差异显示
mRNA差异显示技术概述
抑 制有 关 的基 因鉴定 与克 隆 中 ，这种 方法 称 为差异
显 示 反转 录聚合 酶链 式反 应 （ Ｄ Ｔ Ｐ Ｒ） Ｄ Ｒ —Ｃ 。
１ ｍＲ ＮＡ差 异显 示技术 的原 理
ｍ Ｎ 差异 显 示技 术 和 Ｒ Ａ 随机 引 物 聚合 酶 Ｒ Ａ Ｎ
链 式 反 应 （ Ａ — Ｃ 都 是 基 于 这 样 一 种 假设 ：只 Ｒ Ｐ Ｐ Ｒ）
中采用的只是随机的寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物， 而 ｍ Ｎ 差 异显 示 技 术 则是 根 据成 熟 的 ｍＲ Ａ ３ Ｒ Ａ Ｎ
端具 有 ８ ～ ０ ｐ的起保 护 作 用 的 ｐｌ（ 尾 巴这 ０ ２０ｂ ｏｙＡ）
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床 麻 醉 学 杂 志 ， ０ ０ １ （Ｏ ： ０ — ０ ． ２０ 。 ６ １ ） ５３ ５ ５
［１ 王先远， 兰兴 ． 氨酸对烧伤大 鼠细胞因子的影 响ｆ． １】 高 精 Ｊ 营养 ］
学 报 ，１９ ， ８ ４ ： ９ — ９ ． ９６ １（）３２３７
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人类 基 因组协 会公 布 的最新 数据表 明 ，人类 和 其他 高 等 生 物基 因组 可 能包 含 约 ３ ０ ００ ０蛋 白编 码 基 因 ，其 中 仅 约 １ ％被 认 为 是 在 不 同发 育 阶 段 、 ５
荧光标记mRNA差异显示技术
荧光标记mRNA差异显示技术mRNA差异显示技术（differential display，DD）是用于研究基因的差异表达的新方法。
该技术自1992年被首次报道后，即以其不可替代的优势被广泛应用于生物医学领域。
在应用过程中不断得到改进，并产生了诸多衍生技术如RPA（RNA finger printing by arbitrarily primed PCR）、GDD （genomic DD）等。
本文简要介绍在本试验室荧光标记差异显示技术（fluorescent DD，FDD）的应用及体会。
1.材料与方法1.1 标本人单核细胞系U937，细胞密度2×108/L，分对照组（N）、处理Ⅰ组（T1）、处理Ⅱ组（T 2），N用1640培养基及10%胎牛血清培养，T1用IF N-γ104U/L LPS 1μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0μg/L分别刺激7h.1.2 主要试剂与仪器TRIzol试剂（GIBCO BRL）、Fluoro DD试剂盒（Genomyx）、Supersript Ⅱ逆转录酶（GIBCO BRL）、Ampli Taq DNA聚合酶（GIBCO BRL）、RNase-free DNaseI（Promega）；Genomyx LR 、 Genomyx SC、DNAT hermal Cycler（Perkin Elmer）1.3 总RNA的制备按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总RNA,以RNase-free DNase I（终浓度80 000 U/L）除去其中污染的 DNA,经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检测其纯度1.4 mRNA差异显示1.4.1 逆转录反应选择锚定引物[T7（dT12）AP(anchored prime rs，AP)]，序列为5'ACGACTCACT ATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3'，其中M=A/G/C。
Linux命令高级技巧使用diff进行文件比较和差异显示
Linux命令高级技巧使用diff进行文件比较和差异显示Linux命令高级技巧：使用diff进行文件比较和差异显示在Linux系统中，diff命令被广泛应用于文件比较和差异显示。
它可以帮助我们找出文件之间的差异，并方便地比较和合并文件。
本文将介绍如何高效地使用diff命令进行文件比较和差异显示的高级技巧。
一、diff命令基本用法diff命令的基本用法非常简单，通常通过以下格式来使用：```diff [选项] 文件1 文件2```其中，文件1和文件2是我们想要进行比较的文件。
diff命令会逐行比较两个文件的内容，并输出它们之间的差异。
