什么是荧光定量(转)
荧光定量PCR基础知识
内参-校准生物学误差
• 内参用于校准实验过程对定量结果的影响核酸提取时通常以重量或体积 为单位取样，再加上提取效率和操作误差，造成等量提取物不一定来源 于等量细胞（或基因组）
1. 用DNase酶处理样本 2. 检测no-RT对照（不进
行逆转录的样本）
+RT 和–RT 应该至少 相差6-7 Cts
(大约1% 信号由DNA 产生).
+RT -RT
4 阳性对照-监控系统故障
• 内参(管家基因) – 标准品线性范围 – 灵敏度 – 扩增效率
• 外源阳性内对照 – 来源PCR产物 – 质粒 – 阳性样本
3’端的前4个碱基不能有3个以上的G
避免重复序列：避免序列中4个以上的G或连续6个A
选择C比G多的链当探针
5‘端第一个碱基不能为G，如为FAM，则第二个碱 基 也 不 能 是 G。5" 端染料最好连接在T或C碱基上 。
Primer PCR产物大小建议50-150bp
Tm值:58-60℃ Primer长度： 20bp
RNA降解（小量等份分装）
两步法
• 先将RNA逆转录成cDNAs
• 将cDNAs 1:2 – 1:10 稀释
• 加入反应板中，实时扩增 cDNA，或-20º C储存（稳定保 存数周）
– 优势：cDNA远比RNA稳定， 可以反复冻融多次
– 不足：和一步法相比，需要更 多的加样步骤
预扩增
传统的基因表达分析
• 原始光谱视图（Raw Date ） : 显示PCR反应中荧光信号的软件视图 • 背景组分: 仪器基座的背景“噪音”。
背景噪音影响反应的灵敏度。 背景读数存储于计算机并被反应的荧光信号扣除
纯荧光校正
荧光定量PCR技术简介
荧光定量PCR技术简介荧光定量PCR技术简介常规PCR中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对PCR扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA的精确copy数等，如此，荧光定量PCR技术便应运而生。
1、荧光定量PCR概念所谓定量PCR技术（real-time PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法（如下图）。
2、荧光定量PCR与普通PCR的主要区别理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。
这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR 要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。
当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。
由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。
所以，即使是96次PCR重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异（如下图），所以在实验过程中我们不能根据最终PCR产物的量直接计算出起始DNA拷贝数。
2.jpg而从上图我们也可以看出，虽然相同模版在同一台PCR仪上进行96次扩增，终点处检测产物量不恒定，但96次PCR扩增曲线都有一个共同的拐点，而且拐点极具重现性，为荧光定量PCR技术的应用提供了理论基础。
3、几个基本概念为了使大家更好的理解、掌握荧光定量PCR技术，接下来有必要向大家介绍几个最基本的概念。
3.1扩增曲线为了更好的理解荧光定量PCR原理，我将用样品扩增曲线来进行说明。
描述PCR动态进程的曲线即扩增曲线。
前面我们也了解到，PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S型曲线(如下图)从上图我们可以很直观的看出，荧光定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。
荧光PCR定量质量控制及防污染措施
荧光PCR定量质量控制及防污染措施解放军第三0⼆医院王海滨写在课前的话近⼏年在临床检测病毒核酸和细菌核酸上，荧光定量PCR技术越来越⼴泛。
但是如何进⾏治疗控制以及出现污染后怎样进⾏清除污染？本⽂主要讲述怎样来防⽌污染的产⽣。
⼀、荧光PCR定量的概述（⼀）荧光PCR定量的原理实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加⼊荧光基团，利⽤荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进⾏定量分析的⽅法。
常规的PCR也就是电泳PCR，它是合成⼀个正向引物和反向引物为⽬的模板，即DNA或RNA作为⼀个模板扩增，扩增后通过跑电泳的⽅式来检测它存在与否，是相对量的变化。
由于跑电泳经常导致产物外泄，因此污染的⼏率⽐较⾼。
近⼏年 PCR 扩增时在参⼊⼀对引物的同时参⼊单个特异性的荧光探针，该探针为⼀寡核苷酸，两端分别标记单个报告荧光基团和单个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时， Taq 酶的5'端～3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从⽽荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增⼀条 DNA 链，就有单个荧光分⼦构成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物构成完全同步。
