Southern blot实验方法和操作步骤
SOUTHERNBLOTTING实验操作流程
SOUTHERN BLOTTING实验操作流程A.小麦基因组DNA的提取1)采集5g鲜嫩的小麦幼苗，将其剪成2cm左右的片段，用液氮冷冻后在研钵中将其研成粉末（研磨15min左右）。
2)将研磨好的样品转移到预冷的50ml离心管中，加入20ml预热的S buffer，颠倒混匀。
S Buffer成分100mM Tris.Cl pH8.5100mM NaCl50mM EDTA pH8.02％SDS3)于65℃水浴锅中温育1-2h，并不时轻柔混匀。
4)加入20ml（等体积的）酚/氯仿，轻柔地颠倒混匀，直至呈乳状（注意：保证混匀。
为有效除去蛋白，此步可以重复）。
5)用水平转子离心机以2000rpm的转速离心20-30min。
6)加入等体积的氯仿，轻柔地颠倒混匀，2000rpm离心20min。
7)转移上清到1个灭菌的50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置一段时间，用玻璃勾将DNA钩出。
8)用70％的乙醇清洗DNA 2-3次后，将其挑在玻璃钩上晾干，然后溶解在5ml 1×TE中。
9)待DNA完全溶解后接入10μl RNase，于37℃恒温箱中温育1h。
10)加入等体积的酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，以2000rpm的转速离心15min。
11)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，以2000rpm的转速离心15min。
12)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入1/10 体积3M pH 5.0的乙酸钠（终浓度为0.3M），混匀后再加入2倍体积95％的乙醇，混匀。
13)用玻璃勾将DNA钩出，然后用70％的乙醇清洗2-3次，晾干后加入1.8-2ml 1×TE溶解。
14)待DNA完全溶解后，取1μL DNA电泳，检测DNA的浓度和完整性。
15)DNA样品可以放在4℃保存备用。
B.小麦基因组DNA的酶切1）通常情况下采用下列酶进行谷类作物DNA分析。
识别6碱基序列的酶识别4碱基序列的酶Apa I Hind III Bam HI Alu I Mbo I Hha ISal I Bgl I Sst I Dde I Msp I Taq IDra I Pvu II Eco RV Hae III Rsa I Hinf IEco RI Xba I2）如果一次酶切DNA的量在10μg左右，一般采用30μL反应体系。
Southern Blot操作流程
Southern Blot 操作流程1、哺乳动物基因组DNA 的提取（或用OMEGA 试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit ） 1、 取约30mg 样品，加入600 ul SNET ，再加入12 ul （20.2mg/ml ）的蛋白酶K ，使蛋白酶K 的终浓度为400ug/ml ； 2、 55℃振荡过夜；3、 加入0.6 ul RNaseA ，室温下孵育10 min ，后置于65℃ 10 min ；4、 加入300 ul Tris 饱和酚，288 ul 氯仿和12 ul 异戊醇，室温下振荡30 min ；5、 17,000 g 离心5min ，转移上层水相（600 ul ）至一新的离心管；6、 加入等体积（600 ul ）的异丙醇沉淀DNA ，于4℃下13,250 g 离心15 min ；7、 小心除去异丙醇，加入1 ml 70%的乙醇。
离心5 min 后除去乙醇，室温下干燥15~20 min ；8、 加入100 ul TE ，使核酸沉淀溶解。
一、 酶切1、 拷贝数的计算哺乳动物基因组全长3.0×109个碱基对，按插入基因单拷贝计算如下：()gplasmidof mass bpbp DNA of Insertionμ10100.39=⨯2、 酶切体系基因组DNA 10 ug 10*Buffer 10 ul 酶(10U/ul) 10 ul Total100 ul3、 混合后置于适宜酶切温度进行酶切反应；4、 对酶切产物进行纯化，用30 ul TE 洗脱；5、 制备1%浓度的琼脂糖凝胶（不加EB ）；6、 将纯化后的酶切产物敞开盖子于70℃放置15 min ，以除尽残留乙醇和消除酶切后产生的粘性末端；7、电泳：1v/cm。
二、转膜1、碱变性：把胶条转移到含碱变性液的器皿中，摇床处理15 min；重复一次；2、中和：倒出器皿中的碱变性液，加入中和液，摇床处理15 min；重复一次；3、倒出中和液，加入20×SSC，摇床处理15 min；4、转膜：1）在一干净的容器中放入一包吸水纸，倒入20×SSC，浸湿；2）放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸，倒上一层20×SSC，防止产生气泡；3）将预先剪裁好的尼龙膜放入ddH2O中充分浸润2分钟；4）小心把胶条铺在滤纸上面，用玻璃棒擀平，赶走气泡；5）往胶上倒上一层20×SSC，将尼龙膜铺在胶条上，再向上倒上一层20×SSC；6）再放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸；7）用保鲜膜把胶条四周封上，在上面压上一包吸水纸，再用一个约250mg的物体压在吸水纸上面；8）转膜过夜；5、固定将膜放在用10×SSC浸湿的滤纸上面，使含DNA面朝上，放入紫外交联仪中，以1.5J，254n，2.5min的程序将DNA固定在尼龙膜上。
Southernblot(自总结2)
