氨基酸移换反应
生物化学实验-氨基移换反应及其产物的鉴定
实验七 氨基移换反应及其产物的鉴定
丁鸣
一.实验目的和要求
1.学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理；
2.学习纸层析的原理和操作技术。
二.实验基本原理
1.氨基移换反应： 在氨基移换酶（转氨酶)的催化下，氨基酸的α-氨基和α-酮酸的α-酮基之间发
生的互换反应。 转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催
⑻ 显色剂（0.1%茚三酮-乙醇溶液）。
四.实验器材与仪器
⑴ 研钵或匀浆器:1套/每组（2人）；
⑵ 试管及试管架:1套/每组（2人）；
⑶ 恒温水浴箱（37℃、100℃）；
⑷ 铅笔、尺和圆规（学生自备）；
⑸ 毛细管（直径0.5mmபைடு நூலகம்；
⑹ 新华定性滤纸（直径11cm）；
⑺ 剪刀和镊子:各1把/每组（2人）；
取4支洁净、干燥的试管，按表1操作表1
管号 作 转氨酶提取液 0.25%碘乙酸
预温
试剂、操
（ml） （ml）
0. 1mol/L α－丙氨酸 pH8.0（ml） 0. 1mol/L α－酮戊二酸 pH8.0（ml） 0.01mol/L 磷酸缓冲液 pH8.0 （ml） 酶促反应 终止酶反应
1
2
3
4
1
1
2cm
5.5cm
1cm
3cm
用铅笔作出点样位置
用铅笔尖在圆心处截一小孔
“灯芯”制作
⑵ 点样：用毛细管依次点标准α-丙氨酸(Ala)、 谷氨酸(Glu)各点2次，其 余1－4号管样液各点2～3次。点样时，要待前次点样干燥（可用电吹风 吹干）后方可再次点样，点样直径不超过0.3cm。
1
2
3
6
实验十一(二)：氨基移换反应(纸层析)
实验十一：肝脏组织中转氨酶活性的测定（二）：纸层析分析一、实验目的1.学习用纸层析法测定转氨基作用，检验上次实验的结果。
二、实验原理(略)三、实验试剂：1、1%谷氨酸2、1%丙氨酸3、1号试管提取物4、2号试管提取物5、层析液四、实验步骤：1、点样：取一圆形滤纸，在滤纸中心位置剪一小孔（直径1-2mm）,以圆心为中心画直径为1cm的圆作为点样的底线；在圆周上等距离点4个点，标注为1、2、3、4；分别用4支牙签（或枪头）在4个点上点样，样品依次为：标准谷氨酸溶液、标准丙氨酸溶液、样品1、样品2；用吹风机吹干后，可重复点样2-3次，如果第一次点样足够多，一次就可，每个样点的大小最好不超过3mm，四个点大小尽量一致。
2、做滤纸筒状刷：吸附层析液。
3、扩展剂：取小培养皿1个，加入苯酚-水扩展剂（高度0.5cm左右）；将小培养皿置于一个大培养皿中。
4、层析：将滤纸筒状刷直立于装有层析液的小培养皿中，并将筒状刷的上头插入滤纸中心的小孔内（不要高出滤纸表面，高出部分剪去），滤纸通过此筒状刷与层析液相连。
将滤纸平放在含有饱和酚溶液的培养皿上，并用上下一样大小的培养皿盖在滤纸上，酚溶液由滤纸小孔向四周扩展。
当酚溶液扩展到距离纸边沿1.5cm时，取出滤纸。
用铅笔画下酚溶液扩展的边沿，吹干。
5、显色：喷水合茚三酮溶液，加热显色。
标出各显色点，计算各点的Rf值。
五.结果分析：(1)用铅笔将层析色谱轮廓和显色点的中心点描出来；(2)测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的 Rf 值。
(3)分析谷氨酸和丙酮酸之间是否进行了转氨基作用，并写出相关的反应式。
生物化学实验 转氨酶的提取氨基移换反应与纸上层析
生物化学实验转氨酶的提取氨基移换反应与纸上层析生物化学实验--转氨酶的提取、氨基移换反应与纸上层析实验三转氨酶的提取、氨基移换反应与纸上层析一、实验目的1、1.学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及其原理。
2.学习用纸层析法测定转氨基作用。
3、介绍氨基移换促进作用在中间新陈代谢中的意义。
二、实验原理、氨基移换酶也称转氨酶，它能催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的α-酮基互换，形成新的α-氨基酸与新的α-酮酸的作用.这种作用称为氨基移换作用。
