荧光定量原理与分析方法
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量PCR（Fluorescent Quantitative PCR，qPCR）是一种用荧光信号量化检测PCR产物的方法，用于定量分析目标DNA或RNA的含量。
荧光定量PCR的基本原理如下：
1.引物设计：设计特异性引物，使其能够特异性地扩增目标DNA或RNA序列。
2.模板DNA或RNA的提取：从样品中提取目标DNA或RNA。
3.cDNA合成：对于RNA样品，需要首先将RNA反转录成cDNA，作为PCR 的模板。
4.Real-time PCR扩增反应：将模板DNA或cDNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，进行实时PCR扩增。
PCR反应体系中还包括核苷酸，聚合酶和缓冲液等。
5.荧光信号检测：随着PCR的进行，荧光探针被解旋成单链，释放出与之配对的荧光染料。
荧光染料产生荧光信号，信号强度与扩增产物的数量成正比。
6.荧光信号检测系统：荧光信号检测系统实时检测PCR反应体系中的荧光信号，并将其转换成数值。
7.标准曲线绘制：通过使用已知浓度的标准品进行一系列稀释，绘制出标准曲线。
标准曲线将荧光信号强度与目标DNA或RNA的初始浓度之间建立了一个标准关系。
8.样品定量：通过对样品的荧光信号强度进行测量，并使用标准曲线进行插值计算，确定样品中目标DNA或RNA的初始浓度。
荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、宽动态范围、低检测限和快速分析等优点，广泛应用于分子生物学和疾病诊断等领域。
荧光定量PCR原理及实验步骤
荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。
计算好所有引物和SYBgreen
的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。
上机。
荧光定量法
荧光定量法一、引言在生物医学研究中，荧光定量法是一种常用的实验技术，用于测量样品中特定物质的浓度。
荧光定量法基于荧光现象，通过测量样品发出的荧光强度来确定目标物质的含量。
本文将详细介绍荧光定量法的原理、应用以及优缺点。
二、原理荧光定量法基于荧光现象，即当物质受到激发光照射后，能够吸收光能并发出辐射光。
荧光现象是由于物质的电子在激发态和基态之间跃迁所导致的。
在荧光定量法中，使用荧光染料或荧光标记的抗体等荧光探针与目标物质结合后，通过测量荧光强度来确定目标物质的浓度。
荧光定量法的基本原理如下： 1. 激发：使用特定波长的激发光照射样品，使样品中的荧光探针被激发到激发态。
2. 荧光发射：被激发的荧光探针从激发态跃迁回基态时，会发出荧光。
荧光的波长和强度与样品中目标物质的浓度相关。
3. 检测：使用荧光仪测量样品发出的荧光强度，并将其与标准曲线进行比较，从而确定目标物质的浓度。
三、应用荧光定量法在生物医学研究中有广泛的应用，以下是一些常见的应用领域：1. 生物分析荧光定量法可用于测量生物样品中的蛋白质、核酸、细胞等目标物质的浓度。
例如，可以使用荧光探针标记的抗体来定量检测特定蛋白质在细胞中的表达水平，或者使用荧光探针检测核酸序列的浓度。
2. 药物研发荧光定量法在药物研发中起着重要的作用。
通过荧光定量法可以测量药物在体内的药物浓度，评估药物的代谢和排泄情况，从而优化药物剂量和给药方案。
3. 环境监测荧光定量法可用于环境监测中，例如测量水样中的污染物浓度。
通过使用荧光探针与目标污染物结合，可以快速、准确地测量水样中的污染物含量，为环境保护提供重要参考。
4. 食品安全荧光定量法在食品安全领域也有应用。
例如，可以使用荧光探针检测食品中的有害物质，如重金属、农药残留等。
荧光定量法具有高灵敏度和高选择性，能够有效地检测食品中的微量有害物质。
四、优缺点荧光定量法作为一种常用的实验技术，具有以下优点： - 高灵敏度：荧光探针的荧光强度可以非常敏感地反映目标物质的浓度变化。
实时荧光定量PCR原理与分析方法
实时荧光定量PCR原理与分析方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种基于PCR技术的DNA定量方法，可以在实时反应过程中实时监测PCR产物的累积情况。
与传统的终点PCR相比，qPCR具有更高的灵敏度和准确性，可以定量检测非常低浓度的目标DNA。
实时荧光定量PCR的原理是利用荧光染料与PCR产物结合发出荧光信号，通过监测荧光信号的强度来测定PCR产物的数量。
qPCR有两种常用的检测方法：SYBR Green I染料法和探针法（如TaqMan探针法）。
SYBR Green I染料法是一种简单而常用的qPCR检测方法。
SYBR Green I是一种DNA结合荧光染料，在PCR反应过程中会与PCR产物的DNA结合，从而产生荧光信号。
这种方法的优点是简便、经济，但缺点是非特异性，可能产生假阳性结果。
探针法是一种更为特异和准确的定量PCR方法。
在这种方法中，需要设计一对特异性引物和一个包含荧光探针的引物。
在PCR反应过程中，引物与目标DNA特异性结合，探针结合在引物的靶区上，当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq聚合酶会切割探针上的荧光标记，导致断裂，这样就分离出信号的发射荧光信号。
探针法具有高特异性和准确性，能够避免假阳性结果。
无论是SYBR Green I染料法还是探针法，实时荧光定量PCR的分析方法都是通过构建标准曲线并计算目标DNA的模板数量来定量分析样品中的目标物质。
首先，需要用已知浓度的目标DNA制备标准品，根据不同浓度标准品的CT值（荧光信号阈值）绘制标准曲线。
然后，将样品DNA与引物一起进行PCR扩增反应，监测荧光信号强度并记录CT值。
利用标准曲线可以计算出样品中目标物质的浓度。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。
PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。
