Southern blot
Southern blot
• ddH2O稍加漂洗后空气中自然干燥
实验步骤
六.杂交和洗膜
• 将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 60℃封 闭6小时。
• 倒出预杂交液,加杂交液,60℃杂交过夜。 • 回收杂交液 (可重复使用), 将膜放在洗膜溶
液I中,室温洗2次,每次摇动5分钟。 • 再在洗膜溶液II中(60℃预热后直接倒进表面
16 μl 2 μl 2 μl
总体积
20 μl 总体积
20 μl
37℃保温1.5h。
实验步骤
二. 1％琼脂糖电泳
两组共用一块凝胶，共7个样
1.基因组DNA10 mg
组 2.酶切样品（1）
1
3.酶切样品（2）
4.阳性对照（pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切 后的8.5 kb线性片段，10pg/ml, 10ml)
影响杂交的因素
4）杂交液的离子强度
低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加(Na+ 的作用)
高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序列不完 全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液中较高的盐 浓度;
5）非特异性杂交反应：预杂交的作用
杂交前封闭膜上非特异性杂交位点,减少其对探针的非特 异吸附
实验步骤
• 切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上，赶 走滤纸与胶之间的气泡
实验步骤
• 再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上，同样不 能有气泡，然后放上三张浸湿的滤纸，赶走气 泡
实验步骤
• 紧贴凝胶四周各放一张X光片
实验步骤
• 小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要 紧贴滤纸，但不能让滤纸移动
实验步骤
Hale Waihona Puke 1d检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色）
Southern Blot操作流程
Southern Blot 操作流程1、哺乳动物基因组DNA 的提取（或用OMEGA 试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit ） 1、 取约30mg 样品，加入600 ul SNET ，再加入12 ul （20.2mg/ml ）的蛋白酶K ，使蛋白酶K 的终浓度为400ug/ml ； 2、 55℃振荡过夜；3、 加入0.6 ul RNaseA ，室温下孵育10 min ，后置于65℃ 10 min ；4、 加入300 ul Tris 饱和酚，288 ul 氯仿和12 ul 异戊醇，室温下振荡30 min ；5、 17,000 g 离心5min ，转移上层水相（600 ul ）至一新的离心管；6、 加入等体积（600 ul ）的异丙醇沉淀DNA ，于4℃下13,250 g 离心15 min ；7、 小心除去异丙醇，加入1 ml 70%的乙醇。
离心5 min 后除去乙醇，室温下干燥15~20 min ；8、 加入100 ul TE ，使核酸沉淀溶解。
一、 酶切1、 拷贝数的计算哺乳动物基因组全长3.0×109个碱基对，按插入基因单拷贝计算如下：()gplasmidof mass bpbp DNA of Insertionμ10100.39=⨯2、 酶切体系基因组DNA 10 ug 10*Buffer 10 ul 酶(10U/ul) 10 ul Total100 ul3、 混合后置于适宜酶切温度进行酶切反应；4、 对酶切产物进行纯化，用30 ul TE 洗脱；5、 制备1%浓度的琼脂糖凝胶（不加EB ）；6、 将纯化后的酶切产物敞开盖子于70℃放置15 min ，以除尽残留乙醇和消除酶切后产生的粘性末端；7、电泳：1v/cm。
二、转膜1、碱变性：把胶条转移到含碱变性液的器皿中，摇床处理15 min；重复一次；2、中和：倒出器皿中的碱变性液，加入中和液，摇床处理15 min；重复一次；3、倒出中和液，加入20×SSC，摇床处理15 min；4、转膜：1）在一干净的容器中放入一包吸水纸，倒入20×SSC，浸湿；2）放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸，倒上一层20×SSC，防止产生气泡；3）将预先剪裁好的尼龙膜放入ddH2O中充分浸润2分钟；4）小心把胶条铺在滤纸上面，用玻璃棒擀平，赶走气泡；5）往胶上倒上一层20×SSC，将尼龙膜铺在胶条上，再向上倒上一层20×SSC；6）再放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸；7）用保鲜膜把胶条四周封上，在上面压上一包吸水纸，再用一个约250mg的物体压在吸水纸上面；8）转膜过夜；5、固定将膜放在用10×SSC浸湿的滤纸上面，使含DNA面朝上，放入紫外交联仪中，以1.5J，254n，2.5min的程序将DNA固定在尼龙膜上。
southern杂交
Southern流程示意 Southern流程示意
基因组DNA 基因组DNA
限制性酶切
DNA限制片段 DNA限制片段
琼脂糖凝胶电泳
转 膜
转移缓冲液
பைடு நூலகம்与标记探针杂交 检测
盖子 两层长滤纸 三层湿滤纸 凝胶 n+ 尼龙膜 三层湿滤纸 十层干滤纸 10cm吸水纸 10cm吸水纸
转膜
即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。而此过 程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。DNA是沿与凝胶 平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此，凝胶中的DNA片段虽 然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂，转移后各个DNA片段 在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，故而称为印 迹（blotting）。用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素 膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等，转膜时 可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。其中常用的是 NC膜和Nylon膜。各种膜的性能和使用情况比较见各种尼龙膜性 能及使用情况比较表。