通过荧光物质参⼊和TapMan探针技术来做实时荧光PCR,避免了电泳检测结果的过程,使整个PCR过程从扩增到检测都在⼀个封闭的状态。
荧光集团⽬前临床常⽤的有两个，⼀个是SYBR green，⼀个是TapMan探针。
SYBR green是⼀类荧光染料，能与所有的 DNA 双链相结合，对 DNA 模板没有选择性，所以特异性不如 TaqMan 探针。
变性后双螺旋变成单链，然后作为扩增的模板。
在扩增的过程中由变性到负性扩出了另⼀条链和模板DNA进⾏退⽕变成双链。
这时SYBR green染料与 DNA 双链结合,发出荧光信号。
⽤SYBR green荧光染料来作为指⽰剂时，中间要加⼀个溶解曲线来证实它的特异性的问题。
荧光定量PCR的原理方法及结果分析
荧光定量PCR的原理方法及结果分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的检测DNA或RNA含量的方法，通过测定荧光信号的强度来确定起始模板数量的多少。
其原理主要包括引物的选择、PCR反应的进行、荧光信号的测定以及数据分析等步骤。
首先，荧光定量PCR需要选择适当的引物。
引物的设计要求首先能够特异性地与目标序列结合，这样才能保证只有起始模板被扩增。
引物的长度通常在18-24个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，碱基序列中不能存在太多的重复序列或者分子倒序等结构。
此外，引物的Tm值应该相近，不应过于接近，以免引物发生二次结合。
另外，荧光标记的引物通常采用双探针（dual-labeled probe）和SYBR Green I染料，二者的优缺点各有不同：双探针对应用的目标突变不敏感，但是对于长序列的目标扩增效果较好；SYBR Green I适用于鉴定多个不同基因的扩增，但是对于PCR产物的目标特异性检测较差。
其次，PCR反应的进行是荧光定量PCR的核心步骤。
反应体系通常包括引物、模板DNA、DNA聚合酶、荧光标记剂和反应缓冲液。
PCR反应过程中，首先是变性，将模板DNA的双链分离；然后是退火，使引物与目标序列结合；接着是延伸，DNA聚合酶在适当的温度下进行链延伸。
PCR反应的循环数通常在25-40之间，具体循环数多少需要根据目标序列的长度和浓度来决定。
PCR反应条件的优化要注意引物浓度、PCR温度和时间。
第三，荧光信号的测定是荧光定量PCR中不可或缺的步骤。
通常，荧光信号的测定可以通过荧光实时扩增仪来进行。
在每一个PCR循环过程中，荧光实时扩增仪会记录下PCR反应管中荧光信号的强度。
随着PCR反应的进行，PCR产物的数量也在逐渐增加，荧光信号的强度也会增加。
荧光信号的强度与PCR产物的数量之间存在着一定的线性关系，利用标准曲线可以将荧光信号的强度转化为起始模板的绝对数量。
荧光定量pcr的原理
荧光定量pcr的原理荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测DNA的技术，它结合了PCR和荧光探针技术，可以快速、高效地定量检测DNA样本。
荧光定量PCR的原理主要包括PCR扩增、荧光信号检测和数据分析三个部分。
首先，PCR扩增是荧光定量PCR的基础。
PCR是一种体外扩增DNA的技术，通过反复的热循环使得DNA序列得以扩增。
在荧光定量PCR中，扩增反应中加入了荧光标记的引物和探针，当PCR反应进行到特定的温度时，探针与目标DNA结合，导致荧光信号的释放。
PCR扩增的循环次数越多，荧光信号累积的越多，从而可以定量检测目标DNA的含量。
其次，荧光信号检测是荧光定量PCR的关键步骤。
在PCR扩增过程中，荧光信号会随着DNA的扩增而不断累积。
荧光信号的检测可以通过实时荧光定量PCR仪器来完成，这些仪器可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号强度，并将其转化为荧光信号曲线。
通过监测荧光信号曲线的变化，可以准确地测定目标DNA的含量。
最后，数据分析是荧光定量PCR的最后一步。
通过实时荧光定量PCR仪器获取的荧光信号曲线，可以通过计算机软件进行数据分析。
软件可以根据标准曲线和样本曲线的荧光信号强度来计算目标DNA的含量，从而实现对目标DNA的定量检测。
总的来说，荧光定量PCR的原理是通过PCR扩增、荧光信号检测和数据分析三个步骤来实现对目标DNA的定量检测。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，被广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变分析等领域。
希望通过本文的介绍，读者能够对荧光定量PCR的原理有一个清晰的了解，并能够在实验中正确应用这一技术。
荧光定量
荧光定量PCR应用
01
绝对定量分析
02
相对定量分析
03
定性分析
病原体定量检测 转基因检测
mRNA表达分析 miRNA表达分析 lncRNA表达分析 CNV差异分析 蛋白表达分析
SNP检测 病原体检测 生物品种鉴定
绝对定量分析
绝对定量分析主要用于进行病原体定量检测(如乙肝类、肠道类、呼吸道 类病原微生物)、转基因植物中转基因成分的定量检测。
二者各有优缺点 ，在不同的研究 目的中被应用 。
两种荧光定量PCR方法比较
定量PCR与普通PCR比较
与常规 PCR相比，荧光定量 PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量 准确、速度快、自动化程度高、全封闭无污染性等特点。
阈值与C(t)值