在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。
2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。
荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。
因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。
二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。
较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。
3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。
在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。
CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。
4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。
荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。
荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。
5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。
通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。
此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。
荧光定量法
荧光定量法是一种常用的实验技术，用于测量和定量分析样品中的特定荧光信号。
这种方法基于荧光分子的性质，通过激发样品中的荧光分子，并测量它们产生的荧光信号的强度来得出定量结果。
荧光定量法的基本原理是利用荧光分子的特性。
荧光分子具有吸收光子能量后发出比吸收能量低的荧光能量的特点。
当样品中的荧光分子受到特定波长的激发光照射时，荧光分子会吸收光子能量并跃迁到激发态。
随后，荧光分子会在极短的时间内从激发态返回到基态，并释放出荧光能量。
这个过程是一个自发发光的过程。
荧光定量法的步骤如下：1.激发光源：选择合适波长的激发光源，可以是可见光或紫外光。
根据需要，可以选择不同的波长来激发不同的荧光分子。
2.样品制备：将待测样品制备成适合荧光测量的形式。
这可能涉及到样品的稀释、提取或染色等处理。
3.荧光测量：将样品放置在荧光测量仪器中，通过激发光源照射样品，并收集样品发出的荧光信号。
荧光信号的强度与样品中荧光分子的浓度成正相关。
4.数据分析：使用合适的荧光定量软件或算法处理所得数据，得出目标物质在样品中的浓度。
荧光定量法具有以下优点：1.高灵敏度：荧光分子具有较高的荧光量子产率，荧光定量法能够检测到低浓度的目标物质，通常比其他定量方法更加灵敏。
2.高选择性：通过选择激发光源的波长和使用特定的荧光探针，可以实现对特定目标物质的选择性定量分析。
3.宽线性范围：荧光信号的强度与荧光分子的浓度之间通常具有良好的线性关系，可以实现宽范围内的定量分析。
4.实时监测：荧光定量法通常具有快速的响应速度，可以在实时监测过程中进行定量分析。
荧光定量法在许多领域中得到广泛应用，例如生物学、环境监测、药物发现和医学诊断等。
它可以用于测量蛋白质、核酸、细胞分子和微生物等生物分子的浓度，也可以用于测量环境中的污染物浓度。
由于其高灵敏度、高选择性和实时监测的特点，荧光定量法成为了研究和应用领域中不可或缺的工具。
总之，荧光定量法是一种基于荧光分子特性的定量分析方法。
荧光定量PCR的原理方法及结果分析
荧光定量PCR的原理方法及结果分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的检测DNA或RNA含量的方法，通过测定荧光信号的强度来确定起始模板数量的多少。
其原理主要包括引物的选择、PCR反应的进行、荧光信号的测定以及数据分析等步骤。
首先，荧光定量PCR需要选择适当的引物。
引物的设计要求首先能够特异性地与目标序列结合，这样才能保证只有起始模板被扩增。
引物的长度通常在18-24个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，碱基序列中不能存在太多的重复序列或者分子倒序等结构。
此外，引物的Tm值应该相近，不应过于接近，以免引物发生二次结合。
另外，荧光标记的引物通常采用双探针（dual-labeled probe）和SYBR Green I染料，二者的优缺点各有不同：双探针对应用的目标突变不敏感，但是对于长序列的目标扩增效果较好；SYBR Green I适用于鉴定多个不同基因的扩增，但是对于PCR产物的目标特异性检测较差。
其次，PCR反应的进行是荧光定量PCR的核心步骤。
反应体系通常包括引物、模板DNA、DNA聚合酶、荧光标记剂和反应缓冲液。
PCR反应过程中，首先是变性，将模板DNA的双链分离；然后是退火，使引物与目标序列结合；接着是延伸，DNA聚合酶在适当的温度下进行链延伸。
PCR反应的循环数通常在25-40之间，具体循环数多少需要根据目标序列的长度和浓度来决定。
PCR反应条件的优化要注意引物浓度、PCR温度和时间。
第三，荧光信号的测定是荧光定量PCR中不可或缺的步骤。
通常，荧光信号的测定可以通过荧光实时扩增仪来进行。
在每一个PCR循环过程中，荧光实时扩增仪会记录下PCR反应管中荧光信号的强度。
随着PCR反应的进行，PCR产物的数量也在逐渐增加，荧光信号的强度也会增加。
荧光信号的强度与PCR产物的数量之间存在着一定的线性关系，利用标准曲线可以将荧光信号的强度转化为起始模板的绝对数量。
BIO-RAD荧光定量PCR原理和方法介绍
用高温（通常是94单链DNA模板。
在低温下（通常是50-68℃），合成
DNA引物与模板的互补序列结合。
3
延伸
在模板上合成新的DNA链，达到扩增 DNA的目的。