它在生物体内蛋白质的合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质三类物质代谢的相互联系、相互转化上都起着很重要的作用。
任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。
它们的最适ph接近7.4。
在各种转氨酶中，以谷氨酸草酰乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶、got)及谷氨酸丙酮酸转氨酶(简称谷丙转氨酶、gpt)活力最强。
上述两种酶均广为存有于生物机体中，在正常人血清中也存有少量存有。
机体出现肝炎、心肌梗塞炎症时，血清联运氮酶活力明显减少，在临床上转氨酶活性的测量存有关键意义。
测量转氨酶活性的方法很多，例如分光光度法，纸上层析法及光电比色法等。
在氨基酸分解代谢中，联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。
此过程可用下式表示:植物中多种氨基酸是通过转氨基作用合成的。
纸层析：就是以滤纸做为支持物的分配层析法，就是20世纪40年代发展出来的一种生化拆分技术。
由于设备直观，操作方式便利，所须要样品量太少，分辨力较低等优点而广为的用作物质的拆分，并可以展开定性和定量的分析。
缺点就是进行时间较长。
分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。
在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。
溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率rf值）就不同，从而达到分离的目的。
氨基的化学性质和反应
1.氨基的反应（1）酰化氨基可与酰化试剂，如酰氯或酸酐在碱性溶液中反应，生成酰胺。
该反应在多肽合成中可用于保护氨基。
（2）与亚硝酸作用氨基酸在室温下与亚硝酸反应，脱氨，生成羟基羧酸和氮气。
因为伯胺都有这个反应，所以赖氨酸的侧链氨基也能反应，但速度较慢。
常用于蛋白质的化学修饰、水解程度测定及氨基酸的定量。
（3）与醛反应氨基酸的α-氨基能与醛类物质反应，生成西佛碱-C=N-。
西佛碱是氨基酸作为底物的某些酶促反应的中间物。
赖氨酸的侧链氨基也能反应。
氨基还可以与甲醛反应，生成羟甲基化合物。
由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在，所以不能用酸碱滴定测定含量。
与甲醛反应后，氨基酸不再是偶极离子，其滴定终点可用一般的酸碱指示剂指示，因而可以滴定，这叫甲醛滴定法，可用于测定氨基酸。
（4）与异硫氰酸苯酯(PITC)反应α-氨基与PITC在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-AA），后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-AA）。
这些衍生物是无色的，可用层析法加以分离鉴定。
这个反应首先为Edman用来鉴定蛋白质的N-末端氨基酸，在蛋白质的氨基酸顺序分析方面占有重要地位。
（5）磺酰化氨基酸与5-(二甲胺基)萘-1-磺酰氯(DNS-Cl)反应，生成DNS-氨基酸。
产物在酸性条件下(6NHCl)100℃也不破坏，因此可用于氨基酸末端分析。
DNS-氨基酸有强荧光，激发波长在360nm左右，比较灵敏，可用于微量分析。
（6）与DNFB反应氨基酸与2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸（DNP氨基酸）。
这一反应是定量转变的，产物黄色，可经受酸性100℃高温。
该反应曾被英国的Sanger用来测定胰岛素的氨基酸顺序，也叫桑格尔试剂，现在应用于蛋白质N-末端测定。
（7）转氨反应在转氨酶的催化下，氨基酸可脱去氨基，变成相应的酮酸。
2.羧基的反应羧基可与碱作用生成盐，其中重金属盐不溶于水。
转氨基作用的名词解释
转氨基作用的名词解释
转氨基作用指的是一种氨基酸alpha-氨基转移到一种alpha-酮酸上的过程。