Southern blot （J 版）1. 提取植物总DNA (CTAB法)试剂：1) 2×CTAB提取缓冲液（低于15℃会析出，加入材料前先65℃预热）0.1 mol/L Tris-Cl (pH 8.0)1.4 mol/L NaCl20 mmol/L EDTA (pH 8.0)20 g/L CTAB （2%）20g/L PVP-40（2%）使用前加入2% (体积比) 的巯基乙醇。
步骤：1)提取前将植物材料在暗处放置24小时，以降低材料的淀粉含量。
2)剪取大约1g 叶片，置于研钵中，倒入液氮研成粉末（一定研磨细致，非常重要），分装入2ml离心管中（样品约占0.5ml的体积），每管加入900ul CTAB提取缓冲液，温和彻底的混匀，静置，使裂解彻底。
3)65℃水浴保温1-1.5小时。
4)冷至室温后加900ul 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分温和混匀直到叶片粉末由绿转白（水相，酚相混匀成乳状液）。
5)室温下13,000 rpm离心10 min，吸取上层水相。
6)取上清（约900ul）再用等体积的氯仿：异戊醇 (24：1)再抽提一次。
13,000 rpm离心10min。
7)取上层水相（约700ul），加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA。
小心倒出每管中液体，将絮状DNA沉淀收集到一个新的 1.5ml EP管中（同一个样品）。
8)用70%乙醇洗涤沉淀3-5次，每次将沉淀适当浸泡以充分洗涤，最后一次稍加离心，将洗涤液尽量去除干净，通风橱中晾干约10min左右（不要过分干燥）。
9)加200ul灭菌的去离子水（或者TE），并加入2ul Rnase A（10mg/ml），37℃保温30-60min溶解沉淀，充分混匀，并消化RNA。
（可直接到第11步）10)（可省步骤）如需做此步骤，则上步中需用700ul ddH2O溶解沉淀，37℃保温消化RNA后再用等体积氯仿：异戊醇 (24：1)抽提，并离心，取上清。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。
在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。
下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。
步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。
DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。
可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。
2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。
细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。
3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。
4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。
步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。
根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。
2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。
3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。
启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。
4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。
步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。
Southern Blot原理及实验方法
Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。
southern 印迹法
实验七Southern印迹法[目的]１．熟悉Southern 印迹法的基本操作方法和主要步骤的工作原理。
２．了解Southern印迹的意义。
[原理]Southern印迹法(Southern Blot)是将基因组 DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上；经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链)，通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；•经过干燥或紫外线照射处理，单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢固地固定到转移膜上；转移后的单链DNA 分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交；经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。
这种方法最初是由Southern于1975年建立的。
方法中DNA转移的方式和复印的过程一样，比较准确地保持了特异DNA顺序在电泳图谱中的位置（也可将变性的凝胶负压干燥后与特定的DNA探针进行原位杂交）。
