荧光定量PCR基础知识
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量PCR（Fluorescent Quantitative PCR，qPCR）是一种用荧光信号量化检测PCR产物的方法，用于定量分析目标DNA或RNA的含量。
荧光定量PCR的基本原理如下：
1.引物设计：设计特异性引物，使其能够特异性地扩增目标DNA或RNA序列。
2.模板DNA或RNA的提取：从样品中提取目标DNA或RNA。
3.cDNA合成：对于RNA样品，需要首先将RNA反转录成cDNA，作为PCR 的模板。
4.Real-time PCR扩增反应：将模板DNA或cDNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，进行实时PCR扩增。
PCR反应体系中还包括核苷酸，聚合酶和缓冲液等。
5.荧光信号检测：随着PCR的进行，荧光探针被解旋成单链，释放出与之配对的荧光染料。
荧光染料产生荧光信号，信号强度与扩增产物的数量成正比。
6.荧光信号检测系统：荧光信号检测系统实时检测PCR反应体系中的荧光信号，并将其转换成数值。
7.标准曲线绘制：通过使用已知浓度的标准品进行一系列稀释，绘制出标准曲线。
标准曲线将荧光信号强度与目标DNA或RNA的初始浓度之间建立了一个标准关系。
8.样品定量：通过对样品的荧光信号强度进行测量，并使用标准曲线进行插值计算，确定样品中目标DNA或RNA的初始浓度。
荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、宽动态范围、低检测限和快速分析等优点，广泛应用于分子生物学和疾病诊断等领域。
荧光定量PCR基础知识
内参-校准生物学误差
• 内参用于校准实验过程对定量结果的影响核酸提取时通常以重量或体积 为单位取样，再加上提取效率和操作误差，造成等量提取物不一定来源 于等量细胞（或基因组）
1. 用DNase酶处理样本 2. 检测no-RT对照（不进
行逆转录的样本）
+RT 和–RT 应该至少 相差6-7 Cts
(大约1% 信号由DNA 产生).
+RT -RT
4 阳性对照-监控系统故障
• 内参(管家基因) – 标准品线性范围 – 灵敏度 – 扩增效率
• 外源阳性内对照 – 来源PCR产物 – 质粒 – 阳性样本
3’端的前4个碱基不能有3个以上的G
避免重复序列：避免序列中4个以上的G或连续6个A
选择C比G多的链当探针
5‘端第一个碱基不能为G，如为FAM，则第二个碱 基 也 不 能 是 G。5" 端染料最好连接在T或C碱基上 。
Primer PCR产物大小建议50-150bp
Tm值:58-60℃ Primer长度： 20bp
RNA降解（小量等份分装）
两步法
• 先将RNA逆转录成cDNAs
• 将cDNAs 1:2 – 1:10 稀释
• 加入反应板中，实时扩增 cDNA，或-20º C储存（稳定保 存数周）
– 优势：cDNA远比RNA稳定， 可以反复冻融多次
– 不足：和一步法相比，需要更 多的加样步骤
预扩增
传统的基因表达分析
• 原始光谱视图（Raw Date ） : 显示PCR反应中荧光信号的软件视图 • 背景组分: 仪器基座的背景“噪音”。
背景噪音影响反应的灵敏度。 背景读数存储于计算机并被反应的荧光信号扣除
纯荧光校正
实时荧光定量PCR介绍课件
实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 21
质粒标准品构建流程
目的基因
PCR
目的基因
目的基因克隆
目的基因
基因组DNA 质粒
质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 22
体外转录RNA标准品构建流程
目的基因
4/5/2024 • 12
RT Primer的选择
• Random Primer • Oligo dT Primer • Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-Primer PCR R-Primer
实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 13
RT Primer的选择
Random
目的片段在mRNA任何位
5’
目的片段
3’ 置都能使用。通常mRNA
F
R
Random
表达量分析最适。
5’
目的片段
AAA··· 3’ 适用于mRNA表达量分析，
F
R
提升反应检测的灵敏度。
1,500 base
OOligligooddTTPPrirmimeer r 目的片段在距Poly(A) Tail
Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同
普通PCR引物 目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚 体要求不严格。
Real Time PCR引物 目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异 性反应和引物二聚体要求严格。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。
PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。
在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。
2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。
荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。
因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。
二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。
较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。
3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。
在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。
CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。
4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。
荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。
荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。
5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。
通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。
此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。
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荧光定量PCR基础原理
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探针完整时，汇报基团发射荧光信号被近距离淬灭基 团吸收；伴随PCR进行，Taq酶在链延伸过程中碰到与 模板结合探针， 其5‘－3’外切酶活性将探针酶切降解 ，使汇报荧光基团和淬灭荧光基团分离，游离于反应 体系中，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。
荧光定量PCR基础原理
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普通PCR技术检测模式
普通PCR仪器扩增， 约2.5小时
琼脂糖凝胶电泳， 约1小时
阴性
无法定量
样品检测结果
阳性
EB染色，约20分钟 紫外成像
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实时荧光定量PCR检测模式
荧光定量PCR仪器扩 增，约2小时
光滑S型指数曲线， 阳性
检测过程有实时监测 数据
Hybprobe探针和水解探针均基于 FRET （荧光共振能 量传递）原理设计。
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TaqMan探针法-水解探针
PCR扩增时在加入一对引物同时加入一个特异性荧光 探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在 两条引物之间。
TaqMan探针为一寡核苷酸，包含两个分子标识，探针 5′端标识有荧光汇报基团(Reporter, R)，如FAM、VIC 等，3′端标识有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如 TAMRA等。
绝对定量
病原载量定量
GMO成份评定
残留DNA测定
相对定量
基因表示差异比较
治疗伎俩效果评定
荧光定量PCR基础原理
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荧光定量PCR基础原理
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荧光定量PCR基础原理
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SYBR Green I荧光染料作用原理
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
荧光定量pcr的原理
荧光定量pcr的原理荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测DNA的技术，它结合了PCR和荧光探针技术，可以快速、高效地定量检测DNA样本。