与标记分子杂交
• （一）原理 • 转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的探针 转印后的滤膜在预杂交液中温育 ， DNA（探针 预先经加热变性成为单链DAN分子），即可进行杂 分子）， （探针DNA预先经加热变性成为单链 预先经加热变性成为单链 分子），即可进行杂 交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜， 交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。杂交过夜， 然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高， 然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高，杂交的 严格程度越高，也就是说， 严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源 性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。 性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。 • （二） 步骤 • 1.将标记的 将标记的DNA探针置沸水浴 探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min， ，迅速置冰上冷却 ， 将标记的 探针置沸水浴 变性。 使DNA变性。 变性 • 2.从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋，剪开一角，将变 从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋， 从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料袋 剪开一角， 性的DNA探针加到预杂交液中。 探针加到预杂交液中。 性的 探针加到预杂交液中 • 3.尽可能除取袋中的空气，封住袋口，滞留在袋中的气泡要尽可 尽可能除取袋中的空气， 尽可能除取袋中的空气 封住袋口， 能地少，为避免同位素污染水浴， 能地少，为避免同位素污染水浴，将封好的杂交袋再封入另一个未污 染的塑料袋内。 染的塑料袋内。 • 4.置42℃水浴温育过夜（至少 置 ℃水浴温育过夜（至少18h）。 ）。
Southern Blot原理及实验方法
Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。
Southern Blot原理及实验方法
Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA 转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。
southern 印迹法
实验七Southern印迹法[目的]１．熟悉Southern 印迹法的基本操作方法和主要步骤的工作原理。
２．了解Southern印迹的意义。
[原理]Southern印迹法(Southern Blot)是将基因组 DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上；经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链)，通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；•经过干燥或紫外线照射处理，单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢固地固定到转移膜上；转移后的单链DNA 分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交；经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。
这种方法最初是由Southern于1975年建立的。
方法中DNA转移的方式和复印的过程一样，比较准确地保持了特异DNA顺序在电泳图谱中的位置（也可将变性的凝胶负压干燥后与特定的DNA探针进行原位杂交）。
它把电泳分离和杂交结合起来，不但能检测出特异的DNA序列片段，而且能进行定位和测定分子量。
即先以电泳后照相记录的已知分子量的DNA片段(常用Hind Ⅲ或EcoRⅠ降解的λDNA)为标准，精确测量各标准片段与电泳原点之间的距离。
以DNA的Log10kb为纵坐标，移动距离(cm)为横坐标，连接各已知条带相应的点，得到一条标准曲线。
然后测量未知条带(放射自显影后获得的特异片段)的移动动距离，在标准曲线上找出相应的Log10kb值，以此计算出其分子量大小。
[器材与试剂]一、器材1．电热真空干燥箱2．硝酸纤维素滤膜或尼龙膜3．大方瓷盘、带盖方盘、玻璃板4．滤纸、吸水纸、保鲜膜、蜡膜（Parafilm）、一次性手套等5．刀片、刻度吸管、镊子、剪刀、lkg重物二、材料电泳分离DNA的琼脂糖凝胶三、试剂1．酸变性液:0.25mol/L HCl，用分析纯的盐酸（12Mol/L）稀释2．碱变性液：0.5mol/L NaOH， 1.5mol/l NaCl（pH13.1）3．中和液：0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl4．20×SSC: 0.3mol/Ｌ柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0(配方见附录)5．10×SSC和2×SSC：用双蒸馏水稀释20×SSC储存液[实验步骤]注意：操作戴手套！1．凝胶处理:1)凝胶照像后，切去包括标记带在内的多余部分，将凝胶的一角(•点第一个样品的一侧)切去作为标记，以便于定位。
southern blot原理