• C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数；
• 阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定 在扩增曲线指数增长期；
定量原理
Ct值与初始模板浓度的对数值 成线性关系：初始模板量越多， Ct值越小。 根据样品扩增达到阈值的循环 数（Ct值）就可分析样品中起 始模板量。
specific product
单一特异峰值 Real-TimePCR扩 增特异目标检测位 置，定量准确。
Non-specific product
specific product
出现杂峰 Real-TimePCR扩 增出现非特异扩增 产物，定量不准确。
定性分析—SNP检测
定性分析-SNP检测用于检测已知单核苷酸突变 DNA多态性，包括单碱基的 转换、插入及缺失。
荧光定量
20160617程节薇
什么是荧光定量(转)
1、什么是定量？以参照物为标准，对终产物进行分析或对过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量。
定量的可行性定量一般是在扩增的指数期进行的。
2、定量定量的理论依据是什么？特定的待扩增基因片段起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，最终扩增片段的含量通常是一样的。
理想的扩增结果：×2n 其中Y代表扩增产物量，X代表反应体中的原始模板数n为扩增次数；理论上扩增效率为100%，产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2的倍增长；实际应为：X(1)n ，其中E 代表扩增效率：E = 参与复制的模板/总模板，通常E≤1，E在整个扩增过程中不是固定不变的。
通常X 在1～105拷贝、循环次数n≤30时，E 相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数n的增加（>30次），E值逐渐减少，Y 呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。
3、荧光定量定量的理论模式又是什么？是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，任何干扰指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，使得扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。
近年来研究人员通过大量的实践，研究了相对准确的定量方法，即荧光定量。
扩增通式：①0（1）n②1（1）n 注：[0其中E表示扩增效率，n为循环数，表示在n个周期后产物的数量，1表示在1个周期后产物的数量，T0为原始模板数量。
设定到达指数扩增期时，产生一定的荧光(荧光依赖于某一循环扩增产物的总量，即特定的拷贝数K，为常数，大约在1010左右)高于背景为仪器所识别，此时的循环数为（）,也就是T0（1），取对数即：T0*(1)1(1)* T0 (1)由于对一特定的而言，E与K均为常数，故上式为循环数（）对原始模板拷贝数的对数（T0）一次方程，其标准形式,该直线的斜率为- 1(1)，在横坐标上的截距为(1)，也是荧光定量所谓的标准曲线。
荧光定量pcr 实验报告
荧光定量pcr 实验报告荧光定量PCR 实验报告引言：荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种非常重要的分子生物学技术，它能够在短时间内扩增特定DNA片段，并通过荧光信号实时监测扩增过程。
本实验旨在利用荧光定量PCR技术，检测目标基因在不同组织中的表达水平。
材料与方法：1. 提取RNA：从待测组织中提取总RNA，采用RNA提取试剂盒按照说明书操作，获得高质量的RNA样品。
2. RNA逆转录：使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，反应条件为37℃反应30分钟，然后95℃反应5分钟，最后冷却至4℃。
3. 荧光定量PCR反应体系准备：将PCR反应体系按照说明书中的推荐比例配制，包括模板cDNA、引物、荧光探针和PCR Master Mix。
4. 荧光定量PCR反应条件设置：根据引物和荧光探针的特性，设置PCR反应条件，包括初始变性、循环扩增和荧光信号检测等步骤。
5. 荧光定量PCR实验操作：将反应体系加入PCR管或板中，放入荧光定量PCR 仪中，进行扩增和信号检测。
记录荧光信号变化曲线。
结果与讨论：通过荧光定量PCR实验，我们成功检测到目标基因在不同组织中的表达水平。
在实验中，我们选择了心脏、肝脏和肺脏作为待测组织，以GAPDH作为内参基因。
在荧光定量PCR实验中，我们观察到了荧光信号的实时变化曲线，通过计算Ct值（Cycle threshold），可以获得目标基因的相对表达量。
实验结果显示，在心脏组织中，目标基因的表达量较高，Ct值较低；而在肝脏和肺脏组织中，目标基因的表达量较低，Ct值较高。
这与我们的预期相符，心脏是目标基因的主要表达器官，而肝脏和肺脏则是次要表达器官。
这些结果为我们进一步研究目标基因的功能和调控机制提供了重要线索。
荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优点，能够快速、准确地检测目标基因的表达水平。
通过该技术，我们可以对基因的表达调控机制进行深入研究，为疾病的诊断和治疗提供重要依据。
