基因工程复习重点
基因工程复习重点
Southern blotting：即DNA印迹杂交，以碱基互补配对为原则，将DNA影印转移与标记探针进行高特异性杂交的方法。
Cosmid：黏粒载体，含有λ噬菌体的cos位点和质粒的复制子，是专门为克隆大片段设计的载体。
cDNA library：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增称cDNA文库。
RACE：通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增，得到基因转录本的未知序列，从而获得mRNA完整序列的方法。
RT-PCR：即逆转录PCR，先用逆转录酶作用于mRNA，以寡聚dT为引物合成cDNA 第一链，然后用已知一对引物，扩增嵌合分子的一种方法。
MCS：包含多个限制酶切位点的一段短的DNA序列。
插入失活：若把外源DNA片段插入到载体的选择标记基因中而使此基因失活，丧失其原有的表现特性，此方法叫插入失活。
PCR：是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。
mRNA差异显示技术：根据真核生物mRNA带有3’poly(dA) 的结构，合成poly(dT)12MN引物与mRNA的3’端互补，在反转录酶的作用下合成cDNA－mRNA 杂交分子。
然后合成5’随机引物(10bp) 和poly(dT)12MN引物，PCR扩增获得所有mRNA的cDNA分子。
巢式PCR：巢式PCR使用两对PCR引物扩增完整的片段。
第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。
第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。
实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
蛋白质印迹法：又称免疫印迹法，在蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定基础上发展起来的蛋白质检测技术，检测蛋白样品中是否存在抗原，也可以评价新抗体的特异性。
大学基因工程复习归纳重点复习资料
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。
宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。
4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
基因工程原理复习重点
1.基因家族(Gene family)又叫多基因家族(Multigene family ),系指同一生物体中，从同一祖先基因经过复制、突变而来的一组具有相似的核苷酸序列结构、相似产物、相似功能的基因群体。
从广义上讲，同一基因家族的各个成员也可看作是重复基因。
但两者相比，基因家族不同成员之间的序列差异毕竟要比重复序列的大一些，也就是说序列一致性程度还是较低一些。
2.基因簇(Gene cluster)系指原核生物基因组中，由不同的或相关的一组相邻基因组成的一种特殊的排列组合方式。
3.基因家族与基因簇二者的区别属于同一多基因家族的各个成员，可以存在于不同的染色体上，也可以是存在于同一条染色体上。
同一基因家族成员的判断标准：a.多重性；b •紧密的连锁性；c.核苷酸序列同源性；d.相关的表型与功能。
基因簇的特点：a.同一基因簇的不同成员，在遗传上往往是紧密连锁的；b.同一基因簇的不同成员，可以是同属于同一个操纵子的不同结构基因，也可以是属于不同操纵子的不同结构基因。
c.同一基因簇的不同成员，可以是来自同一基因家族的不同成员，也可以是来自不同基因家族的不同成员。
4.基因图(Gene map):是描述染色体或DNA大分子上，不同基因的排列顺序及其间隔距离的一种线性图。
5.基因作图(Gene mapping):按照遗传学的方法或者是物理学的方法绘制基因图的过程，叫做基因作图。
基因作图有时也叫做基因定位。
它涉及如下两个具体的内容：a•其一是确定被研究的目的基因与细胞染色体之间的关系，也就是说将目的基因定位在某条特定的染色体分子上。
b•其二是测定目的基因与所在染色体的其它基因之间的间隔距离，以及它们之间的线性排列顺序，亦即是确定目的基因在染色体上的位置。
基因图包括遗传图和物理图两种。
两者之间的本质差别在于前者表示的是以重组率为单位的基因间的相对距离，而后者表示的是以碱基对( bp)为单位的基因间的实际距离。
6.基因增加(Gene addition):与基因扩增概念不同，它是通过将一种或一群外源基因导入受体细胞，从而使受体细胞中基因种类增加，用以观察并研究其功能作用的一种基因工程策略。
基因工程复习知识点
基因工程复习资料一、知识点1.根据基因工程的定义，能替代基因工程的术语。
2. 含有II型限制性内切酶切位点的DNA 片段的特点。
3.已知一双链DNA分子，分别用限制酶Ⅰ、限制酶Ⅱ切割单独切割得到不同片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到另外的片段，据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况。
4．质粒分子生物学的描述。
5．在植物基因工程中广泛使用的载体。
6．质粒带有α互补的 lacZ'标记基因，那筛选培养基中加入显色底物和诱导物分别为？7．载体常用的选择性标记：抗生素、生化标记、营养缺陷型标记的包括哪些（要能区分缩写符号）。
8．DNA双链是靠什么化学键维持？9．能有效区分重组子与非重组子的是方法有哪些？10．离体cDNA 合成中所涉及的工具酶是有哪些？11．强化基因转录的元件是哪些？12．基因调控元件中属于负调控顺式作用元件的是哪些？13．关于包涵体的叙述。