下面是一个简单的例子：```$ diff file1.txt file2.txt```该命令会将file1.txt和file2.txt之间的差异输出到终端上。
二、显示具体差异diff命令提供了多种选项，用于控制输出的格式和内容。
其中，最常用的选项是`-c`和`-u`。
它们可以显示更详细的差异信息，并以上下文的方式呈现。
1. 使用-c选项`-c`选项用于显示上下文中的差异信息，输出的格式更加清晰明了。
以下是一个例子：```$ diff -c file1.txt file2.txt```上述命令会显示出file1.txt和file2.txt之间的具体差异，并给出上下文的部分内容，使我们更好地理解差异所在。
2. 使用-u选项`-u`选项与`-c`选项类似，也用于显示差异信息并提供上下文。
不同的是，`-u`选项的输出格式更加紧凑，适合于查看较大文件的差异。
以下是一个例子：```$ diff -u file1.txt file2.txt```这条命令会以更简洁的方式显示file1.txt和file2.txt之间的差异，并增加上下文的内容。
三、忽略空白字符和空行在比较文件时，有时我们希望忽略其中的空白字符和空行，只关注实际内容的差异。
diff命令提供了`-b`和`-B`选项，用于实现这一功能。
mRNA差异显示技术解读
八.DDRT-PCR的技术改进
针对以上不足,特别是假阳性率高的缺点，从以下几个方面 做了大量改进：
引物设计 反应条件的优化 显示方法 假阳性鉴定
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引物设计
mol等将12种锚定引物变为4种，并发现G的扩增 效果最好
王夏等在T12MN之前加上了一段T7启动子序列， 提高了PCR反应的严谨性 Liang发现9~10个mer长度的随机引物比较适宜
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三、mRNA差异显示技术的原理：
mRNA差异显示技术的主要原理是利用 cDNA反转录技术,PCR扩增和高分辨率聚丙 烯酰胺凝胶电泳技术，来显示PCR产物的差 异。其中，反转录技术中使用了一系列能与 mRNA的Poly（A）尾巴相结合的锚定寡聚 脱氧核苷酸引物OligoT12MN。锚定引物与 mRNA的Poly（A）+的两个碱基，在反转录 酶的作用下可以启动mRNA群体反转录。
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mRNA差异显示技术简略流程图
六. DDRT-PCR的优点
以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础 灵敏度高，仅需0.2μg的总RNA 可以同时比较多个样品间基因表达的 差异 可以同时检测到“上调”及“下调” 的基因 时间短，实验过程中可步步验证比较 可进行多基因家族的表达分析
主要用于医学研究的癌症、神经、 骨科、病理、生殖等领域 动植物遗传、育种，动物营养及微 生物等领域
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五. DDRT-PCR一般操作步骤
总RNA的提取与反转录 RT-PCR
聚丙烯酰胺凝胶电泳及差异DNA条带的回收
PCR在扩增及其产物的回收
测序和数据库比对分析
实时定量PCR
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差异显示RT-PCR技术在我国毒理学研究中的应用
（ 赣南医学院预防医学教研室 ， 江西 巾躅分类号 ：５ Ｑ０ ３ 文献标识码 ： Ａ 赣州 ３ １０ ） ４ ００
文章编号 ：０ １— ７ ９ ２０ ） １ ０ ５ ０ １０ ５ ７ （０ ７ ０ — １８— ３ 条件再次扩增 ， 产物用 作探 针进行 Ｎ ｒ ｅ 杂交 以鉴定差 异 ｏｔ ｒ ｈｎ 表达的 ｍＲ Ａ， Ｎ 随后经克 隆和 序列 分析 等过 程 ， 最后将 获得 的差异显示 ｃ Ｎ Ｄ Ａ序 列与 Ｇ ｎ ａｋ数据 库 中的 已知 序列进 ｅ ｂｎ 行同源性匹配 ， 即可确 定差异 表达 的基 因是 已知的基 因 （ 表 达上调或者表达下调 ） 还是新 发现的基 因。其 主要操作流 程
维普资讯
第 ２ 卷第 １ ７ 期 学
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Ｊ ＲＮＡＬ ＯＦ Ｇ ＯＵ ＡＮＮＡＮ ＭＥＤ Ｃ Ｉ ＡＬ ＵＮＩ ＲＳＴ ＶＥ Ｉ Ｙ