它把电泳分离和杂交结合起来，不但能检测出特异的DNA序列片段，而且能进行定位和测定分子量。
即先以电泳后照相记录的已知分子量的DNA片段(常用Hind Ⅲ或EcoRⅠ降解的λDNA)为标准，精确测量各标准片段与电泳原点之间的距离。
以DNA的Log10kb为纵坐标，移动距离(cm)为横坐标，连接各已知条带相应的点，得到一条标准曲线。
然后测量未知条带(放射自显影后获得的特异片段)的移动动距离，在标准曲线上找出相应的Log10kb值，以此计算出其分子量大小。
[器材与试剂]一、器材1．电热真空干燥箱2．硝酸纤维素滤膜或尼龙膜3．大方瓷盘、带盖方盘、玻璃板4．滤纸、吸水纸、保鲜膜、蜡膜（Parafilm）、一次性手套等5．刀片、刻度吸管、镊子、剪刀、lkg重物二、材料电泳分离DNA的琼脂糖凝胶三、试剂1．酸变性液:0.25mol/L HCl，用分析纯的盐酸（12Mol/L）稀释2．碱变性液：0.5mol/L NaOH， 1.5mol/l NaCl（pH13.1）3．中和液：0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl4．20×SSC: 0.3mol/Ｌ柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0(配方见附录)5．10×SSC和2×SSC：用双蒸馏水稀释20×SSC储存液[实验步骤]注意：操作戴手套！1．凝胶处理:1)凝胶照像后，切去包括标记带在内的多余部分，将凝胶的一角(•点第一个样品的一侧)切去作为标记，以便于定位。
Southern Blot原理及实验方法
Southern Blot原理及实验方法Southern Blot是分子生物学中一种常见的实验技术，用于检测DNA样品中特定DNA 序列的存在和数量。
它被广泛应用于基因克隆、基因组分析、基因诊断、DNA指纹鉴定和DNA进化研究等方面。
Southern Blot的基本原理是将DNA样品经过限制酶切后，在电泳中分离出目标DNA 片段。
然后将这些片段转移到固体媒介（通常是尼龙膜或硝酸纤维素纸）上，并固定在媒介上。
接下来，将一段标记有特定序列的探针加入到膜上，在一定条件下进行杂交反应。
探针与目标DNA片段互补结合，形成杂交带，从而检测出特定的DNA序列的存在。
1. DNA提取与限制酶切首先需要从目标样品中提取所需的DNA，并通过限制酶切，将DNA切割成特定长度的片段。
限制酶的选择应根据所需检测的DNA序列而定。
2. DNA电泳分离将限制酶切割后的DNA通过电泳进行分离，使用凝胶电泳对目标DNA进行分离，通常使用琼脂糖凝胶或封孔凝胶。
3. DNA转移将DNA片段转移到固体媒介（通常是尼龙膜或硝酸纤维素纸）上，将凝胶与固体媒介层间贴合，通过电流使DNA穿过凝胶，转移到固体媒介上。
4. 探针与杂交使用特定序列的探针，对膜上的目标DNA进行杂交。
探针需要标记上含有辨识探针的标记物，如放射性同位素或酶。
在一定条件下进行杂交反应，探针需要与目标DNA序列互补，形成稳定的结合。
5. 洗脱将未结合的杂交缓冲液和杂交条件下无法结合的DNA片段洗脱，保留与探针杂交的特定DNA带。
6. 分析结果可通过显色、荧光标记等方式对膜上的目标DNA进行检测。
检测结果通常以浓度及分子量的方式呈现。
southern blot的中文操作步骤
一. 地高锌-DNA 标记1. 用51-4全长质粒做模板,用BspQ I 和Sca I双酶切,NEBBuffer：10 μLBspQ I： 3 μLSca I ： 2 μL质粒：60ul水：25μL100μL体系先放于37℃的培养箱10小时,然后于50℃水浴, BspQ I作用的温度为50℃, Sca I作用温度为37℃.2.胶回收全长片段(3.2kb)1．100μL酶切产物加loading buffer全上样，电泳后回收3000bp左右的片段。
2．称重加入3倍体积的QG（1g/3mL），50℃水浴10min融胶,其间颠倒2-3次。
3．将液体转移至柱子，13000rpm/min 1min，弃滤液。
4．加入500μLQG，13000rpm/min 1min，弃滤液。
(去除痕量的融胶)5．加入750μL PE，静置5min，13000rpm/min 1-2min.6．13000rpm/min空离2min7．置一新EP管上，加入40μL ddH2O，静置10min，13000rpm/min 1min，收集滤液备用。
用2ul测OD值.(51-4含量:0.28ug /ul)3. 探针反应用H2O 或Tris buffer溶解模板(胶回收的51-4),不能用TE,因为EDTA会抑制探针反应.步骤:1.取4ul 51-4胶回收产物,加双蒸水至16 ul.2. 100℃沸水中放置10min变性,冰上骤冷.3. 混匀DIG-High prime,取4ul DIG-High prime加到上述变性DNA溶液中,混匀,短暂离心,37℃孵化20小时4. 65℃水浴10min二.标记效率的检测1.倍比稀释探针探针反应后的探针量为23000ng .1000ng 模板→20h →probe 2300ng/20ul≈100ng/ul①第一次稀释：10ul probe①加入90ul DNA dilution buffer(10ng/ul)②第二次稀释：5ul ②加入45ul dilution buffer (1ng/ul)③第三次稀释：(2) Control DNA (5ng/ul)的倍比稀释吸取5 ul Control DNA (5ng/ul)加入20 ul的DNA dilution buffer(1 ng/ul)2.点膜(1)取1 ul Control DNA D2-D8点于尼龙膜上,与其相平行的一排点上地高辛标记的DNA D2-D8,最后各点一个dilution buffer.