14. 在单子叶、双子叶植物及动物的遗传转化过程中，应用最成功的间接转化法分别是什么15. 在对转基因植物进行分子鉴定时，检测外源基因的整合、表达、转录，分别可以采用哪些方法？16．细菌存在限制-修饰的现象，其生理意义是什么？17．Taq DNA 聚合酶的发现使得 PCR 技术的广泛运用成为可能，是利用其哪个特点？18．关于柯斯质粒（cosmid）描述。
19．Cosmid、 -DNA 、 Plasmid几种常用载体的装载量大小比较20．载体质粒 pBR322上的两个选择性标记： Ap r、 Tc r。
它们分别含有一个单一酶切位点： Pst I 、 Sph I。
若将一外源基因插入Ap r中的Pst I位点，那么转化子和重组子如何筛选，若插入Sph I又如何筛选？21．DNA-DNA,DNA-RNA分子杂交的化学原理是什么（靠什么维持其双链稳定性）？22．cDNA 法获得目的基因的特点表现为？23．原核生物启动子的特征是有哪些？24．强化 mRNA 翻译的元件是哪些？25．高等哺乳类动物基因在大肠杆菌中高效表达时，包涵体形成的原因是？26.动物基因转移法中的胚胎干细胞法有何特点？（）27. 如何正确理解基因漂移？28.熟悉pBR322、pUC18/19载体的组成元件及作用、简写所代表的含义。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因堆叠技术和dna重组技术，就是以分子遗传学为理论基为础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内乌核酸酶就是一类能够辨识双链dna中特定核苷酸序列（辨识序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内乌核酸酶通常就是以第一次抽取至这类酶的生物的种名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字ⅰ、ⅱ、ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.dna连接酶：定义：dna连接酶也称dna黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接dna链3‘-oh末端和，另一dna链的5’-p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的dna链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌dna连接酶、t4dna连接酶、tscdna连接酶、真核生物细胞辨认出的连接酶，例如酶ⅰ、酶ⅱ、酶ⅲ等多种类型。
4.dna片段的相连接方法：①具互补黏性末端dna片段之间的连接：可用e?colidna连接酶，也可用t4dna连接酶。
②尼奥罗末端dna片段之间的相连接：就可以用t4dna连接酶，并且必须减少酶的用量。
③dna片段末端修饰后进行连接：dna片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；dna片段5′端脱磷酸化后进行连接；dna片段加连杆或衔接头后连接。
5.dna聚合酶：①定义：dna聚合酶就是指用dna单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化剂制备一条与模板链序列优势互补的dna新链的酶。
基因工程复习提纲
1.1 DNA重组技术的基本工具一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
概念分析①基因工程技术的原理：基因重组②目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
③操作水平：DNA分子水平④操作环境：体外⑤优点：克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物性状从结构上分析，为什么不同生物的DNA能够重组?(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。
二、基础理论和技术的发展催生了基因工程（一）基础理论的重大突破①DNA是遗传物质的证明 1944年，艾弗里等人通过不同类型肺炎双球菌的转化实验，不仅证明了生物的遗传物质是DNA，还证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体，艾弗里等人的工作可以说是基因工程的先导。
②DNA双螺旋结构和中心法则的确立1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1958年，梅赛尔松和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
中心法则阐明了遗传信息流动的方向。
③遗传密码的破译人们认识到，自然界中从微生物到人类共用一套遗传密码，而且为基因的分离和合成等提供了理论依据。
（二）技术发明使基因工程的实施成为可能①基因转移载体的发现 1967年，罗思和赫林斯基发现细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移，这一发现为基因转移找到了一种运载工具②工具酶的发现科学家发现了多种限制酶、连接酶、逆转录酶，这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
③DNA合成和测序技术的发明④DNA体外重组的实现⑤重组DNA表达实验的成功 1973年，博耶和科恩选用仅含单一EcoRI酶切位点的载体质粒pSC101，使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段重组。
基因工程复习(含答案)
基因工程复习题一、名词解释: （10～20%）基因工程基因工程工具酶限制性内切酶限制性内切酶得Star活性PCR引物PCR扩增平台期DNA芯片基因组文库cDNA文库转化限制与修饰系统原位杂交: 将细胞或组织得核酸固定保持在原来得位置上, 然后用探针与之杂交得一种核酸分子杂交技术, 该方法可较好地反映目得基因在细胞或组织中得分布与表达变化。