差 异显 示 Ｒ —Ｃ ＴＰ Ｒ技 术在 我 国毒 理 学研 究 中 的应 用
较分析 ； 重现性好 ， ％ ～ ５ ④ ９ ０ ９ ％的条带 能够重 显 ； 可同 时 ⑤ 检测基 因的上 调和下调 表达 ， 这显然有 利于基 因表达调控方 面 的研究 ； ⑥操 作简单 ， Ｒ 如 Ｔ—Ｐ Ｒ技 术 、 Ｃ 聚丙烯 酰胺凝 胶 电泳技术等都 是分 子生 物学 实验 的常规 技术 ； ⑦操 作快 速 、 实验周期短 ， 仅需两天或 更短时 间即可 获得差异 表达 的 ｃ ・ Ｄ Ｎ Ａ谱带 ， 探针的重新 扩增 到 Ｎｒ ｅ 杂 交一 般 只需一 周 的 ｏｈｒ ｔｎ 时间 ； 实验 过程 中可步 步验 证 比较 ， ⑨ 即实验 者 自始 至终 都可 以监测 实验 的进行情 况 ， 而避 免 了盲 目性 。总之 ， 从 可 简单地 将 差 异 显 示 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｒ 的特 点 概 括 为 ： ３ Ｒ ， Ｃ “ Ｓ Ｖ” 即
数据比较小技巧Excel的差异突出显示和数据匹配联动方法
数据比较小技巧Excel的差异突出显示和数据匹配联动方法数据比较小技巧：Excel的差异突出显示和数据匹配联动方法Excel是一种常用的数据处理和分析工具。
虽然大多数人都知道如何使用Excel来进行数据输入和简单的计算，但Excel实际上是一个功能非常强大实用的软件，有许多令人惊叹的功能，其中包括比较小数据集中的差异并进行匹配联动等。
在本文中，我将讨论两种方法：差异突出显示和数据匹配联动方法，这些方法将帮助您更有效地使用Excel。
1. 差异突出显示如果您正在比较两个数据集并且想要突出其中的差异，那么您可以使用Excel的条件格式功能。
条件格式是指根据指定条件自动格式化单元格。
例如，您可以设置条件格式以使Excel突出显示所有值大于或小于某个特定值的单元格。
在比较两个数据集时，可以使用以下步骤设置条件格式：步骤1: 将两个数据集分别放在Excel两个不同的工作表中步骤2: 在每个工作表中选择要比较的值及其相应单元格步骤3：点击“开始”按钮，在“样式”组中选择“条件格式”下拉菜单中的按钮。
步骤4：选择“新建规则”或“管理规则”，然后选择“使用公式确定要格式化的单元格”步骤5：在诸如"Format values where this formula is true"之类的条件格式设置对话框中，输入一个公式，该公式将比较两个数据集中的单元格。
步骤6：根据需要选择想要的格式，以强调或标识差异2. 数据匹配联动假设您有两个数据集，如商品库存和订单。
您想要根据订单中的商品编号自动显示库存中的商品名称、价格和库存量。
为此，您可以使用Excel中的“数据匹配联动”。
步骤1：确保两个数据集都正在同一个工作簿中，并且它们都定义具有相同名称的表。
如果您有独立的Excel文档，请打开每个文档并将其保存为同一工作簿中的不同工作表。
步骤2：选择数据集中的单元格，其中一个数据集是订单，另一个数据集是商品库存。
数据比较进阶Excel的差异突出显示和数据匹配方法
数据比较进阶Excel的差异突出显示和数据匹配方法数据比较进阶：Excel的差异突出显示和数据匹配方法在日常工作和学习中，我们经常需要对数据进行比较和匹配，以便找出其中的差异和相似之处。
Excel作为一款功能强大的电子表格软件，提供了多种方法来进行数据比较和匹配。
本文将介绍Excel中的差异突出显示和数据匹配方法，并指导读者如何灵活地运用这些方法。
一、差异突出显示差异突出显示是一种直观的数据比较方法，通过对比两个数据集的差异，将差异部分以特殊的格式进行标记，以便用户快速定位和分析。
在Excel中，有两种常用的差异突出显示方法：条件格式和比较工具。
1. 条件格式条件格式是Excel提供的一种便捷的数据可视化工具，通过为数据设置一系列条件，使满足条件的单元格在显示上有所区别，以突出显示数据的差异。
以下是一个简单的使用条件格式进行差异突出显示的示例：首先，选中需要进行比较的数据范围，然后点击Excel菜单栏中的“开始”选项卡，在“样式”组中点击“条件格式”按钮，在下拉菜单中选择“使用公式来确定要设置格式的单元格”选项。
接下来，在弹出的对话框中输入条件的公式，例如：=A1<>B1。
该公式表示如果A1单元格的值不等于B1单元格的值，则应用该条件格式。
同时，可以选择应用的格式，比如设置背景色或字体颜色等。
最后，点击“确定”按钮，差异部分的单元格将会以你设置的格式进行突出显示。