转氨基作用是氨基酸脱氨基作用的一种途径。
其实可以看成是氨基酸的氨基与alpha-酮酸的酮基进行了交换。
结果是生成了一种非必需氨基酸和一种新的alpha-酮酸。
反应由转氨酶和其辅酶磷酸吡哆醛催化。
磷酸吡哆醛是维生素B6的衍生物。
人体内最重要的转氨酶为谷丙转氨酶和谷草转氨酶。
它们是肝炎诊断和预后的指标之一。
体内大部分氨基酸都可以参与转氨基作用，例外：赖氨酸，脯氨酸和羟脯氨酸。
鸟氨酸(Ornithine)的δ-氨基也可通过转氨基作用被脱掉。
举例: alpha-酮戊二酸+ 丙氨酸= 谷氨酸+ 丙酮酸(反应可逆) 这样生物体内就可以自我合成某些氨基酸了。
实验十三氨基移换反应——谷丙转氨酶活性的测定（纸层析法）
实验十三氨基移换反应——谷丙转氨酶活性的测定（纸层析法）一、目的进一步理解转氨基作用。
学习应用纸层析法鉴定氨基移换反应。
二、原理转氨基作用是指在转氨酶的催化下α-氨基酸和α-酮酸之间的氨基转移作用。
转氨酶广泛存在于生物体内，目前已发现的转氨酶至少有50种以上，其辅酶均为磷酸吡哆醛，酶反应的最适pH为7.4。
生物体内分布最广、活力最强的转氨酶有两种：一种为谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶，GPT）主要存在于肝脏；另一种为谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶，GOT）在心肌中活力最大，其次在肝脏。
GPT⎯⎯→+α⎯−丙氨酸酮戊二酸丙酮酸谷氨酸+GOT⎯→⎯⎯+α草酰乙酸天冬氨酸酮戊二酸谷氨酸+−正常情况下转氨酶主要存在于细胞中，人及动物的血清中含量很少，活性很低。
而当组织细胞受到损伤（如发生肝炎、心肌梗死等病变）时，这些细胞中的转氨酶就会释放到血液中去，此时血清中转氨酶的含量及活性均显著增加。
因此转氨酶活性的测定在临床诊断上有重要意义。
三、仪器、试剂与材料剪刀、镊子、研钵、大烧杯、试管及试管架、吸量管、漏斗、滤纸、培养皿、表面皿、酒精灯、喷雾器、恒温水浴箱、烘箱、离心机。
1%谷氨酸溶液、1%丙酮酸钠溶液、0.1%碳酸氢钾溶液、0.025%溴乙酸溶液、2%醋酸溶液、0.9%氯化钠溶液、标准谷氨酸溶液、标准丙氨酸溶液、酚饱和水溶液（扩展剂）、0.1%水合茚三酮正丁醇溶液（显色剂）。
兔肝、海砂。
四、操作1、肝匀浆液制备在研钵中加入兔肝1g＋0.9%氯化钠3ml＋海砂200mg→置于放有冰水的大烧杯上面，研磨成匀浆→3000r/min离心5min→弃沉淀、得到肝糜匀浆液。
2、氨基移换反应：取干燥试管2支，分别标明测定管与对照管。
实验管1 对照管21%谷氨酸溶液（ml） 0.5 0.51%丙酮酸钠溶液（ml） 0.5 0.50.1%碳酸氢钾（ml） 0.5 0.50.025%溴乙酸（ml） 0.25 0.25混匀后加入肝糜提取液（ml） 0.5 0.5立即酒精灯加热或沸水浴2~3min加盖胶塞，置45℃水浴保温1h，并时常振荡2%醋酸（滴） 4 4 沸水浴中（或酒精灯）2~3min（终止反应、沉淀蛋白）离心（或过滤），收集上清液做层析使用3、层析：取3＃滤纸一张，用圆规作半径1cm的圆，通过圆心作两条相互垂直的线，与圆相交的4点作为点样位置，在滤纸圆心处剪一小孔φ2mm。
氨基酸方程式
氨基酸方程式氨基酸是生物体中必不可少的有机物质，它是由氮（N）、碳（C）、氧（O）以及一定数量的氢（H）合成而成。
它们构成了蛋白质、脂肪、糖类、核酸、激素等物质，是生物体的基本组成部分。
“氨基酸方程式”通常指的是氨基酸合成的反应方程式。
其实，氨基酸的合成过程涉及不同类型的反应，包括来自酶活性的转移胱嘧啶基化反应、2-羟基酰胺基化反应以及氨基酸互补性反应。
氨基酸方程式的基本结构是：（COOH）+（NH2）→（H2N）-（CH2）-（COOH）。
这是由一种特殊的氨基酸发展而来的。
氨基酸合成可分为三个基本步骤：第一步是将某种特定的氨基酸（起始氨基酸）与另一种不同的氨基酸或一种有机酸结合；第二步是释放一种叫做水的分子；第三步是将合成的新氨基酸从起始氨基酸中分离出来。
