荧光标记mRNA差异显示技术

荧光标记mRNA差异显示技术mRNA差异显示技术（differential display，DD）是用于研究基因的差异表达的新方法。

该技术自1992年被首次报道后，即以其不可替代的优势被广泛应用于生物医学领域。

在应用过程中不断得到改进，并产生了诸多衍生技术如RPA（RNA finger printing by arbitrarily primed PCR）、GDD （genomic DD）等。

本文简要介绍在本试验室荧光标记差异显示技术（fluorescent DD，FDD）的应用及体会。

1.材料与方法1.1 标本人单核细胞系U937，细胞密度2×108/L，分对照组（N）、处理Ⅰ组（T1）、处理Ⅱ组（T 2），N用1640培养基及10%胎牛血清培养，T1用IF N-γ104U/L LPS 1μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0μg/L分别刺激7h.1.2 主要试剂与仪器TRIzol试剂（GIBCO BRL）、Fluoro DD试剂盒（Genomyx）、Supersript Ⅱ逆转录酶（GIBCO BRL）、Ampli Taq DNA聚合酶（GIBCO BRL）、RNase-free DNaseI（Promega）；Genomyx LR 、 Genomyx SC、DNAT hermal Cycler（Perkin Elmer）1.3 总RNA的制备按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总RNA,以RNase-free DNase I（终浓度80 000 U/L）除去其中污染的 DNA,经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检测其纯度1.4 mRNA差异显示1.4.1 逆转录反应选择锚定引物[T7（dT12）AP(anchored prime rs，AP)]，序列为5'ACGACTCACT ATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3'，其中M=A/G/C。

N=A /G/C/T],以总RNA为模板进行逆转录反应，每管反应体系如下：总RNA l.0μg，AP 4 pmol ，70℃5 min，加入50 mmol/L Tris-HCl（pH8.3），75 mmo l/L KCl，3 mmol/L MgCl2，10mmol /L DTT，25μmol/L，dNT Pmix（1∶1∶1∶1），SuperScriptⅡ 60 Units，总反应体系20 μl ，42℃5 min，5 0℃50 min，70℃15 min。

1.4.2 荧光标记差异显示P CR选取与逆转录引物序列相同的带荧光物质标记的锚定引物[TMR-T7(dT12)AP]，随机引物（5'ACAATTTCACACAGGAACGCT AGTT G 3'），以逆转录产物为模板，进行PCR反应。

反应体系包括：20 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），50 mmol/L KCl,3.75 mmol/L MgCl2，逆转录产物3.0 μl，50 μ mol/L dNT P mi x（1∶1∶1），0.35 μmo l/L 5'-随机引物，0.35 μmol/L 3-锚定引物，Ampli Taq 0.5 U nits，总反应体系10 μl。

反应步骤如下：95℃2 min；94℃15 s，50℃ 30 s，72℃2 min，4个循环； 94℃15 s，60℃30 s，72℃ 2 min，个循环；72℃延伸7 min。

1.4.3 分离差异显示片段配制5.6%变性聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.2 5 mm，大小61×33 cm。

将PCR产物加4.0μl上样缓冲液，95℃变性后上样。

3000V、100W 、55℃电泳4.5 h。

干胶后置于Genomyx SC扫描，用系统所带的AcquireSC program软件分析处理扫描结果。

1.4.4 回收差异条带用AcquireSC软件将差异条带定位，用一次性手术刀片切割下所需条带，置于30μl去离子水中，37℃水浴30-60 min，备用。

1.4.5 差异条带的再扩增以经上述处理的回收条带为模板，T7启动子22-mer（5'GT AATACGACTCACTAT AGGGC3’）、反M13（-48）24-mer（5'AGCGGATAACAATTTC ACACA GGA3'）为引物，进行再扩增反应：模板2.0μl，20 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2,20 μmol/L dNT P mix（1∶1∶1∶1），0.2 μmol/L T7、0 .2 μmol/L M13-r、AmpliTaq 1.0 U nits，总反应体系20 μl.反应条件同差异显示PCR。

2.结果2.1 总RNA的质量总RNA经Dnase I处理，用1.0%甲醛变性凝胶电泳，可见清楚的28 S、18 S、5 S条带，且28 S/18 S约为2∶1（图1），表明RNA完整性好，无降解现象。

N、T1、T2的OD260/OD28 0比值分别为1.92、1.83、1.98，表明样品纯度高。

Fig.1 Result of total RNA on formaldehyde-agarosegel2.2 荧光标记mRNA差异显示结果显示每一泳道均有约50条大小不等的扩增产物，各组间比较见较多呈有无或强弱变化的差异条带，图2中箭头所示。