2. 比较工具Excel还提供了一款功能强大的内置比较工具，可以帮助用户快速发现数据集之间的差异。
使用比较工具进行差异突出显示的步骤如下：首先，打开需要进行比较的两个工作簿，并在“视图”选项卡中点击“新窗口”按钮，使得两个工作簿分别在两个窗口中打开。
然后，在其中一个窗口中选择“视图”选项卡中的“查看窗口”的“比较边栏”功能，Excel会自动检测到打开的两个工作簿，并显示差异部分的摘要信息。
最后，点击摘要信息中的差异部分，Excel会跳转到具体的单元格，用户可以根据需要进行进一步的查看和分析。
数据透析表中的差异突出显示方法
数据透析表中的差异突出显示方法数据透析表是一种常用的数据分析工具，用于对大量数据进行汇总和分析。
在数据透析表中，经常需要突出显示数据之间的差异，以便更好地理解和分析数据。
本文将介绍一些常用的差异突出显示方法，帮助您有效地展示数据透析表中的差异。
1. 条形图：条形图是一种常见的用于比较不同类别或组之间差异的图表类型。
在数据透析表中，可以使用条形图来比较不同维度或指标之间的差异。
通过将不同维度或指标的数值绘制成条形并排显示，可以直观地体现出数据之间的差异。
条形图可以支持单维度或多维度的差异展示，并且可以根据需要进行排序和筛选，以更好地呈现差异。
2. 折线图：折线图是一种用于显示数据趋势和变化的图表类型。
在数据透析表中，可以使用折线图来展示不同时间点或时间段的数据变化情况。
通过将不同时间点或时间段的数据值连接成线条，可以清晰地展示数据的变化趋势和差异。
折线图可以凸显出数据的波动性和趋势性，对于分析数据的变化趋势和特点非常有帮助。
3. 饼图：饼图是一种常见的用于表示各部分占比的图表类型。
在数据透析表中，可以使用饼图来展示不同部分或部门之间的差异。
通过将不同部分的数值绘制成饼状图，并分别标注出每个部分所占的百分比，可以直观地看出不同部分之间的差异情况。
饼图可以帮助我们更好地理解和比较各个部门或部分的相对大小和重要性。
4. 热力图：热力图是一种用于显示密度和区域分布的图表类型。
在数据透析表中，可以使用热力图来展示不同维度或指标之间的差异分布情况。
通过在矩阵中使用不同颜色来表示不同数值的大小，可以直观地展示数据的密度和差异。
热力图可以用于比较不同维度或指标之间的差异，也可以用于比较不同时间点或时间段的差异。
5. 散点图：散点图是一种用于显示不同数据之间关联性的图表类型。
在数据透析表中，可以使用散点图展示不同维度或指标之间的差异关系。
通过将不同维度或指标的数值绘制成散点，并根据不同数值的大小和分布情况进行标记，可以直观地反映出数据之间的关联性和差异。
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荧光差异显示系统
主要内容
一、差异显示的基本原理 二、差异显示方法的建立及条件优化 三、差异显示的主要步骤 四、差异显示的优点和缺点 五、差异显示技术的改进 六、基因差异在表达中的应用 七、差异显示技术的展望
一、差异显示的基本原理
简述：是利用一系列的oligo(dT)引物，逆
转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过 PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开， 筛选出目的基因。
。
(5)找出不同处理间差异显示的条带 从胶 上切割下来，并回收； (6)克隆差异片差异片段可作为探针； (7)Northern 杂交验证目的片段，去掉假 阳性片段； (8)对目的片段进行测序； (9)以克隆的目的片段为探针 从基因组文 库中筛选出相应的全长基因
实例分析：
1.目的 研究大鼠皮肤肌肉特异性基因的表达,探讨引物的 不同、退火温度变化与扩增产物特异性之间的关系。 2.方法 12 只健康雄性Sprague2Dawley 大鼠分为正常对照 组与实验组(挫伤4 h) 。分别提取总RNA ,反转录成cDNA ,通 过不同引物、退火温度及反应体系进行PCR 产物扩增,比较 不同条件下差异条带的情况。 结果 总RNA 量在2 - 4μg 时,扩增条带最亮;提高反转录温度有利于长片段cDNA 的合 成;使用TaKaRa 公司带有T7 启动子的Oli go dT12 NM 和M13 的随机引物时,可最大限度地减少非特异性条带;先使用低严 谨的退火温度,再使用高严谨的退火温度可显著地增强差异 条带重复性和敏感性。