southern blot原理
Southern Blotting 原理
Southern blotting 技术是由 Edwin M. Southern 在 1976 以
一种简单而有效的方法提出的，用于支持DNA含量的分析。
它最常被用于鉴定由多种DNA碱基构成的特定序列，以及鉴定和检测特定DNA 序列的存在、比较、分析及其分布。
它通过将DNA模板分离出来，再将DNA模板用聚合酶链反应(PCR)扩增以获得足够多的DNA模板，最后将经过扩增的DNA模板遇到一种特殊的处理，以使它与一张特殊的膜片或者膜片上的特定序列结合。
Southern blotting 包括以下几个步骤：1). 将DNA样本用双链酶将双链DNA分割成小的片段；2). 将分离出来的小DNA片段用一种特殊的方法分子印迹(molecular blotting)到一张特殊的膜片上；3). 将特定的标记物(比如特定的核酸或抗体)与经过分子印迹的DNA片
段结合；4). 将结合物暴露在感光材料上，从而将其结果显示出来。
Southern blotting 技术可以用于检测DNA片段的量、品种、分布、多样性及数量。
这种技术具有准确性高、特异性好、操作简单、检测效率高的优势。
Southern blotting 技术可以用于：1). 鉴定特定的DNA序列；
2). 鉴定DNA片段的长度；3). 检测突变；4). 检测某种重组；5). 筛选特定基因序列；6). 检测融合基因；7). 研究基因组学；8). 检测特定的核酸，如RNA、miRNA、siRNA等。
- 1 -。
如何确定转基因拷贝数(Southern Blot法和荧光定量PCR方法)
如何确定转基因拷贝数（Southern Blot法和荧光定量PCR方法）发布: 2010-01-22来自: 易生物实验阅读数：5391次鉴定转基因植物的第一步就是要确定被转基因已经稳定的整合到了染色体上。
第二步任务就是评估有多少个转基因拷贝，以及每个转基因的表达水平如何。
一般经过上游表达载体的设计构建以及下游转化体系的建立、转化品系的筛选鉴定等一系列步骤后，即获得T 0 代转基因植物。
在转化过程中，外源DNA 随机插入植物内，插入的拷贝数和位点都不固定。
插入外源基因的拷贝数低（1或2个）能较好的表达，插入的拷贝数多则会导致表达的不稳定甚至基因沉默现象。
因此，检测T0代植物的外源基因的拷贝数是研究其分子特性的基础步骤之一。
1、Southern Blot法Southern Blot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。
其原理是将待测的DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA 的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。
Southern法准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。
另外，由于Southern法检测不经过靶片段的扩增（PCR），一般每个电泳通道需要10-30 μg的DNA ，在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA ，而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。
如果外源基因在插入时发生基因重组，造成限制性酶切位点丢失，Southern 法也无法检测到。
这些因素都制约了Southern法在T0代植物中检测外源基因拷贝数的应用。
2、荧光定量PCR方法利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR方法可以用于测定原始品系中转基因的绝对拷贝数。
实时荧光定量PCR技术是一种较新的DNA 定量方法。
其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如：SYBR GREEN I）或特异性的荧光探针（如：Taqman 探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数：CT值（Cycle Threshold）；通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。
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southern blot
基本原理
• Southern杂交是利用标记的探针（probe） 与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶 DNA片段中是否存在与探针同源的序列
• 杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用 的探针(序列已知)进行特异性的靶序列检 测
用途
• 检测样品中的DNA 及其含量 • 了解基因的状态 （是否有点突变、 扩增重排等）
• 将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用 移液管的滚动，赶走气泡
实验步骤
• 切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上， 赶走滤纸与胶之间的气泡
实验步骤
• 再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上，同 样不能有气泡，然后放上三张浸湿的滤纸， 赶走气泡
实验步骤
• 紧贴凝胶四周各放一张X光片
实验步骤
• 小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜 要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动
• • • • • • •
一、基因组DNA的制备 二、基因组DNA的限制酶切 三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳 四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物 五、探针标记 六、杂交 七、洗膜与检测
试剂与器材
