基因工程 重点复习

质粒拷贝数即一个细胞内质粒的数量与染色体数量之比。

每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数。

根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严谨型质粒：分子量大，低拷贝数，1－3拷贝松弛型质粒：分子量小，高拷贝数，10－60拷贝天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。

理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。

穿梭质粒载体;人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。

优点;①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。

③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。

蓝白斑筛选的机理由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。

当外源片段插入到载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。

在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。

这样，LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做 -互补蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。

所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。

常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法2. 渗透破碎法(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。

抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。

（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。

根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。

常用方法：1. 等电点沉淀法2. 盐析法（四）样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。

常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析蛋白筛选（SDS）实验原理是：在电场的作用下，带电粒子能在聚丙烯凝胶中迁移，其迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。

十二烷基磺酸钠（SDS）能与蛋白质的结合，改变蛋白质原有的构象，使其变成近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比。

在SDS-PAGE中，SDS-复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关。

在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数，实验证实分子量在15kD～200 kD 的范围内，电泳迁移与分子量的对数呈直线关系，用此法可根据已知分子量白质的电泳迁移率和分子量的对数做出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。

同时也可根据不同分离级分的蛋白条带的多少来判定分离纯化产物的纯度。

mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体包涵体表达形式的优点1能简化外源基因表达产物的分离操作：2能在一定程度上保持表达产物的结构稳定3对宿主细胞无伤害4外源蛋白表达高包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。

(以包涵体形式表达目的蛋白的操作：如果未进行特殊设计，外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。

因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。

事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在分泌型异源蛋白的表达：在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。

蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件分泌表达形式的优点)：1目的蛋白稳定性高2目的蛋白易于分离3目的蛋白末端完整分泌表达形式的缺点)：大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全，信号肽并非总是有助于蛋白质的转运，有可能形成包涵体。

分泌型目的蛋白表达系统的构建：只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。

此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。

融合型异源蛋白的表达：除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。

由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。

以融合形式表达目的蛋白的优缺点1目的蛋白稳定性高2目的蛋白易于分离3目的蛋白表达率高4目的蛋白溶解性好5目的蛋白需要回收(缺点)融合蛋白表达质粒的构建原则）：受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。

两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺。

源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。

在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件外。

两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架大肠杆菌表达外源基因的优势1全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架2基因克隆表达系统成熟完善3繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定4被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物限制性内切核酸酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。

1、Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性有哪些？只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在，其识别和切割DNA分子具有严格的特异性①识别序列的特异性：识别序列为4-6bp的双重螺旋对称结构的回文序列②切割位点的特异性：在识别序列内或附近特异切割。

3、DNA连接酶的作用特点有哪些？了解这些特点有何利用价值？作用特点：①不能连接两条单链DNA或环化DNA，只能连接双链DNA分子的单链缺口。

②只能连接失去一个磷酸二酯键形成的单链断裂，不能连接缺失一个或多个氨基酸缺口③只作用于3端羟基和5端磷酸的链④连接反应需要ATP或NAD+和Mg2+利用价值：可对缺口DNA，平末端DNA，黏性末端DNA进行连接。

载体：能携带外源基因（或DNA片段）进入细胞复制、整合或表达的工具。

质粒载体：存在于多种宿主细胞中，独立于染色体外的可自主复制闭合环状的DNA分子，整合或表达的工具。

噬菌体载体：应用噬菌体作为载体，广泛应用于大片段DNA克隆和文库构建的一类载体，代表有λ类噬菌体载体，M13噬菌体载体。

RNAi：RNA干扰，是双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰。

VIGS：病毒诱导的基因沉默，是利用植物体内天然存在的免疫机制，将目的基因片段构建到病毒载体中并用病毒侵染寄主植物，目的基因片段作为病毒的一部分同病毒一起复制并扩散到整株植物，植物体的防御机制被病毒激活后，在识别病毒和目的基因的同时，将内源的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。

1、克隆载体必须满足那些基本条件？基本条件：①具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞；②能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；③具有由单一限制性内切核酸酶识别位点组成的多克隆位点，可供外源基因的插入；④具有合适的选择性标记，用于筛选。

2、质粒具有那些特征？特征：①独立复制性：质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区，能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。

②质粒的不相容性：两种质粒在同一宿主细胞中不能共存③转移性：其含有tra基因，能指令宿主细胞与受体细胞结合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。

④携带特殊的遗传标记：野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，如物质抗性和物质合成。

3、你认为理想的载体应该是怎样的？如何设计？理想的载体：①分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段；②能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制；③要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点，MCS）；④有适合的标记，易于选择；⑤有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达；⑥从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。

设计：①加入合适的选择标记基因②增加或减少合适的酶切位点③缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量④改变复制子，变严谨为松弛，变少拷贝为多拷贝⑤根据基因工程的要求，假装特殊的基因元件基因工程定义：在体外将外源基因进行切割并与一定的载体连接，构成重组DNA分子并导入相应受体细胞，使外源基因在受体细胞中进行复制、表达，使目的基因大量扩增或得到相应基因的表达产物或进行定向改造生物性状。

上游技术：（狭义基因工程）外源基因重组、克隆和表达的设计与构建下游技术：（广义基因工程）含有外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因的表达、分离、纯化过程。

基本过程：（操作）从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。

（切）用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。

（接）目的基因与载体DNA的体外重组，形成重组DNA分子。

（转）把重组的DNA分子引入受体细胞，并建立起无性繁殖系。

（选）筛选出所需要的无性繁殖系，并保证外源基因在受体细胞中稳定遗传、正确表基因工程的四大要素：目的基因、载体、工具酶、宿主细胞。

限制性内切酶的概念：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列，并由此处切割DNA双链结构的核酸内切酶。