Fig.2 Analysis of gene expression of cells treated with IFN and LPS by differential display technique2.3 差异条带再扩增取T2中约1.25Kb的条带再扩增，结果见图3.Fig.3 Reamplification result of differ entially expressedband DNA marker is 200 bp ladder （200 bp~2 kb），1.0kb is arro wed3. 讨论基因表达是调节细胞生物学行为的核心。

探讨处于不同生理、病理状态下的有机体之间的未知表达基因的差异，是研究生命本质的有效途径。

199 2年报道的真核细胞mRNA差异显示技术，为检测未知的表达基因提供了一种新的途径。

DD技术具有快速、敏感、可同时检测两组或以上的组织或细胞、RNA用量少、可检测某一表达基因的有无或其表达的强弱等优点，一经问世即受到许多领域的重视并得以广泛应用。

然而，该技术也存在着一些缺陷，主要表现为：cDNA产物的质量较低，在序列胶中往往呈不清晰状态；所得的cDNA片段通常小于500nt，往往是3'-端的非翻译（编码）序列；所得差异片段的假阳性高，可高达85%等。

荧光标记差异显示技术通过对引物设计、PCR条件、凝胶、电泳条件以及标记物的改进，极大减少了上述不足。

差异显示的锚定引物有单碱基锚定引物、简并或非简并的双碱基锚定引物等多种类型，本实验通过使用双碱基锚定引物，将总mRNA群体分为12个亚群，这极大减小了每一锚定引物产生的第一条cDNA链的数量，不仅可降低随机引物的用量，更可降低DD产物的复杂性，使差示条带在序列胶上易于分辨，从而传统方法中常见的“重叠带”现象减少。

DD专用的随机引物的特点为A+T与G+C含量近乎相等，且3'-端以G或C结尾，可增加DD扩增的效率。

通过改变RT-PCR反应条件如底物浓度、延伸时间等，差异片段的长度可达1.0-1.5 kb（图2），因较长的cDNA片段容易通过Northern blot 进行分析鉴定辨别真假阳性克隆，且其中可提供更多的序列信息，故获取大的片段具有重要的意义。

文献认为差异显示居高不下的假阳性率实际上因再扩增所致。

通常，再扩增的引物与DD引物相同，本试验将再扩增引物设计为T7（22-mer）与M13-r（24-mer），此为在锚定引物的5' 端和随机引物的3' 端分别增加的序列（本文方法中所列差异显示引物序列的划线部分），这两种来源于原核生物的引物尽可能降低了在真核mRNA序列中非特异性扩增的机会。

同时，T7启动子序列可直接用于体外转录合成cRNA探针，为cDNA片段的直接测序和鉴定（RPA或Northern分析）提供了方便。

用常规的序列分析胶进行分辨时，较长的cDNA片段往往挤在胶的上端而影响分辨率。

本操作改用5.6%的PAGE胶（聚丙烯酰胺），减少胶的厚度（仅250μm），通过提高电泳的电压（3000 V）及温度（55℃），可显着提高分辨率。

同位素标记存在曝光时间长、带型不佳，基本与相邻的带混合、污染等缺点，将荧光物质标记于锚定引物的5’端，可产生清晰、明亮、低背景的分辨效果，操作周期仅两天。

目前，DD技术己被广泛应用于与疾病、衰老、生殖、生长发育、分化等生理、病理过程相关的未知表达基因的研究，相信对揭示生物界基因表达调控的奥秘将起重要的作用。

1.4.5 差异条带的再扩增以经上述处理的回收条带为模板，T7启动子22-mer（5'GT AATACGACTCACTAT AGGGC3’）、反M13（-48）24-mer（5'AGCGGATAACAATTTC ACACA GGA3'）为引物，进行再扩增反应：模板2.0μl，20 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，20 μmol/L dNT P mix（1∶1∶1∶1），0.2 μmol/L T7、0 .2 μmol/L M13-r，AmpliTaq 1.0 Units，总反应体系20μl。

反应条件同差异显示PCR。

2. 结果2.1 总RNA的质量总RNA经Dnase Ⅰ处理，用1.0%甲醛变性凝胶电泳，可见清楚的28 S、18 S、5 S条带,且28 S/18 S约为2∶1（图1），表明RNA完整性好，无降解现象。

N、T1、T2的OD260/OD280比值分别为1.92、1.83、1.98，表明样品纯度高。

Fig.1 Result of total RNA on formaldehyde-agarosegel2.2 荧光标记mRNA差异显示结果显示每一泳道均有约50条大小不等的扩增产物，各组间比较见较多呈有无或强弱变化的差异条带，图2中箭头所示。

Fig.2 Analysis of gene expression of cells treated with IFN and LPS by differential display technique2.3 差异条带再扩增取T2中约1.25Kb的条带再扩增，结果见图3。