荧光探针的工作原理
荧光探针是PCR实验中常用的探针，其工作原理是根据荧光分子的不同特性，结合PCR技术进行靶向 检测。
BIO-RAD荧光定量PCR原 理和方法介绍
荧光定量PCR是一种分子生物学技术，具有很高的灵敏度和精确度。了解其 原理和实验步骤，是进行PCR实验的基础知识。
PCR反应的基本原理
PCR反应是通过让DNA的两条链不断地复制来放大目标DNA分子，从而实现检测。其基本步骤包括： 变性、退火、延伸。
1
变性
探针
引物的3'位上附加一个荧 光探针序列，通常有探针 和引物两个组成部分。
靶标
PCR扩增出的目标DNA序 列。
荧光
荧光探针通过结合靶标 DNA，在荧光信号上发生 出峰或猝灭，从而进行定 量检测。
荧光定量PCR的优势
相较于传统PCR技术，荧光定量PCR具有更高的精确度和灵敏度。同时，也有以下几个优点： • 无需进行后续凝胶电泳分离，操作更加简便。 • 定量范围广泛，适用于DNA、RNA的定量、检测、表达分析等。 • 数据分析更加全面、直观，常见的软件分析工具可以支持更多的数据分析方式。
荧光定量PCR的实验步骤
荧光定量PCR的实验步骤一般包括：反应体系的设计、样品DNA/RNA的提取、反应液的配制、反应条 件的优化和实验操作等。
DNA/RNA提取
样品的提取是PCR实验中最关 键也最易出错的环节。使用专 业的标准操作流程，可更好地 保证提取质量和浓度。
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实时荧光定量PCR的分类——SYBR Green I染料法
SYBR Green I SYBR Green 只有和双链 DNA结合后才发荧光； 变性时，DNA双链分开， 无荧光
实时荧光定量PCR的分类——SYBR Green I染料法
热变性 引物退火
延伸反应
实时荧光定量PCR的分类——SYBR Green I染料法
与常规 PCR技术比较： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起 始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时荧光定量PCR原理－－常用名词概念
扩增曲线 荧光阈值 Ct值
实时荧光定量PCR原理－－扩增曲线
荧光基团
Rn（荧光强度）
Log－liner phase
Log－liner phase
荧光定量原理与分析方法
TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD
市场部产品经理 张嵘
内容概要
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的分类 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介 SYBR法实验流程及注意事项
实时荧光定量PCR原理－－定义
实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩 增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进 行定量分析。
实时荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
非理想的PCR反应 Xn＝X0 *（1＋En）n
n：扩增循环数
X0 ：起始模板数量
En：扩增效率
Xn：第n次循环后扩增产物数量
实时荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
在扩增产物达到荧光阈值时
XCt＝X0 *（1＋En）Ct＝M （1）
XCt ：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M
实时荧光定量PCR原理－－ Ct值的重现性
纵 轴 ： 荧 光 信 号 量
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点：
相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性
实时荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
理想的PCR反应 Xn＝X0 * 2n
n：扩增循环数
X0 ：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量
方程式（1）两边同取对数得：
LogM＝LogX0 *（1＋En）Ct
（2）
整理方程式（2）：
LogX0 ＝Log M －Ct Log（1＋En）
实时荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
Sample
Ck 104
Ck 102
LogX0 ＝Log M －Ct Log（1＋En）
模板DNA量越多，荧光达到 域值的循环数越少
非常灵敏 具有价格优势
容易与非特异性双链 DNA结合，产生假阳性。 但可以通过融解曲线的分 析，优化反应条件
对引物特异性要求较高
实时荧光定量PCR的分类－－TaqMan法
每扩增一条DNA分子释放 一个荧光信号，可以在 循环过程中任一点检测 荧光
实时荧光定量PCR的分类－－TaqMan法 水解型杂交探针
实时荧光定量PCR的分类－－分子信标
环
茎
荧光素 淬灭剂
标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成
实时荧光定量PCR的分类－－分子信标
FRET
实时荧光定量PCR的分类－－分子信标
优点
高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低
缺点
只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高
荧光检测元件
Baseline
Cycle（循环数）
实时荧光定量PCR原理－－荧光域值
前15个循环信号作为荧光本 底信号（baseline）
荧光域值的缺省设置是3～ 15个循环的荧光信号的标准 偏差的10倍
