mRNA差别显示技术
mRNA差异显示技术概述
抑 制有 关 的基 因鉴定 与克 隆 中 ，这种 方法 称 为差异
显 示 反转 录聚合 酶链 式反 应 （ Ｄ Ｔ Ｐ Ｒ） Ｄ Ｒ —Ｃ 。
１ ｍＲ ＮＡ差 异显 示技术 的原 理
ｍ Ｎ 差异 显 示技 术 和 Ｒ Ａ 随机 引 物 聚合 酶 Ｒ Ａ Ｎ
链 式 反 应 （ Ａ — Ｃ 都 是 基 于 这 样 一 种 假设 ：只 Ｒ Ｐ Ｐ Ｒ）
中采用的只是随机的寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物， 而 ｍ Ｎ 差 异显 示 技 术 则是 根 据成 熟 的 ｍＲ Ａ ３ Ｒ Ａ Ｎ
端具 有 ８ ～ ０ ｐ的起保 护 作 用 的 ｐｌ（ 尾 巴这 ０ ２０ｂ ｏｙＡ）
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床 麻 醉 学 杂 志 ， ０ ０ １ （Ｏ ： ０ — ０ ． ２０ 。 ６ １ ） ５３ ５ ５
［１ 王先远， 兰兴 ． 氨酸对烧伤大 鼠细胞因子的影 响ｆ． １】 高 精 Ｊ 营养 ］
学 报 ，１９ ， ８ ４ ： ９ — ９ ． ９６ １（）３２３７
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人类 基 因组协 会公 布 的最新 数据表 明 ，人类 和 其他 高 等 生 物基 因组 可 能包 含 约 ３ ０ ００ ０蛋 白编 码 基 因 ，其 中 仅 约 １ ％被 认 为 是 在 不 同发 育 阶 段 、 ５
ddRT-PCR(差示反转录PCR) PCR实验技术
ddRT-PCR(差示反转录PCR,又mRNA差别显示技术) mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）简称为ddRT-PCR。
它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。
目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。
差别基因表达（differential gene express）是细胞分化的基础。
mRNA 差别显示技术正是对组织特异性表达的基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。
该方法的基本原理是首先选取不同的组织样品或不同发育阶段的同一组织样品或同一组织样品经不同药物处理诱导的样品，经总RNA提取后，进行mRNA反转录合成cDNA。
此cDNA的合成是采用Oligo（dT）12 MN为引物，其中M为A，C，G中的任意一种，N为A，C，G或T中的任意一种，所以共有12种oligo（dT）12 MN引物，其中M称为锚定碱基，起增大引物Tm值的作用，N称为分类碱基，对反转录进行分类。
用这12种引物分别对同一总RNA 样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，从而使反转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类（目前较为流行的方法是进行4种归类，即M为简并碱基的形式存在），在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和反转录引物PCR扩增，通过对组织样品的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物凝胶电泳分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上组织特异性的表达。
如此众多种类的mRNA反转录产物经PCR选择扩增后其类型依然为数众多，很难用电泳系统加以快速准确地分离。
因而需要对反转录产物cDNA进行归类处理，减轻不同PCR产物电泳分离的难度，提高分离的准确率。
（见示意图）一、实验流程：。
荧光标记mRNA差异显示技术
荧光标记mRNA差异显示技术mRNA差异显示技术（differential display，DD）是用于研究基因的差异表达的新方法。
该技术自1992年被首次报道后，即以其不可替代的优势被广泛应用于生物医学领域。
在应用过程中不断得到改进，并产生了诸多衍生技术如RPA（RNA finger printing by arbitrarily primed PCR）、GDD （genomic DD）等。
本文简要介绍在本试验室荧光标记差异显示技术（fluorescent DD，FDD）的应用及体会。
1.材料与方法1.1 标本人单核细胞系U937，细胞密度2×108/L，分对照组（N）、处理Ⅰ组（T1）、处理Ⅱ组（T 2），N用1640培养基及10%胎牛血清培养，T1用IF N-γ104U/L LPS 1μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0μg/L分别刺激7h.1.2 主要试剂与仪器TRIzol试剂（GIBCO BRL）、Fluoro DD试剂盒（Genomyx）、Supersript Ⅱ逆转录酶（GIBCO BRL）、Ampli Taq DNA聚合酶（GIBCO BRL）、RNase-free DNaseI（Promega）；Genomyx LR 、 Genomyx SC、DNAT hermal Cycler（Perkin Elmer）1.3 总RNA的制备按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总RNA,以RNase-free DNase I（终浓度80 000 U/L）除去其中污染的 DNA,经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检测其纯度1.4 mRNA差异显示1.4.1 逆转录反应选择锚定引物[T7（dT12）AP(anchored prime rs，AP)]，序列为5'ACGACTCACT ATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3'，其中M=A/G/C。
mRNA差异显示技术解读
八.DDRT-PCR的技术改进
针对以上不足,特别是假阳性率高的缺点，从以下几个方面 做了大量改进：
引物设计 反应条件的优化 显示方法 假阳性鉴定