如下图所示.O O O O O O O O ControlO O O O O O O O DigD2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 dilution buffer将尼龙膜放于滤纸上,在其上再放一张等大的滤纸,于80℃烤箱烘烤2 hour.拿出于室温放置.(2)将膜转移到含有20ml washing buffer的封口袋中,室温振摇2min,弃尽washingbuffer(3)加10 ml 1XBlocking solution振摇孵育30 min, 弃尽Blocking solution(4)加10 ml 稀释了104倍的antibody solution振摇孵育30 min,弃antibody solution(5)加10 ml 1Xwashing buffer 洗膜两次,2X15 min,弃washing buffer(6)加10 ml 1Xdetection buffer振摇平衡2-5 min(7)将膜取出放入有双层薄膜的一层薄膜上,加约4滴的CSPD ready-to-use 横跨尼龙膜表面,将袋子的第二层膜盖在含探针DNA的一层薄膜上,尽量不能有气泡.(8)室温孵育5 min(吸尽过量的液体,将薄膜四边封口)(9)37℃孵育10 min(10)进入暗室,压膜一定时间,把压好的片子先放于以1:9稀释好的100 ml的显影液中显影5 min左右,拿出来放入定影液中定影5 min左右,用水冲洗干净,白光下照相.3.探针结果分析A.D6的荧光强度为理想的标记DNA,如:DNA样品按上述方法稀释的,实际上含有20ng/ul标记探针.B.D5 出现荧光,是足量的标记DNA,如: DNA样品按上述方法稀释的,实际上约含有7 ng/ul标记探针C.D4出现荧光,标记DNA不够(确定DNA探针量后再进行下一步)D.计算出探针浓度后看需要多少的探针溶液来杂交,如:D6做探针时,每ml杂交buffer用1.25ul的20ng/ul DNA探针溶液在Southern blot检测DNA,D5做探针时,每ml杂交buffer用3.75ul的7 ng/ul DNA探针溶液(25 ngDNA 探针) 在Southernblot检测DNA,D4不能当探针,重做一个.三. 探针杂交southern blot DNA探针的杂交流程在琼脂糖上分离DNA样品条带(30min-2h)↓转移DNA到尼龙膜上(southern blot)A.脱嘌呤和变性DNA(1h)B.用毛细管转移DNA到尼龙膜上(过夜)C.烘烤固定DNA(30 min-2h)↓用DIG-Easy Hyh进行预杂交(30 min)↓DIG-labeled DNA与DNA进行杂交A.孵育标记了DNA探针的尼龙膜(4-16h)B.洗膜,将未杂交的探针洗掉(45 min)1.DNA的电泳分离(1)用TBE配置一块琼脂糖凝胶,胶越薄越好.(注:为了得到理想结果,在胶里不能放EB染色或跑过的buffer,(Ethidium)乙啡啶,假如电泳条带跑的不够长可能会引起背景不均匀的问题. (2)点上少量目的DNA,一般地,目的DNA的浓度要低,如:每个泳道点2.5-5ug人类基因组DNA 或假如基因组比人类DNA还复杂的,每个泳道就跑10ug以上或每个泳道跑<1ng的质粒DNA (3)点上分子量的Marker,相应的每泳道点上5ul的DIG-labeled DNA Marker.(注:需要量依赖于杂交产量,确保点的Marker量足够显示出样品同样位置的条带.(4)跑胶直到DNA分离的很好,用30-50V电压跑胶大约5h左右.(5)为了评价目的DNA 的质量,以0.25-0.5ug/ml EB染色,在紫外灯下成像.(15-30 min)2.把DNA转移到尼龙膜上1).凝胶里变性DNA:用变性溶液(0.5M NaOH,1.5M NaCI)浸没凝胶2X15 min,室温温和振摇,之间用无菌双蒸水冲洗凝胶.2).中和:用中和液(0.5M Tris-HCI,PH 7.5;1.5M NaCI )室温浸没凝胶振摇2X15 min ，之间用无菌双蒸水冲洗凝胶3).用20XSSC平衡凝胶,振摇至少10 min4).按照下述进行blot,避免产生气泡:●放一张已经沾有20XSSC溶液的Whatman 3 MM纸于桥上,然后往槽里放20XSSC●把凝胶放在浸湿了的Whatman 3 MM纸上,用无菌吸管在凝胶与纸之间吸走所有气泡●剪一块与凝胶大小的尼龙膜●放这张膜于含有DNA的凝胶上,按上述方法用移液器消除气泡●然后再加上一层Whatman 3 MM纸,一叠纸巾,一快玻璃板和一个重200-500g的重物,完成印记转移的三明治模式.5).印记过夜在20XSSC溶液里转移，如图示(5cm)封口膜或X片20×SSC6).当印记还湿润时,用下面方法固定DNA到印记上●用2XSSC(不含SDS)简单冲洗膜●在80℃烘考此膜1h.7).膜可继续下面实验或者保存干燥印记(用两张Whatman 3 MM纸包裹密封)4℃保存.3.用DIG easy Hyb进行印记杂交1．杂交●注意：在任何时候都不要让膜干燥。
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Southern Blot原理及实验方法Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.5)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1―2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。
先把它放在去离子水中润湿后，再放在20倍SSC溶液中润湿5分钟，然后放在凝胶表面，两层之间不可有气泡。