只要有足够的引物，那么任意细胞里的任意一个 mRNA 分子都可以被探测到。而mRNA 差异显示技 术和RAP-PCR 技术根本的区别在于其实行mRNA 逆 转录时所采用的方法不同：在RAP-PCR中采用的只 是随机的寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，而mRNA 差异显示技术则是根据成熟的mRNA 3′端具有80～
200 bp 的起保护作用的poly（A）尾这一特性，以 一系列oligo（dT）12MN（N 代表A、C、T、G 4 种 碱基中的一种，M 为A、C、G）引物中的一种锚定 于一个亚群的mRNA 上，来获得cDNA。
同时，PCR 反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳和测序
等分子生物学的基本技术也被结合到了差异显 示技术中来。mRNA 差异显示技术过程用一种 oligo（dT）12MN 的引物逆转录真核细胞中表 达的mRNA，可获得1/12 的cDNA，同时设计5′ 端一组随机引物，通过PCR 扩增，进行聚丙烯
用说明书: 在0. 2 ml 单位的EP 管中配制下列混合液。①模 板总RNA 2 - 3μg、锚定引物( 10 mmol/ L ) 5 μl 、dNTP
Mixture ( 10mmol/ L) 1μl 、RNase f ree dH2O 加到10μl 。 ②65 ℃保温5 min 后迅速在冰上急冷2 min 以上。③离心数 秒钟使模板RNA 与引物的混合液聚集于EP 管底部。④在上述的
3.实验方法
（1）. 动物分组及模型制作 健康成年 Sprague2Dawley 大鼠随机分为实验组( n = 6) 和正常对照组( n = 6) 。①实验组用2 %戊巴比 妥钠按30 mg/ kg剂量腹腔注射,常规手术消毒 后,用250 g 重力锤在150 cm 高度自由落下,造 成右后肢股四头肌处皮肤、肌肉挫伤,于挫伤 后4 h 将大鼠脱颈处死,于挫伤处取1. 5 cm ×1. 5 cm 皮肤肌肉组织[3] 。②正常对照组,将大 鼠直接脱颈椎处死后取与挫伤大鼠相同部位 皮肤组织作为对照。
EP 管中配制下列反转录反应液⑤根据锚定引物的不同,设计不 同的反转录温度。⑥70 ℃保温15 min 后冰上冷却,得到的cDNA 溶液可直接 用于PCR 扩增。
4.实验结果
结果1 总RNA 的质量 总RNA 28S、18S 条 带比较亮,5S 条带较弱;28S 条带宽度是18S 条 带宽度的2倍。
二、差异显示方法的建立及条件优化
基因的差异性表达不仅是细胞形态和功能多 样性的根本原因,而且也是各种生理、病理及 损伤过程的物质基础。因此,分离、鉴定差异 表达的基因具有重要的意义。真核生物基因组 中,仅约有10 %- 15 %的基因在细胞中表达,而且 不同发育阶段、不同理状态和不同类型的细胞 中表达的基因也不尽相同。
( 2). 总RNA 的提取
Invitrogen TRIzol Reagent试剂说明书提取步骤 对皮肤和肌肉总RNA 进行提取,用DNase Ⅰ消 化提取的RNA 样品。
(3) 反转录差异显示聚合酶链式反应扩增差异 特异性片段 参照逆转录PrimeScriptTMRe2verseTranscriptase使
mRNA 差异显示技术是在转录水平上研究基 因表达差异的有效方法,其通过一系列的锚定 引物与随机引物组合把不同种细胞的mRNA 进行分组逆转录及PCR 扩增,在相邻泳道上显 示扩增结果,通过比较电泳图谱找出差异,对各
种不同类型、不同分化时期以及异常细胞差 异表达基因进行分离和比较,具有简单、快速、
酰胺凝胶电泳比较。最后将有差异的基因片段 从凝胶上切割下来，用相同的锚定引物和随机 引物对分离的片段进行二次扩增，得到差异片 段后将该片段克隆、鉴定分析、测序，并同基 因库的序列进行同源性比较或者将差异显示的 DNA 克隆测序后作为探针，进行斑点杂交和反 向Northern 印迹杂交，确定是否是真阳性结果物的改进、 退火温度变化与扩增产物特异性之间的关系, 将有助于发现新的特异性基因的表达。
三、差异显示的主要步骤
(1)提取 总RNA 不能有DNA污染，一般用无RNA酶的 DNA酶处理 (2)在逆转录酶作用下 以Oligo T11MN 为引物,(M为 G、A、C中的任一种，N为A、C、G、T任一种)，进 行逆转录 ； (3)PCR反应扩增cDNA的第一条链 ； (4)扩增后的cDNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 使差异 表达的cDNA片段在6%测序胶上分开 ；