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引物设计
mol等将12种锚定引物变为4种，并发现G的扩增 效果最好
王夏等在T12MN之前加上了一段T7启动子序列， 提高了PCR反应的严谨性 Liang发现9~10个mer长度的随机引物比较适宜
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三、mRNA差异显示技术的原理：
mRNA差异显示技术的主要原理是利用 cDNA反转录技术,PCR扩增和高分辨率聚丙 烯酰胺凝胶电泳技术，来显示PCR产物的差 异。其中，反转录技术中使用了一系列能与 mRNA的Poly（A）尾巴相结合的锚定寡聚 脱氧核苷酸引物OligoT12MN。锚定引物与 mRNA的Poly（A）+的两个碱基，在反转录 酶的作用下可以启动mRNA群体反转录。
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mRNA差异显示技术简略流程图
六. DDRT-PCR的优点
以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础 灵敏度高，仅需0.2μg的总RNA 可以同时比较多个样品间基因表达的 差异 可以同时检测到“上调”及“下调” 的基因 时间短，实验过程中可步步验证比较 可进行多基因家族的表达分析
主要用于医学研究的癌症、神经、 骨科、病理、生殖等领域 动植物遗传、育种，动物营养及微 生物等领域
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五. DDRT-PCR一般操作步骤
总RNA的提取与反转录 RT-PCR
聚丙烯酰胺凝胶电泳及差异DNA条带的回收
PCR在扩增及其产物的回收
测序和数据库比对分析
实时定量PCR
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mRNA差别显示技术
mRNA差别显示技术mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）简称为ddRT-PCR。
标本检测，你提供标本，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。
目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。
差别基因表达（differential gene express）是细胞分化的基础。
基金论文，你提供实验材料，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268一、mRNA差别显示技术正是对组织特异性表达的基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。
该方法的基本原理是首先选取不同的组织样品或不同发育阶段的同一组织样品或同一组织样品经不同药物处理诱导的样品，经总RNA提取后，Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送进行mRNA反转录合成cDNA。
此cDNA的合成是采用Oligo（dT）12 MN为引物，其中M为A，C，G中的任意一种，N为A，C，G或T中的任意一种，所以共有12种oligo（dT）12 MN 引物，其中M称为锚定碱基，起增大引物Tm值的作用，N称为分类碱基，对反转录进行分类。
Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，从而使反转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类（目前较为流行的方法是进行4种归类，即M为简并碱基的形式存在），在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和反转录引物PCR扩增，通过对组织样品的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物凝胶电泳分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上组织特异性的表达。
如此众多种类的mRNA反转录产物经PCR选择扩增后其类型依然为数众多，很难用电泳系统加以快速准确地分离Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费基因慢病毒包装。
mRNA差别显示技术[DDRT-PCR]
![mRNA差别显示技术[DDRT-PCR]](https://img.taocdn.com/s3/m/52d5e58a1711cc7930b716b2.png)
mRNA差别显示技术[DDRT-PCR]随着PCR技术的发展，人们在此基础上建立起了一系列基于基因分离的新技术新方法。
如mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、以及进一步改进的代表性差示分析（RA D），抑制性扣除杂交（SSH）和交互扣除RNA差别显示技术（RSDD）。
差别显示ＰＣＲ是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的 mRNA反转录成cDNA。
该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5’-T11MN；同时为扩增出polyA 上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。
这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的 DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。
差别显示技术自1992年建立后，一直在不断进行着改进。
如在1994年，Ito等对3′端锚定引物的设计由固定两个碱基变为一个碱基固定的引物，这就使原来12种引物减至3种即可(5′Ｔ12Ｇ，5′Ｔ12Ａ，5′Ｔ12Ｃ)，这样做减少了每个mRNA样品对逆转录反应种类的需要，并且把由于简并性引起的某些ＲＮＡ的代表性差和RNA数量过多现象降低到最低程度；在随后的两年中，研究人员有在3′端引物和5′随机引物末端分别加上了限制性内切酶识别位点 (如Hind III酶切位点)，使得5′端引物条数改为8条，长度为13bp，而3′端引物则由18个碱基组成。