7. 然后再把两张与滤膜一样大小的二号滤纸，在2倍SSC溶液中浸湿，覆盖在硝酸纤维膜上，同样要把气泡赶走。
8. 把一叠吸水纸（或卫生纸，约有5―8cm高，略小于滤纸），放置在滤纸上，在吸水纸上再放一块玻璃板和重约500g的重物，放置过夜。
9.转移结束后，移去上面的吸水纸和滤纸，同时翻转取出凝胶与硝酸纤维膜，把凝胶的点样与硝酸纤维膜的相对应位置用铅笔或解剖针的针尖做好标记。
11. 把已转移了DNA的硝酸纤维膜放在6倍SSC溶液中振荡浸泡5分钟，然后放在滤纸上吸干溶液。
再把它夹在两层滤纸之间，80℃真空干燥2小时。
注意事项（1）将凝胶中和至中性时，要测pH, 防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
(2) 要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜之间的气泡。
Southern 杂交简介：Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。
通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。
该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。
但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交。
但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。
一、基因组DNA的制备二、基因组DNA的限制酶切根据实验目的决定酶切DNA的量。
一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。
购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。
为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。
消化的DNA浓度不宜太高,滤纸，以0.5μg /μl 为好。
由于内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。
具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入DNA（1μg /μl） 20 μg10×酶切buffer 4.0 μl限制性内切酶（10U/μl） 5.0 μl加ddH2O 至 50 μl在最适温度下消化1-3hr。
消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。
如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。
或者放大反应体积，或者补充酶再消化。
如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降。
消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA，以终止消化。
然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提，2.5倍体积乙醇沉淀，少量TE溶解（参见DNA提取方法，但离心转速要提高到12000g，以防止小片段DNA的丢失）。
如果需要两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度，再加第二种酶进行消化。
三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法，制备简单，分离范围广（200bp-50kb），实验成本低。
下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围。
表：不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围琼脂糖凝胶浓度（%）分离DNA片段范围（kb）0.3 5-600.6 1-200.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-21. 制备0.8%凝胶：一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。
2. 电泳：电泳样品中加入6×Loading 缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加DNA Marker。
1-2V/cm，DNA从负极泳向正极。
电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止电泳。
取出凝胶，紫外灯下观察电泳效果。
在胶的一边放置一把刻度尺，拍摄照片。
正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带，照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置，以确定被杂交的DNA长度。
四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物转移就是将琼脂糖凝胶中的DNA 转移到硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜上，形成固相DNA。
转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交。