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1、什么是定量PCR？以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。
定量PCR的可行性定量一般是在PCR 扩增的指数期进行的。
2、定量PCR定量的理论依据是什么？特定的待扩增基因片段起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，最终扩增片段的含量通常是一样的。
理想的扩增结果：Y=X×2n 其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体中的原始模板数n为扩增次数；理论上PCR扩增效率为100%，PCR产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2的倍增长；实际应为：Y= X(1+E)n ，其中E 代表扩增效率：E = 参与复制的模板/总模板，通常E≤1，E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。
通常X 在1～105拷贝、循环次数n≤30时，E 相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数n的增加（>30次），E值逐渐减少，Y 呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。
3、荧光定量PCR定量的理论模式又是什么？PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。
近年来研究人员通过大量的实践，研究了相对准确的定量PCR方法，即荧光定量PCR。
PCR扩增通式：①Tn=T0（1+E）n②Tn=Tn-1（1+E）n 注：[0其中E表示扩增效率，n为循环数，Tn表示在n个周期后PCR产物的数量，Tn-1表示在n-1个周期后PCR产物的数量，T0为原始模板数量。
设定PCR到达指数扩增期时，产生一定的荧光(荧光依赖于某一循环扩增产物的总量，即特定的拷贝数K，为常数，大约在1010左右)高于背景为仪器所识别，此时的循环数为CP（crossing point）,也就是K= T0（1+E）CP，取对数即：lg K=lg T0+CP*lg(1+E)CP=- 1/lg(1+E)*lg T0 +lgk/lg(1+E)由于对一特定的PCR而言，E与K均为常数，故上式为循环数（CP）对原始模板拷贝数的对数（lg T0）一次方程，其标准形式y=kx+b,该直线的斜率为-1/lg(1+E)，在横坐标上的截距为lgk/lg(1+E)，也是荧光定量PCR所谓的标准曲线。
例如下图为单管实时荧光定量RT-PCR的标准曲线：目前荧光定量PCR均采用外标定量外标法定量PCR扩增效率的计算，由于标准曲线的斜率(Slope)为- 1/lg(1+E)，可知E=10-1/Slope-1 ,如从标准曲线中知道Slope=-3.337,则可推知扩增效率E=101/3。
337-1=0.99,也有作者将(1+E)直接视为扩增效率E，则E=10-1/Slope，求得的E值均在1—2之间，有时也有大于2的结果，如下图所示。
另外也可直接根据系列稀释外标在该次实时荧光PCR的结果来大略分析扩增效率的高低，例如系列10倍稀释外标在PCR扩增时有N2=N0En2, N3=(10*N0)En3,在扩增到指数期时荧光值相同则代表此点的终末拷贝数相同，即N2=N3，En2-n3=10,取对数得到⊿ngE=1, E=101/⊿n，E=2，⊿n=3.32; E=1.8，⊿n=3.91.反之亦然。
根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类以及最后检测的信号的不同可分为四种类型：①直接定量检测法，②同位素标记定量，③酶标记定量检测法，④荧光定量PCR技术荧光定量PCR 主要原理发射波长与受体荧光染料光染料吸收供体荧光传递的能量而激发出另一波长的荧光，同时将供体荧光淬灭。
SYBR Green I 检测模式SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光大增强。
因此，SYBR Green I的检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
PCR扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法，40个循环。
SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本所以在临床上使用可能会有假阳性发生。
SYBR Green I的优点：SYBR Green I的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。
5、为什么要用荧光定量PCR技术进行定量？它与传统的定量PCR有什么不同？如前所述的，传统的定量PCR有很多，主要是倍比稀释法、内参照法、竞争法、PCR-ELISA法，但这些定量PCR技术的难点主要在于：（1）如何确定PCR正处于线性扩增范围内（只有在此范围内PCR产物信号才与初始模板的拷贝数成比例）。
（2）一旦线性扩增范围确定以后，如何找到一个合适的方法检测结果。
为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整；有的研究者加一个竞争性模板，有的做限制性的稀释梯度分析，或者加一个PCR模拟（mimic）反应，即用相似的引物与目标产物共扩增，而扩增产物的检测通常在跑胶以后通过染料、放射活性或者探针进行检测。