氨基酸合成的反应受氨基酸代谢的调节，影响着氨基酸的合成，而氨基酸代谢的调节反过来受PS四种因素的影响：光照、压力、温度和pH值；它们是构成“氨基酸方程式”的四个关键因素。
研究表明，通过增加一定比例的光照、压力和温度，可以促进氨基酸的合成；而当pH值降低时，则可以减少氨基酸的合成。
氨基酸在生物体中的合成过程，也被称为“氨基酸代谢”，它是细胞不断地以某种形式释放和吸收氨基酸的过程。
氨基酸的代谢可以分为五个步骤：氨基酸的摄取、氨基酸的运输、氨基酸的合成、氨基酸的交换和氨基酸的分解。
摄入的氨基酸被肠道细胞吸收，进入血液循环，被携带到身体各处；氨基酸的运输涉及细胞内和细胞外；氨基酸的合成是指细胞内利用氨基酸构成生物大分子的过程；氨基酸的交换涉及蛋白质的翻译作用和蛋白质的共振；氨基酸的分解是将蛋白质分解成氨基酸的过程。
氨基酸的合成是生物体体系中至关重要的一环，它不仅与生物体细胞的健康状态有关，而且涉及到细胞的免疫应答、基因表达以及多种活动，对细胞能够表达出不同遗传信息起着至关重要的作用。
许多研究表明，氨基酸合成可以调整细胞中多种信号转导通路，从而调节细胞活性，调控机体的新陈代谢，影响机体生长、发育以及免疫功能。
实验四肌肉组织氨基移换作用---纸层析
肝
肾 心 骨骼肌
44000 142000
19000 7100 4800 91000 156000 99000
胰腺
脾 肺 血清
2000 28000
1200 700 16 14000 10000 20
血清转氨酶活性，临床上可作为疾病诊断和预
后的指标之一。
COOH CH2 CH2 C=O COOH ＋ COOH H－C－NH2 CH3 ALT
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COOH CH－NH2 CH2 CH2 COOH ＋ COOH C=O CH3
α-酮戊二酸
丙氨酸
谷氨酸
丙酮酸
2. 层析
层析系统通常都有两个相组成：固定相和流动相。
混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分 在这两相中的分配情况，一般用分配系数来描述。
常用的分配层析包括柱层析、纸层析、薄层层析。
纸层析法
人体内最重要的两种转氨酶：
谷丙转氨酶（GPT）/丙氨酸转氨酶（ALT）
谷氨ห้องสมุดไป่ตู้ +丙酮酸
GPT
α-酮戊二酸 +丙氨酸
谷草转氨酶（GOT）/天冬氨酸转氨酶（AST） 谷氨酸 +草酰乙酸
GOT
α-酮戊二酸 +天冬氨酸
正常人各组织中GPT及GOT 活性 (单位/克湿组织)
组织 GPT GOT 组织 GPT GOT
固定相：吸附在滤纸纤维之间的水分
流动相：层析液水饱和酚
谷氨酸：亲水性氨基酸 丙氨酸：疏水性氨基酸 分离原理： 利用混合物各组分在固定相和流动相中分配系数 差异而分离
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2. 器材 (1) 解剖刀、剪及镊子。 (2) 解剖盘。 (3) 表面皿。 (4) 匀浆器。 (5) 台秤。 (6) 离心管和离心机（台式） (7) 试管及试管架 (8) 恒温水浴 (9) 毛细玻璃管
(10)直尺 (11)2H铅笔 (12)层析滤纸（国产新华1号滤纸） (13)电热鼓风干燥箱 (14)层析用具：玻璃钟罩、层析缸和小 烧杯。 针、线、喷雾器。
1%丙酮酸溶液
1/15mol/L pH7.4磷酸缓冲液
10滴
2ml
10滴
2ml
0.05%碘乙酸
酶液
10滴
1ml 37℃ 40min
10滴
1ml （煮沸）
30%乙酸
5滴
5滴
100℃ 10min,流水冷却,过滤取滤液
ʺ纸上层析法检查
@ 点样 ₤取15cm直径的圆形滤纸，在圆心处用圆规划一个3cm的同
心圆。
锥形瓶（50ml） 移液管(2.5ml) 微量滴定管(5ml) 小台秤
操作方法
击毙动物（家兔），迅速放血，取出肝脏，在 玻璃皿上剪成碎糜。 取50ml锥形瓶2个，各加入3ml Locke氏溶液和 2ml pH7.6的磷酸缓冲液。在一个锥形瓶中， 加入3ml0.2mol/L丁酸溶液，另一个锥形瓶作 为对照。取约0.5g肝组织两份（相等重），分 别置于两个锥形瓶内，混匀，于37℃恒温水浴 内保温。