粘性末端: 双链DNA被限制性内切酶切割后, 形成得两条链错开几个碱基, 而不就是平齐得末端。
Northern印迹杂交: 将RNA进行变性电泳后, 再转移到固相支持物上与探针杂交得一种核酸分子杂交技术, 可用于检测目得基因得转录水平。
转位: 一个或一组基因片段从基因组得一个位置转移到另一个位置得现象。
基因工程: 在体外, 用酶学方法将各种来源得DNA与载体DNA连接成为重组DNA, 继而通过转化与筛选得到含有目得基因得宿主细胞, 最后进行扩增得到大量相同重组DNA分子得过程称为基因工程, 又称基因克隆、DNA克隆与重组DNA等。
目得基因：基因工程中, 那些被感兴趣得、被选作研究对象得基因就叫作目得基因。
连接器: 人工合成得一段含有某些酶切位点寡核苷酸片段, 连接到目得基因得两端, 便于基因重组中得切割与连接。
转化: 受体细胞被导入外源DNA并使其生物性状发生改变得过程。
停滞效应: PCR中后期, 随着目得DNA扩展产物逐渐积累, 酶得催化反应趋于饱与, DNA扩增产物得增加减慢, 进入相对稳定状态, 即为停滞效应, 又称平台期。
逆转录PCR: 以mRNA为原始模板进行得PCR反应。
PCR: 即聚合酶链式反应。
在模板, 引物, 4种dNTP与耐热DNA聚合酶存在得条件下, 特异性地扩增位于两段已知序列之间得DNA区段地酶促合成反应。
α-互补（α-complementation）：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中, 插入了lac 启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸得核苷酸序列（又称α-肽）, 该序列不能产生有活性得β-半乳糖苷酶。
基因工程概论复习重点
复习题一、名词解释1. 原核基因（Prokaryotic gene）：由原核生物（如大肠杆菌）基因组编码的基因，以及高等生物细胞器线粒体基因组和叶绿体基因组等编码的基因，统称原核基因。
2. 真核基因（Eukaryotic gene）：真核生物基因组DNA编码的基因,以及感染真核细胞的DNA病毒和反转录病毒基因组编码的基因，统称真核基因。
3. .前导序列（Leader sequence）：又叫前导序列区或5'-非翻译区（5'-UTR），，系指位于mRNA5'-起始密码子之前的一段长数百个核苷酸的不翻译的RNA 区段。
4. 尾随序列（Tai1er sequence）：又称尾随序列区或3'-非翻译区（3'-UTR），系指位于mRNA3'-终止密码子之后一段100多核苷酸的不翻译的RNA区段。
5 复制子（Replicon）：指有一个复制起始区（oriC）和起始基因的DNA复制单元。
例如细菌染色体、病毒基因组、质粒基因组等，凡其DNA能够进行复制的遗传单元，均称复制子。
真核细胞基因组的复制子是指含有一个复制起始位点的DNA（RNA）的复制子特称复制单元。
6. 增强子（Enhancer）：又叫增强子序列或增强子元件，是真核基因中发现的一种特异序列，能够在距离目标基因50kb以上的位置，从上游或下游的不同位置及方向增强该基因的转录活性。
7. 沉默子（Silencer）在真核基因启动子中除了增强子之外，沉默子同样也是一种可远距离调控相关基因转录活性的顺式元件。
与增强子一样，沉默子也能够从启动子的上游、下游甚至是基因内部三种不同的位置以及正向或反向，影响相关基因启动子的转录起始效率。
同时沉默子往往是以组织特异性或时间特异的作用方式，控制基因的表达作用。
但与增强子的功能效应相反，沉默子只能抑制而不能激活相关基因的转录起始活性。
8. 绝缘子（Insulator）亦即是增强子活性的物理边界元件（physical boundaryelement），它是一段能够抑制或隔离增强子功能效应的顺式转录调节序列。
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绪论1.理论上的三大发现：（1）1944年，美国微生物学家Avery证明基因就是DNA分子，提出 DNA是遗传信息的载体。
（2）1953年，美国科学家Watson 和英国科学家Crick提出 DNA Double Helix model。
1958年，Meselson 和Stahl证明 DNA半保留复制。
（3）1968年，Nirenberg、Holley和Khorana解读了遗传密码及其在蛋白质合成方面的技能而分享诺贝尔生理医学奖。
2.技术上的三大发现:（1）限制性核酸内切酶的发现（1962年Arber ）（2）DNA连接酶的发现（1967Gellert）（3）基因工程载体的发现3.基因工程研究的内容：(1)从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。
(2)在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。
(3)将重组DNA分子引入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞)。
(4)带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖群体(菌落)。
(5)从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。
(6)将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步研究分析；(7)将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
第二章基因克隆所需的工具酶一、限制性内切酶1．限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。
