoma with EB V IgA/ EA positive and negative.2patients was found cancer rec urrence in12patients of p53protein abnormal e xpression. Conclussion:The study sho wed that the p53protein abnormal e xpression in patients was frequent in higher malignant de gree,later sta ge,higher IgA/VC A antibody titre and I gA/E A seropositive.It suggested that the p53gene might pay a certain role in nasopharyngeal carcinoma。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白质样品制 备
SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离蛋白
质
转膜
封闭
杂交
加入特异抗性体（一抗）， 膜上的目的蛋白（抗原）
抗原与抗体发生特异性结 合，进行一抗杂交，然后 二抗再与一抗结合，进行 二抗杂交。
酶标显色
蛋白质ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ品制 备
二
抗
与 SDS-聚丙烯酰胺凝
胶电泳分离蛋白 质
底 物
转膜
反
应
显
封闭
色
杂交
显色发光
对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有
杂交
机溶剂提取，包括乙醇、
丙酮和丁醇等。
显色发光
蛋白质样品制 备
SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离蛋白
质 转膜
封闭
杂交
显色发光
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳能 有效的分离蛋白质,主要依据 其分子量的差异 ，分子量小
的蛋白质比分子量大的走得 快，从而在凝胶上形成一系 列分子量大小不同的条带， 达到分离蛋白质的目的。
蛋白质样品制 备
SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离蛋白
质
转膜
封闭
杂交
因为固相载体能以非共价键 的形式吸附蛋白质，且能保 持电泳分离的多肽类型及其 生物学活性，所以可以把经 过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离的蛋白质样品，转移到 固相载体上。
显色发光
蛋白质样品制
备
膜选择的根据主要有：
SDS-聚丙烯酰胺凝 a. 膜与目的蛋白分子的结合能力，
胶电泳分离蛋白 （决定单位面积的膜能结合蛋白的
质
载量)，以及膜的孔径,（决定拦截
转膜
蛋白的大小）；
b. 不影响后续的显色检测，也就是
适和用于所选的显色方法
封闭
Western Blot印迹常用的转移膜主
杂交
要是硝酸纤维素膜和PVDF膜
酶标显色
蛋白质样品制 备
SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离蛋白
质
转膜
应用
可以非常有效的鉴定某一蛋白质（或表位） 的性质；结合免疫沉淀法，可以用来定量 分析小分子抗原 。
Thank you！
基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝 胶转移至一种固相支持体，然后用这种 多肽的特异性抗体来检测。
蛋白质样品制 备
基本步骤
SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离蛋白
质
转膜
封闭
1.水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。
稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白
质最常用的溶剂 。 2.有机溶剂提取法
半干式转膜 将凝胶和固相基质象三明治一样加 在用缓冲液湿润滤纸之间，电转 10－30min。
封闭
杂交
显色发光
蛋白质样品制 备
SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离蛋白
质
转膜
封闭
杂交
将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶 液中温育，将膜上的非特异性 位点封闭，防止其与下一步反 应中的一抗结合，干扰实验结 果。
显色发光