这样形成的24种引物对，经计算机同源性分析表明同样能覆盖全部mRNA，使实验简化，同时由于引物变长，使cDNA扩增更为有效。
有的实验室采用把Bakman公司的kit，其引物5′端为26bp，3′ 端为31bp，并加上了T3和T7两端的测序引物，由仪器切割差异条带后，再次扩增，并通过荧光标记，用计算机统计出结果。
mRNA差异显示技术解读
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显示方法
最初DDRT-PCR通过放射性同位素在变性胶上进行放射自显 影成像
Sanguinetti介绍了一个快速银染方法，只 需15分钟，而且容易克隆回收 Rompf等通过琼脂糖凝胶电泳分辨差异 cDNA片段 余桂华等建立了荧光mRNA差异显示方法， 最大限度地降低了假阳性
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3‘
3‘ 5’
M N TTTTTTTTTTTT 5’ 不同长度的 dNTP、Taq聚合酶 延长 PCR产物 M N TTTTTTTTTTTT 5’ M’N’AAAAAAAAAAA 3’ 变性、退火、延伸 电泳 显示 回收差异条带，再扩增 ，克隆测序，同源比对
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四.DDRT-PCR目前的应用领域
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mRNA差别显示技术及其在茶树基因研究中的应用
生 物 的 发育 与分 化 、细 胞 的周期 变化 、生 物体 对 外
（ Ａ）尾 巴 。在这 段 Ｐ ｌ（ ） ｏ ｙ Ａ 序列 起 点碱 基之 前 （ 即５ 亦
界环 境 压 力的 反应 ， 以及个 体 的衰 老 与 死亡 等所 有 的 生
命 过 程 ，都 可 归 结 于 基 因 的 差 别 表 达 。 不 仅 如 此 ，就 连
５ 一 ，ＭＮ或 ５ 一 ＭＮ通 式 表 示 ， 其 中 Ｍ为 Ａ、 Ｇ、 Ｃ Ｔ Ｔ。
正 常 的代 谢 过 程 的变化 或 病 理 的变 化 ，不 管 它是 由单 基 因控 制 的 ，还是 有 多基 因控 制 的 ，本质 上 也 都是 由于基
因表 达 的改 变造 成 的 。 因此 分 离 、 鉴 定 差 别 表达 的 基
乎 所 有 的 真 核 基 因 ｍ ＲＮＡ分 子 的 ３ 末端 都 带 有 Ｐ Ｉ ０Ｙ
Ｄ２
技 术 具 有 如 下诸 方 面 的优 点 ：① 可 以 同 时 比较 多个 样
综 述
品 间 基 因表 达 的差 异 ；② 可 以 同 时 检 测 到 “ 游 ” 及 上
“ 游 ”基 因 ；③ 检 测 灵 敏 度 高 ，所 需 样 品 少 ，经 过 下
显 示 差别 表 达 的Ｃ ＤＮＡ片段 。从 理 论 上讲 ，用 １ 种３ 锚 ２
ｍＲ ＮＡ差别 显示 技 术 已在 分 离克 隆 发 育相 关 基 因 、抗逆
基 因 、 调 控 基 因 和 突 变 基 因 等 方 面 得 到 广 泛 的 应 用
【－ ２引
。
定 引物 和 ２ 种 ５ 端 随 机 引物 组 成 的全 部 ２ ０组 引 物对 ０ ４
Ｐ 扩 增 ，就 能产 生 出２ ， ０ ０ ＣＲ ０ ０ 条左 右 的Ｃ Ａ条带 。其 ＤＮ
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mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）
随着PCR技术的发展，人们在此基础上建立起了一系列基于基因分离的新技术新方法。
如mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、以及进一步改进的代表性差示分析（RAD），抑制性扣除杂交（SSH）和交互扣除RNA差别显示技术（RSDD）。
差别显示ＰＣＲ是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。
该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5’-T11MN；同时为扩增出polyA 上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。
这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。
差别显示技术自1992年建立后，一直在不断进行着改进。
如在1994年，Ito等对3′端锚定引物的设计由固定两个碱基变为一个碱基固定的引物，这就使原来12种引物减至3种即可(5′Ｔ12Ｇ，5′Ｔ12Ａ，5′Ｔ12Ｃ)，这样做减少了每个mRNA样品对逆转录反应种类的需要，并且把由于简并性引起的某些ＲＮＡ的代表性差和RNA数量过多现象降低到最低程度；在随后的两年中，研究人员有在3′端引物和5′随机引物末端分别加上了限制性内切酶识别位点(如Hind III酶切位点)，使得5′端引物条数改为8条，长度为13bp，而3′端引物则由18个碱基组成。
这样形成的24种引物对，经计算机同源性分析表明同样能覆盖全部mRNA，使实验简化，同时由于引物变长，使cDNA扩增更为有效。
有的实验室采用把Bakman 公司的kit，其引物5′端为26bp，3′端为31bp，并加上了T3和T7两端的测序引物，由仪器切割差异条带后，再次扩增，并通过荧光标记，用计算机统计出结果。
此外，许多学者针对该技术在****作中假阳性高等问题，还从设计对照、提取胞质RNA、更换放射性标记物以及改变PCR反应条件等等方面提出了相应解决方案，以求这一技术得到进一步完善。
DD-PCR与示差筛选、扣除杂交相比,具有很多优点:
1)速度快,较易操作;
2)由于PCR扩增技术的应用,使得低丰度mRNA的鉴定成为可能,且灵敏度高;
3)可同时比较两种以上不同来源的mRNA样品间基因表达的差异。
尽管差别显示技术有以上诸多方面的优点,但在实际操作中仍存在一些问题,主要表现在: 1)出现差别条带太多,假阳性率高达70%左右,重复性差,且对高拷贝数的mRNA具很强的倾向性;
2)扩增条带分子长度较短,一般在110～450bp之间。