它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA 对生物细胞的入侵受到限制修饰作用：生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏。
2．核酸内切限制酶的类型：I型、II型、III型3．核酸内切限制酶的命名法由H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统4.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性：a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂；b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；c.??? 因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。
一、识别位点：绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。
我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。
切割位点都具有相同的双重旋转对称的结构形式（回文结构）。
二、切割类型：（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段；（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。
三、产生的末端特征：1、粘性末端：是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。
（平末端的DNA片段则不易于重新环化。
）2、同裂酶：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶。
3、同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。
4、由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”。
四．影响核酸内切限制酶活性的因素：(1) DNA的纯度。
提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法：①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。
②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。
③延长酶催化反应的保温时间。
(2) DNA的甲基化程度：核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。
为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。
(3) 酶切消化反应的温度：大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃。
消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。
(4) DNA的分子结构(5) 核酸内切限制酶的缓冲液：核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,?-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。
酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。
pH=7．4时，最佳1、星号活性：EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做星号活性，以EcoRI*表示。
二．DNA连接酶1、种类：①、T4噬菌体DNA连接酶：可连接 1，两个带有互补粘性末端的双链DNA分子2，两个带有平末端的DNA双链DNA分子3，一条链带有切口的DNA分子4，RNA：DNA杂合体中RNA链上的切口，也可将RNA末端与DNA链连，底物广泛。
②、大肠杆菌DNA连接酶1.底物是一条链带有切口的双链DNA分子2.具有同源互补粘性末端的不同DNA片段3.几乎不能催化两个平末端的不同DNA片段4.底物要求严格，假阳性背景底4、携带特殊的遗传标记6、受体细胞应具备的条件：限制性缺陷型、重组整合缺陷型、具有较高的转化效率、具有与载体选择标记互补的表型、感染寄生缺陷型三、DNA聚合酶1、DNA聚合酶I是一个多功能酶，它包括三种不同的酶活力：(1) 5’---->3，聚合酶活性：催化单核苷酸结合到DNA模板的3，一OH末端，以ssDNA作模板，沿引物的3，一OH方向按模板顺序从5，一3’延伸。
(2) 5， ----> 3，外切酶活性：E．co1i DNA 聚合酶1也能从游离的5，末端降解dsDNA成为单核苷酸。
(3) 3，----> 5，外切酶活性：DNA聚合酶I还能从游离的3，OH末端降解dsDNA或ssDNA成为单核苷酸。
缺口转移：指在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5’--->3，核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。
当外切酶活性从缺口的5，一侧移去一个核苷酸之后，聚合作用就会在缺口的3，一侧补上一个新的核苷酸。
但由于PolI不能够在3，—OH和5，—P之间形成一个键，因此随着反应的进行，5，一侧的核苷酸不断地被移去，3，一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动。
这种移动特称为缺口转移。
2 ．Klenow片段Klenow聚合酶的主要用途：标记DNA末端。