荧光定量PCR的原理主要包括PCR扩增、荧光信号检测和数据分析三个部分。
首先，PCR扩增是荧光定量PCR的基础。
PCR是一种体外扩增DNA的技术，通过反复的热循环使得DNA序列得以扩增。
在荧光定量PCR中，扩增反应中加入了荧光标记的引物和探针，当PCR反应进行到特定的温度时，探针与目标DNA结合，导致荧光信号的释放。
PCR扩增的循环次数越多，荧光信号累积的越多，从而可以定量检测目标DNA的含量。
其次，荧光信号检测是荧光定量PCR的关键步骤。
在PCR扩增过程中，荧光信号会随着DNA的扩增而不断累积。
荧光信号的检测可以通过实时荧光定量PCR仪器来完成，这些仪器可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号强度，并将其转化为荧光信号曲线。
通过监测荧光信号曲线的变化，可以准确地测定目标DNA的含量。
最后，数据分析是荧光定量PCR的最后一步。
通过实时荧光定量PCR仪器获取的荧光信号曲线，可以通过计算机软件进行数据分析。
软件可以根据标准曲线和样本曲线的荧光信号强度来计算目标DNA的含量，从而实现对目标DNA的定量检测。
总的来说，荧光定量PCR的原理是通过PCR扩增、荧光信号检测和数据分析三个步骤来实现对目标DNA的定量检测。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，被广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变分析等领域。
希望通过本文的介绍，读者能够对荧光定量PCR的原理有一个清晰的了解，并能够在实验中正确应用这一技术。
技术丨一文带你深入解读荧光定量PCR
技术丨一文带你深入了解荧光定量PCR（进阶篇）相信大家都看过小编前面推出的荧光定量PCR实验技术（（新手入门篇）的干货分享吧，那么在进行荧光定量PCR实验时，是否对一些专有名词感到困惑呢？面对状况百出的定量曲线图，分析的时候是否也无从下手呢？今天这篇技术分享，就带你继续深入了解荧光定量PCR中常见概念，以及诸多问题的解读思路。
首先了解荧光定量PCR中有哪些常见的基本概念：➢基线基线是指通常在PCR最初3 至15个循环的信号水平，此阶段扩增产物带来的荧光信号被荧光背景掩盖，因此基线的存在是为了消除扩增早期的荧光背景。
基线一般由仪器自动计算所得，也可以手动设置，当目的基因的表达量较高时，基线的循环数要相应减少。
➢阈值阈值为反应扩增至基线之后即进入指数期时，选择适当位置设定的荧光检出界限，一般定为基线标准偏差的10倍，过低会难以和基线明显区分，过高则会出现循环后期扩增效率降低导致的数据偏差。
➢CT值每个PCR反应管内的荧光信号到达设定荧光阈值时的循环数，CT点位于荧光阈值线与扩增曲线的交点处，由于荧光信号只能与双链DNA结合，因此CT值与起始拷贝数的对数成线性关系，起始模板浓度越高，则CT值越小。
扩增曲线指的是以扩增循环数为横坐标，以荧光强度为纵坐标形成的曲线，扩增曲线分为基线期，对数增长期和平台期➢熔解曲线qPCR扩增结束后，会对扩增产物进行加热，使得双链DNA重新解链，荧光信号下降，而熔解曲线是以温度为横坐标，以荧光信号强度为纵坐标形成的曲线，它直接反映出荧光信号随着温度变化的情况，对荧光信号值求导可以获得熔解曲线的导数曲线，根据该曲线中的峰值可以直观地判断双链DNA的解链情况。
将标准品倍比稀释后，以标准品拷贝数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标生成的标准曲线。
一般拷贝数的对数与Ct值成线性关系。
接着将待测样本的Ct值代入标准曲线公式即可计算出样品初始拷贝数。
完美的扩增曲线呈现S型走势，平台期、基线期平直，指数期呈线性，拐点清晰，但在实际操作过程中，通常会遇到各种异常的曲线图，那么不同的扩增曲线及熔解曲线分别代表着什么呢？➢扩增曲线异常1、扩增曲线不平滑这种情况如果排除仪器信号接收或者检测孔异常的问题，那就需要考虑模板浓度不足，导致信号太弱接收不稳定，可以尝试提高模板浓度重新进行qPCR实验。
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不同滤光片对应的发光集团
• 滤光片 • A • 7000和7300荧光定量PCR系统 • SYBR®Green I, FAM™ dyes • VIC®, JOE™ dyes • NED™, TAMRA™, • 7500荧光定量PCR系统 • SYBR®Green I, FAM™ dyes • VIC®, JOE™ dyes • NED™, TAMRA™ dyes CY3™ dyes • ROX™, Texas Red® dyes • CY5™ dye
定量PCR体系
• 普通的PCR体系 • 模板,引物,dNTPs, buffer,Taq酶 • 加入各种类型的荧光染料
定量PCR原理
• 与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行 • 理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍
• 每个循环结束后,定量PCR仪器通过不同的滤光片记录荧光信号
• 在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强
MGB探针
R：荧光报告基团 NFQ：非荧光淬灭基团 MGB：小沟结合物（增加探针Tm值）
MGB探针的优势
• 提高信噪比
没有背景荧光 更高的淬灭效率
• 提高Tm值
15 mer 提高18℃ 探针更短只要13-19个碱基
• 更多一重PCR（淬灭基团不占通道）
• 需要与模板序列完全匹配才可以结合（适合检测SNP） • 兼并、探针量高的情况也可结合
线性图谱
半对数图谱
CT值由阈值确定
Threshold（阈值）
CT
CT值： C代表Cycle，T代表阈值(threshold)，CT值的含义是：每个反应 管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
数学关系
• Log浓度与Ct呈线性关系，根据样品扩增达到阈值的循环数就可计算出 样品中所含的模板量。
两种方法的比较
Taqபைடு நூலகம்an®
• 优势
−
Sybr® Green I
• 优势
−
更特异 不需要考虑二聚体 可以进行多重反应 不需要优化 拥有已开发的试剂盒
比较便宜
− − − −
• 不足
− − − −
−
特异性差 需要做融解曲线 不能进行多重反应
• 不足
−
需要进行优化
须根据自行设计实验
比较昂贵
报告集团及淬灭基团的选择vic
荧光定量PCR基础
纲 要
定量 PCR 介绍 荧光定量PCR化学原理 仪器的校正 定量 PCR实验要素 数据分析
定量 PCR常见故障排查
常见应用
定量 PCR 介绍
什么是荧光定量PCR
指在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样 品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法。
光学结构简图
典型的PCR四阶段
平台期 线性增长期 指数增长期
基线期
PCR理论方程 N = N0x (1+e)n
N=产物分子数 N0=起始分子数 E=扩增效率 n=循环次数
PCR方程只在指数期成立
荧光PCR信号方程
什么是阈值
• 高于背景荧光强度的值被确定为阈值 • 控制在扩增曲线的指数增长阶段范围之内。阈值线与扩增曲线的交叉 点确定 CT 值。
染料法原理
• SYBR Green I是一种DNA小沟 结合染料
• 游离时不发光
• 与DNA结合时发光
• 每一轮反映结束后收集荧光，检 测体系中双链产物的量。
溶解曲线：derivative view
•反映结束后，温度逐步提升，双链产物在某一温度区域变性为单链，双链结合 染料脱离出来，成为不发荧光的游离态。这一过程检测到的荧光值迅速降低，其 监测值曲线即溶解曲线，不同产物的因其不同Tm值，会产生不同的溶解曲线峰。
定量PCR的优点
1. 敏感度: 可以检测低拷贝的目的基因。典型的单拷贝检测(如果有足 够的 重复运行,泊松分布显示63%有扩增) 2. 高分辨率: 1倍分辨率
3. 动力学范围宽: 约9个数量级.
4. 快: 节省时间和劳力 (不需要跑胶). 5. 安全: 不用EB或放射性物质
荧光定量PCR化学原理
TaqMan探针设计要点
TaqMan Probe Primer 尽可能地靠近上游引物（一般10个以内），最好是 PCR产物大小建议50-150bp 探针的5'端离上游引物的3' 有1个碱基。 GC含量30-80%，避免发卡结构和二聚体 Tm值:68-70℃ Probe长度： 13-25bp (TaqMan MGB Probe) 13-30bp （TaqMan Probe） 终浓度：0.2~0.25uM 3’端的前4个碱基不能有3个以上的G 避免重复序列：避免序列中4个以上的G或连续6个A 选择C比G多的链当探针 5‘端第一个碱基不能为G，如为FAM，则第二个碱基 也不能是G。5' 端染料最好连接在T或C碱基上。 Tm值:58-60℃ Primer长度： 20bp 终浓度：0.2uM~0.5uM 3’端的前5个碱基不能超过2 个C/G
两种化学方法
探针法 染料法
Taqman探针法原理
•完整的探针：5′端荧光基团吸收 能量后将能量转移给临近的3′端 荧光淬灭基团（发生荧光共振能 量转移，FRET）
•退火，探针与模板结合，引物 在聚合酶作用下进行延伸反应， 遇到探针时发挥3′-5′外切酶活性 将探针切碎到反应体系中
•报告基团与淬灭基团距离变大， 在激发光的作用下发荧光
• B • C
• D
• ROX™ dye
• E
仪器的校正
5 仪器的维护和校正
误
差 来 源
定义
• 纯荧光光谱：标准荧光的光谱组分是用于荧光定量分析。ROX, SYBR, FAM，VIC ，这些信息存储于计算机中，在数据分析的时候使用。荧光 基团在PCR反应中与纯荧光比较得到准确的荧光计量。 • 原始光谱视图（Raw Date ）: 显示PCR反应中荧光信号的软件视图 • 背景组分: 仪器基座的背景“噪音”。 背景噪音影响反应的灵敏度。 背景读数存储于计算机并被反应的荧光信号扣除