转氨酶催化。
ʺ它们的最适pH接近7.4。在各种转氨酶中，以谷
氨酸—草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶、GOT） 及谷氨酸—丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶、GPT） 活力最强。
ʺ 上述两种酶均广泛存在于生物机体中，在正常
人血清中也有少量存在。机体发生肝炎、心肌 梗塞病变时，血清中转氮酶活力显著增加
ʺ本实验利用纸层析法，检查由谷氨酸和丙酮
酸在谷丙转氨酶的作用下所生成的丙氨酸，证 明组织内氨基移换作用。
ʺ 为了防止丙酮酸被组织中其它酶所氧化或还原，
可加碘乙酸或溴乙酸抑制酵解作用或氧化作用。
₪试剂和器材
1. 试剂 (1) 实验动物----家兔 (2) 1/15mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4） (3) 1%谷氨酸溶液（用KOH中和至中性） (4) 1%丙酮酸溶液（用KOH中和至中性） (5) 0.1%碳酸氢钾溶液 (6) 0.05%碘乙酸溶液 (7)15%三氯醋酸溶液
根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠 之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。
试剂和器材
1. 材料 动物：家兔 2. 试剂 (1)Locke氏溶液：取0.9g氯化钠、0.042g氯化 钾、0.024g 氯化钙、0.015g碳酸氢钠及0.1g葡萄糖，溶于 水中，稀释到100ml (2)0.1mol/L碘溶液:称取12.7g碘和约25g碘化钾, 溶于水中,稀释到1000ml,混匀,用标准硫代硫酸 钠溶液标定.
本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可 用碘仿反应测定。在碱性的条件下，丙酮与碘 生成碘仿。反应式如下：
2NaOH+I2→NaIO+NaI+H2O CH3COCH3+3NaOI→CHI3+CH3COONa+2NaOH
碘仿 剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠滴定。
NaOI+NaI+2HCl→I2+2NaCI+H2O I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI
氨基转移反应的定性鉴定
ʺ₪实验目的 ʺ 学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及 其原理 ʺ进一步掌握纸层析的原理和操作技术 ʺ了解氨基移换作用在中间代谢中的意义
₪实验原理
ʺ 氨基移换酶也称转氨酶,它能催化α-氨基酸的
氨基与α-酮酸的α-酮基互换，这种作用称为氨 基移换作用。
ʺ任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的
保温2小时后，取出锥形瓶，各加入2ml 15% 三氯乙酸溶液，在对照瓶内追加3ml 0.2mol/L 丁酸溶液。混匀，静置15min后过滤，分别吸 取5ml滤液，放入另外两个锥形瓶中，各加 5ml 0.1N碘溶液和10%NaoH 5ml，摇匀后静置 10 分 钟 加 入 5ml 10% HCl 中 和 。 然 后 ， 用 0.1mol/L硫代硫酸钠溶液滴定剩余的碘，滴至 浅黄色时，加几滴淀粉溶液作指示剂。摇匀， 并继续滴到蓝色消失，记录滴定样品与对照所 用的硫代硫酸钠的毫升数，并按式计算样品丙 酮含量：
丙酮含量=（B－A）×0.9667×10 5 式中，B为测定对照实验所消耗的 0.1mol/L硫代硫酸钠溶液ml数；A为滴定 样品所消耗的0.1mol/L硫代硫酸的溶液 ml数；0.9667为1ml 0.1mol/L硫代硫酸钠 溶所相当的丙酮mg数。
思考题:
1.什么叫氨基移换(或转氨基)作用? 试说明该作用得特点,及在中间代谢中得 意义. 2.为什么说脂肪酸β-氧化实验的关键是 制备新鲜的肝糜? 3.什么叫酮体?为什么正常代谢时产生的 酮体量很少?