１）修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端；２）标记DNA片段的末端；3. T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶，是从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶。
具有两种酶催活性，即5，--->3，的聚合酶活性和3，--->5，的核酸外切酶活性。
4.TaqDNA 聚合酶从极度嗜热菌提出。
具有5’ 3’聚合酶活性和3’ 5’外切酶活性。
主要用于PCR扩增。
四、逆转录酶1、又称RNA依赖的DNA聚合酶。
这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶。
产物DNA又称cDNA2、逆转录酶的主要用途是转录mRNA成为cDNA制备基因片段。
另外，它也可用ssDNA或RNA做模板制作制备，杂交探针。
3、逆转录酶的酶活性：(1) RNA依赖的DNA聚合酶以RNA链为模板，以带3，一OH末端的DNA片段为引物，沿5，--->3，方向合成DNA 链。
(2) DNA依赖的DNA聚合酶以ssDNA为模板，以带有3’一OH末端的DNA片段为引物，从5’--->3’方向合成DNA链。
(3)外切RNA酶活性底物是RNA—DNA杂交分子中的RNA链，有两种活性形式。
从RNA链5’末端外切的称5’--->3’外切RNA酶，从RNA链3’末端外切的称3，--->5，外切RNA酶H。
第三章基因克隆载体1、载体：指携带外源基因进入受体细胞的这种工具。
（载体的本质是DNA）2、基因工程中所用的载体：(1)?? 质粒(Plasmid)，主要指人工构建的质粒。
(2)噬菌体且的衍生物。
(3)cosmid(柯斯质粒)。
(4)单链DNA噬菌体M13。
（5）动物病毒。
3、作为基因工程用的载体，以下三方面是它们共有的特性和基本要求：(1)在宿主细胞中能独立自主的复制，即本身是复制子。
(2)容易从宿主细胞中分离纯化。
(3)载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，插在其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行复制和扩增。
一、质粒载体1、质粒：是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子，它广泛存在于细菌细胞中。
在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。
2、F质粒：又叫F因子或性质粒(sex plasmid)。
F因子是雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的F—细胞则叫做雌性细胞。
3、R质粒：也称抗药性因子。
R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力4、Col质粒：此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。
大肠杆菌素是一种毒性蛋白，它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。
5、在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这一现象称为质粒的不亲和性，也称不相容性。
6、质粒载体的基本条件(1) 能自主复制，即本身是复制子(2) 具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；(3) 在基因组中有1—2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。
(4) 分子量要小，多拷贝，易于操作。
7、载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞、为外源基因提供复制能力或整合能力、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件8、载体应具备的条件（共有特性）：(1) 在宿主细胞中能独立和稳定的自我复制，即本身是复制子。
(2) 具有合适的限制性内切酶位点。
(3) 具有合适的选择标记基因，来筛选重组体DNA9、质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。
（质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型的）绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，10、根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为：严紧型松弛型复制控制的质粒、松弛型复制控制的质粒11、质粒的基本特性：1、质粒的自主复制性2、质粒的不相容性3、质粒的可转移性12、革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒（能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞《结合作用》）、非接合型质粒（不能在天然条件下独立地发生接合作用）13、实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 1、氯化铯密度梯度离心法 2、沸水浴法 3、碱溶法14、按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：单链DNA病毒、双链DNA病毒、单链RNA病毒、双链RNA病毒15、考斯质粒：是一类人工构建的含有l-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。