手动设置：大于荧光背景值 和阴性对照的荧光最高值； 进入指数期的最初阶段
真正的信号：荧光信号超过 域值
绝对定量分析方法简介－－标准品的制备
绝对定量分析方法简介－－标准品的制备
倍比梯度稀释方法：
1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v
拷贝数的计算
Rn（荧光强度）
Log－liner phase
Log－liner phase
Threshold
Baseline
Cycle（循环数）
实时荧光定量PCR原理－－Ct值
Rn（荧光强度）
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩 增产物的荧光信号达到 设定的阈值时所经过的 扩增循环次数
C(t) value Cycle（循环数）
内容概要
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的分类 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介 SYBR法实验流程及注意事项
常用荧光标记方法
非特异性荧光标记 ¾ SYBR Green I
特异性荧光标记 ¾ TaqMan Probe ¾ Molecular Beacon Probe
相对定量分析方法简介－－内参照
¾ GAPDH ¾ Beta-actin ¾ beta-2-microglobulin (B2M) ¾ ribosomal protein L13a (RPL13A) ¾ PPIA (Cyclophilin) ¾ ubiquitin C (UBC) ¾ eukaryotic translation initiation factors 4A (eIF4A) ¾ 18S rRNA ¾ ……
设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数
绝对定量分析方法简介－－实验例
绝对定量举例：HBV病毒检测 以Taqman探针进行
Sample: HBV阳性标准品，分别含有5×103、5×104、5×105、5×106 copies /ml
实验数据：
copies/ml Ct1 Ct2 Mean Ct STD 5×103 28.18 28.64 28.41 0.16 5×104 25.25 25.14 25.19 0.04 5×105 22.11 22.46 22.28 0.12 5×106 18.63 18.92 18.77 0.10 BLANK None None
Cycle number
Log浓度与循环数呈线性关系
Log of DNA concentration
实时荧光定量PCR技术的应用
定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等
绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量， GMO定量检测等
相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因 芯片结果验证，差异显示结果验证等
待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014
绝对定量分析方法简介－－实验例
乙肝病人血液中HBV的绝对定量
目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据 方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测 试剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe） 目录号（FP203） 设置对照：浓度为106、105 、104 、 103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照 实验步骤：提取HBV DNA
绝对定量分析方法简介－－实验例
标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线
y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988
30
25
20
15 5×103
5×104
5×105
Copies
5×106
扩增效率（E）计算 E=10-1/斜率 =10-1/-3.17 =2.03 E%=(2.03-1) ×100% =103%
只适合特定目标 传疾病的诊断
Molecular Beacon法
(分子信标)
高特异性 荧光背景低
价格高 设计困难 只适合特定目标
特定基因分析 SNP分析
内容概要
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的分类 绝பைடு நூலகம்定量分析方法简介 相对定量分析方法简介 SYBR法实验流程及注意事项
绝对定量分析方法简介－－绝对定量定义
不足点： SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。
关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！
实时荧光定量PCR的分类——SYBR Green I染料法
原始图谱
对数图谱
将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT)
¾ 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM
¾ 4、其他与常规PCR相同
实时荧光定量PCR的分类－－TaqMan法
优点
缺点
高特异性 设计相对简单
(与目标序列某一区域互补) 重复性比较好
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准
品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
Sample
25
绝对定量分析方法简介－－绝对定量标准品
未知样品与已知浓度的标准曲线进行比较