(8) 标准丙氨酸溶液(0.1%) (9) 标准谷氨酸溶液(0.1%) (10)0.1%水合茚三酮乙醇溶液 (11)酚溶剂：在大烧杯中，加蒸馏水40ml，再 加入新蒸馏的无色的苯酚150g。在水浴中加热 搅拌，混合至酚完全溶解。将该溶液倒入盛有 100ml蒸馏水的500ml分液漏斗内，轻轻振荡 混合，使其成为乳状液。静置7-10h，乳状液 变成两层透明的溶液，下层为被水饱和的酚溶 液（即酚溶剂），放出下层，贮存在棕色试剂 瓶中备用。
₤在同心圆的圆周上取4个点， 样的位置。
每个点的距离相近，为点
₤用4支毛细管口分别取样品和对照的滤液，以及标准谷氨酸
和丙氨酸，再轻轻触到4个点样的位置上，使每种溶液分别 形成直径为2-3mm的圆斑，每次点样后，自然风干或吹风机 吹干，再点下一次，重复3-4次。
@ 纸上层析分离氨基酸 ₤在15cm直径的圆形滤纸中心剪一个小圆孔 ₤取一滤纸卷成圆筒，用剪刀将该圆筒状的滤纸的下端
@ 纸上层析中氨基酸的鉴定
₤ 取出滤纸，晾干或吹干，以除去酚溶剂
₤用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮乙醇溶液
注意：茚三酮有毒性
₤用风筒吹热风使滤纸中温度加热至60-80℃，使
氨基酸显色
₤计算Rf值，确定氨基酸的种类
实验二 脂肪酸的β-氧化
实验目的
1.了解脂肪酸的β-氧化作用； 2. 通过测定和计算反应液内丁酸氧化生 成丙酮的量，掌握测定β-氧化作用的方 法及其原理。
(3)pH7.6,mol/L的磷酸缓冲液. (4)0.2mol/L丁酸溶液:取18ml正丁酸,用 1mol/L氢氧化纳溶液中和至pH=7.6,并稀 释至1000ml。 (5)15%三氯乙酸溶液。 (6)10%氢氧化钠溶液。 (7)10%盐酸溶液。
3. 器材 玻璃皿 试管及试管架 漏斗 剪刀及镊子 恒温水浴
沿纵向剪为灯刷状，而滤纸的上端插入至15cm直径的圆 形滤纸的小圆孔中。
₤圆筒装的滤纸灯刷状的一端放在盛有层析剂的培养
皿中，灯刷状的滤纸和层析剂（酚溶液）相接触
注意：酚有腐蚀性。
₤培养皿上盖上大小一样的培养皿，纸上层析开始。
待层析剂（酚溶液）展开至15cm直径的圆形滤纸边 缘1cm时，纸上层析结束。
实验原理
根据β—氧化学说，机体组织能将脂肪酸氧化 生成乙酰辅酶A。两分子乙酰辅酶A可再缩合 成乙酰乙酸。在肝脏内，乙酰乙酸可脱羧生成 丙酮，也可还原生成β-羟丁酸。乙酰乙酸、β羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮体为机体代谢的 中间产物。在正常情况下，其产量甚微；患糖 尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高， 尿中也能出现酮体。
₪操作方法
ʺ 酶液的制备
₤将兔击晕，迅速解剖，取出肝脏，在低温 条件下剪碎 ₤称取1.5g肝脏，放入匀浆器中，再加入3ml 磷酸缓冲液。研成匀浆 ₤倒入离心管中，在500r/min的条件下， 离心5min，取上清液，即为制备的酶液
ʺ体外氨基移换反应 试管 1%谷氨酸溶液 1 (样品) 10滴 2 (对照) 10滴