常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法。
这里介绍经典的盐桥法（又称为毛细管法）。
（一）试剂准备１．变性液：0.5M NaOH；1.5 M NaCl。
２．中和液：0.5M Tris-HCl(pH 7.4)；1.5M NaCl;３．转移液（20×SSC）： NaCl 175.3g; 柠檬酸三钠82.2g，NaOH 调pH 至7.0，加ddH2O 至1000ml。
（二）操作步骤1.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。
2.中和:将凝胶转移到中和液15min。
3．转移按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中5min。
剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。
按下图所示进行转移。
（转移过程一般需要8-24hr，每隔数hr换掉已经湿掉的纸巾。
转移液用20×SSC。
注意在膜与胶之间不能有气泡。
整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。
）4. 转移结束后取出NC膜，浸入6×S SC溶液数min，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80°C烘2hr，然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。
五、探针标记进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。
放射性标记灵敏度高,棉纱，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。
这里介绍放射性标记。
探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，有一些试剂盒可供选择，操作也很简单。
以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：1．取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中，100℃变性5min，立即置冰浴。
2．在另一个0.5ml离心管中加入：Labeling 5×buffer 10μl（含有随机引物）dNTPmix 2μl(含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM)BSA（小牛血清白蛋白） 2μl[a-32P]dATP 3μlKlenow酶 5U3．将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl，混匀。
室温或37℃ 1hr。
4．加50μl 终止缓冲液终止反应。
标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。
由于a-32P的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。
探针的比活性最好大于109计数/分/μl。
六、杂交Southern 杂交一般采取的是液-固杂交方式，即探针为液相，被杂交DNA为固相。
杂交发生于一定条件的溶液（杂交液）中并需要一定的温度，可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的在膜上流动。
杂交液可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。
下面给出的为一杂交液配方：PEG 6000 10%；SDS 0.5%；6×SSC；50%甲酰胺。
该杂交液的杂交温度为42℃。
1．预杂交NC膜浸入2×SSC中5min，在杂交瓶中加入杂交液（8cm×8 cm的膜加5ml即可），将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。
放入42℃杂交炉中，使杂交体系升到42℃。
取经超声粉碎的鲑鱼精DNA（已溶解在水或TE中）100℃加热变性5min，迅速加到杂交瓶中，使其浓度达到100μg/ml。
继续杂交4hr。
鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。
2．杂交倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42℃的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精DNA。
将探针100℃加热5min，使其变性，迅速加到杂交瓶中。
42℃杂交过夜。
七、洗膜与检测取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜：2×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；1×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；0.5×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；0.2×SSC/0.1% SDS，56℃，10min；0.1×SSC/0.1% SDS，56℃，10min。
在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。
实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。