• 一、试剂 • 限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 转移液20╳SSC（3M NaCl，0.3M柠檬酸 钠，PH7.0），标记探针， 2╳SSC，预杂交液和 杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗 液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液（0.1M马来 酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）
影响杂交的因素
4）杂交液的离子强度
低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率 增加(Na+的作用) 高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序 列不完全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液 中较高的盐浓度;
5）非特异性杂交反应：预杂交的作用
杂交前封闭膜上非特异性杂交位点,减少其对探针 的非特异吸附
1）待检核酸分子的浓度和长度
浓度越大,复性速度越快,敏感性↑; 分子越大,转膜越困难,敏感性↓; 转膜方法
2）探针的性质(标记效率、浓度，核酸性质)
对于单链探针,浓度越高,杂交率增加; 探针标记方法和检测方法的选择
3）杂交液体积、温度和杂交时间
体积越小,杂交动力学越高; DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20～25℃; 温度↓非特异性↑; 温度↑敏感性↓
• 当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。 上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。
实验步骤
八.检测
• 将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温 育0.5-16小时。 • 当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变 深前, 用Tris-EDTA洗去底物液，干燥保存。
影响杂交因素
1d
1d
杂交（靶DNA单链与DIG标记的c-myc探针之间以碱基互补的原 则进行杂交）
洗膜（洗去未与靶DNA结合的探针）
检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色）
1d
实验步骤
一. 基因组DNA的限制性内切酶酶切
（1）HL60基因组DNA10μg 10×Buffer TANGO+ EcoR I（10 u / μl） 16 μl 2 μl 2 μl
实验步骤
• 用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断 保鲜膜，但不能割破滤纸。取走滤纸上的保 鲜膜
实验步骤
• 整齐地放上草纸，数张草纸一折二，草纸堆 要高出搪瓷盘边约10cm
实验步骤
• 在草纸上放上玻璃板, 压上约500g重的重物, 转移过夜
实验步骤
五.固定 • 将胶和尼龙膜一起翻过来,用铅笔深入加样 槽在尼龙膜上画上槽的位置 • 正面朝上放在紫外交联仪中，交联固定 • ddH2O稍加漂洗后空气中自然干燥
实验步骤
六.杂交 • 将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液,，取 经超声粉碎的鲑鱼精DNA（已溶解在水或TE 中）100℃加热变性5min，迅速加到杂交瓶 中，使其浓度达到100μ g/ml。60℃封闭6小 时。 • 倒出预杂交液,加杂交液,同样加入变性的鲑 鱼精DNA，将探针100℃加热5min，使其变性， 迅速加到杂交瓶中60℃杂交过夜。
影响杂交的因素
6）杂交后的漂洗：盐浓度、温度、次数， 体积
漂洗从低严谨度→高严谨度
7）固相膜的选择
阳离子尼龙膜
预期结果
预期结果
The end,thank you!
实验步骤
七.洗膜
• 回收杂交液 (可重复使用), 将膜放在洗膜溶液I中, 室温洗3次,每次摇动5分钟。 • 再在洗膜溶液II中(60℃预热后直接倒进表面皿), 洗2次, 每次摇动15分钟。 • 将膜在缓冲液1中漂洗3分钟。 • 在缓冲液2中室温摇动封闭30分钟。 • 在抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟。 • 用洗膜溶液III洗2次, 每次15分钟。 • 在缓冲液3中平衡3分钟。
实验流程图
基因重组 重组质粒提 与转化 取与鉴定 质粒大 量制备 探针 制备
Southern blot
细胞 培养
基因组 DNA制备 PCR
DNA浓度 测定
酶切
探针的制备
变性 随机引物
DNA聚合酶 I Klenow 片段 32P-dCTP (Dig-dUTP)， dNTPs
随机引物延伸法标记探针
基因组DNA Southern杂交
5.酶切样品（1） 组 6.酶切样品（2） 二 7.基因组DNA10 mg
实验步骤
三.变性
• 将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢摇 动20分钟。 • ddH2O洗2次。 • 在胶中和液中慢慢摇动15分钟。
实验步骤
四.转移 • 在搪瓷盘中加入300ml10×SSC，放上培养皿 和小玻璃板
实验步骤
• 二、器材 • 22cm×15cm瓷盘，尼龙膜或硝酸纤维素膜，滤纸， 吸水纸，紫外交联仪，摇床，X线胶片等
Southern blot 过程
基因组DNA经酶切成小片段（EcoR I或 Hind III） 电泳分开各片段（1％琼脂糖凝胶电泳） 变性（双链经碱变性解开成两条单链） 转膜及固定（DNA经毛细管作用转移到尼龙膜上，紫外交联固 定） 预杂交（减少标记探针的非特异性结合，小分子鲑精DNA为竞 争性封闭剂）
总体积
（2）HL60基因组DNA10μg 10×Buffer R 。 Hind III（10 u / μl） 总体积
37℃保温1.5h
20 μl
16 μl 2 μl 2 μl 20 μl
实验步骤
二. 1％琼脂糖电泳
两组共用一块凝胶，共7个样品 1.基因组DNA10 mg 组 2.酶切样品（1） 一 3.酶切样品（2） 4.阳性对照（pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切 后的8.5 kb线性片段，10pg/ml, 10ml)