（3）大多数是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。
同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（如下图所示），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量；虽然加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。
但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法，所以传统定量PCR的缺点是：劳动强度大、定量不准确、重复性差。
而荧光定量PCR有如下显著的优点：1、特异性好，使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。
同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。
2、灵敏度高，荧光PCR 检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。
3、线性关系好、线性范围宽，由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系，通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量；定量范围可在0－1010拷贝/毫升。
4、操作简单、安全、自动化程度高、防污染。
扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，不再需要担心放射性污染。
5、速度快、高通量，可在2－3小时完成96个样品的定量分析。
6、荧光定量PCR为什么使用外标定量，而不是内标定量？A、内标对实时荧光定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。
但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。
也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
B、荧光定量PCR无需内标定量实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。
实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：（1）Ct值的高度重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
（2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。
7、为什么要用定量PCR而不是定性PCR？在实验生物学及临床医学的一些场合，由单纯PCR所提供的阳性或阴性结果还远远不够，在阐述许多问题的本质时，基因及其表达的定量起着至关重要的作用。
定量PCR常用来研究发病机制、估计病毒的负荷量、监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等。
通过对靶基因量的检测，将其与疾病的临床表现、临床分型以及各种标志酶的值联系起来，为疾病的诊断和药物疗效监测提供科学的依据。
与非定量PCR分析方法不同，定量PCR分析的操作程序有助于评估污染的情况，即测出污染的程度，即使负对照产生了正的信号，只要这些信号比实验样品的低得多，依据这样的结果，至少可以推测出实验中所得出的信号是真实的。
在一定程度上消除了单纯PCR过于敏感、假阳性率高的缺点。
8、如何设计荧光定量PCR实验方案？1)、大量阅读相关的背景资料后，根据自己所要研究的基因名称，在genebank中找到相应的基因序列。
（）2)、用引物设计软件Primer5.0、Oligo6.0或beacon designs3.0进行引物探针的设计；（该软件可在下载）引物设计通常遵守如下原则：A、引物与模板的序列要紧密互补。
B、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。
C、引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
D、引物长度通常在20－25bp,Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%，产物大小在100-250bp之间。
E、引物的3’端避免使用碱基A；引物3’端避免出现3 个以上连续相同的碱基。
F、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
探针设计通常遵守如下原则：A、探针位置尽可能地靠近上游引物。
B、探针长度通常在20－30bp，Tm值在65－70℃，通常比引物高5－10℃，GC 含量在40%－70%。
C、探针的5’端应避免使用碱基G。
D、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。
3）、为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
(www.ncbi.nlm.nih/blast)4）、根据仪器特点和个人的喜好，选择标记的荧光素种类。
如：FAM、Texas red、LC-Red640，LC-Red705等，同时确定荧光定量PCR的方法，选择Taqman或beacon等，可参考前面所述。